يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

13.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50017

⸱

فبراير 25, 2013

 , 
1Department of Surgery, Weill Cornell Medical College

في هذه المقالة

ملخص

ويرد طريقة بسيطة لاستخلاص والحفاظ الجذعية الظروف المناسبة وخطوط الخلايا السلف من الفئران البالغة هنا. الأسلوب يستخدم الخلايا المغذية القادمة من المقصورة الخلية الجسدية للخصية الفأر الكبار. هذه التقنية قابلة للتطبيق على سلالات الفئران شيوعا، بما في ذلك المعدلة وراثيا، خارج المغلوب، وتدق في الفئران.

الملخص

تمثل الخلايا الجذعية والسلفية للحيوانات المنوية (SSCs) في الخصية مثالا كلاسيكيا على الخلايا الجذعية للثدييات البالغة وتحافظ على الخصوبة لعمر تقريبا. في حين أن الآليات الدقيقة التي تحكم التجديد الذاتي والتمايز في الجسم الحي تمثل تحديا في الدراسة ، فقد تم تطوير أنظمة مختلفة سابقا لنشر الخلايا الجذعية الجذعية للفئران في المختبر باستخدام مزيج من وسائط الاستزراع المتخصصة والخلايا المغذية1-3.

معظم الغزوات في المختبر في بيولوجيا SSCs قد اشتقت خطوط الخلايا من حديثي الولادة ، ربما بسبب صعوبة الحصول على خطوط الخلاياالبالغة 4. ومع ذلك ، تستمر الخصية في النضج حتى ~ 5 أسابيع من العمر في معظم سلالات الفئران. في فترة ما بعد الولادة المبكرة ، تحدث تغييرات جذرية في بنية الخصية وفي بيولوجيا كل من الخلايا الجسدية المنوية ، بما في ذلك التغيرات في مستويات التعبير عن العديد من الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية. لذلك ، قد لا تلخص خطوط SSC المشتقة من حديثي الولادة بشكل كامل بيولوجيا SSCs البالغة التي تستمر بعد وصول الخصية البالغة إلى حالة مستقرة. < p class = "jove_content"> عدة عوامل أعاقت إنتاج خطوط SSC للبالغين تاريخيا. أولا ، قد تنخفض نسبة الخلايا الجذعية الوظيفية خلال مرحلة البلوغ ، إما بسبب العوامل الجوهرية أو الخارجية5،6. علاوة على ذلك ، كما هو الحال مع الخلايا الجذعية البالغة الأخرى ، كان من الصعب إثراء الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية بشكل كاف من إجمالي خلايا الخصية البالغة دون استخدام مزيج من الانتقاء المناعي أو استراتيجيات الفرزالأخرى 7. تشمل الاستراتيجيات الشائعة استخدام الفئران المشفرة كمصدر للخلايا المانحة بسبب ارتفاع نسبة الخلايا الجذعية إلى أنواع الخلاياالأخرى 8. بناء على الفرضية القائلة بأن إزالة الخلايا الجسدية من الثقافة الأولية تعطل التفاعلات مع مكانة الخلايا الجذعية الضرورية لبقاء SSC ، قمنا سابقا بتطوير طرق لاشتقاق خطوط البالغين التي لا تتطلب الانتقاء المناعي أو المتبرعين ب cryptorchid ولكنها تستخدم التخصيب التسلسلي ل SSCs في الثقافة ، المشار إليها فيما يلي باسم SESC2،3. < p class = "jove_content" > تستلزم الطريقة الموضحة أدناه إجراء بسيطا لاشتقاق خطوط SSC البالغة عن طريق فصل الأنابيب المنوية من المتبرعين البالغين ، متبوعة بطلاء الخلايا على المغذيات المكونة من خط الخلايا اللحمية الخصية (JK1) 3. من خلال المرور التسلسلي ، يتم استنفاد الخلايا غير الجرثومية شديدة الالتصاق والملوثة من المزرعة مع التخصيب المتزامن للخلايا الجذعية الجذعية الجذعية ، تحتوي المزارع المنتجة بهذه الطريقة على خليط من المنوية في مراحل مختلفة من التمايز ، والتي تحتوي على الخلايا الجذعية الجذعية ، بناء على قدرة التجديد الذاتي على المدى الطويل. جوهر طريقة SESC هو أنها تمكن SSCs من إجراء الانتقال الصعب من التجديد الذاتي في الجسم الحي إلى التجديد الذاتي طويل الأجل في المختبر في بيئة مكروية مختلفة جذريا ، وتنتج خطوط SSC طويلة الأجل ، خالية من الخلايا الجسدية الملوثة ، وبالتالي تمكن من التلاعب التجريبي اللاحق ب SSCs.

البروتوكول

1. إعداد وحدة تغذية الخلايا

ملاحظة أنه ينبغي إعداد كل الكواشف هو موضح أدناه في الأزياء العقيمة (انظر الجدولين 1 و 2). هذا البروتوكول يعمل على خط خلية JK1 (خلية Biolabs، وشركة، وأنواع # CBA-315) مغذيات والذي هو مشتق من تحويل خلايا فأر بالغ الجسدية والخصية وقد وصفت في مكان آخر 3. نلاحظ أيضا أن يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية.

  1. يمكن الحفاظ على JK1 الخلايا في الثقافة واستخدمت بنجاح كما مغذيات حتى مرور 39. ثقافة JK1 خلايا في طبق 100 ملم زراعة الخلايا (BD الصقر، وأنواع # 353003) مع 10 مل من فلتر تعقيم المغذية المتوسطة النمو (DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين مصل بقري [FBS]، 2 مم L-الجلوتامين والمضادات الحيوية). تقسيم عندما يصل التقاء الثقافة 95٪، ونسبة الخلايا 1:06 -1:10.
  2. إزالة المتوسطة من متموجة JK1 التغذية أحادية الخليةالطبقة.
  3. يغسل مرة واحدة مع طبقة الخلايا PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
  4. إضافة قبل تحسنت التربسين / EDTA، 1X (0.05٪ trypsin/0.53 ملي EDTA، كورنينج Cellgro، وأنواع # 25-051-CI)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
  5. تعطيل التربسين مع حجم مساو من النمو المتوسطة المغذية. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في النمو المتوسطة المغذية.
  6. قبل معطف زراعة الخلايا متعددة وحات جيدة بما فيه الكفاية عن طريق إضافة محلول الجيلاتين 0.4٪ لتغطية البئر وإزالة بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. ~ 250 لوحة الخلايا في مم 2 في الخلية الجيلاتين المغلفة لوحة الثقافة (تنسيق مثل 48-جيدا أو 6 جيدا). احتضان الثقافة في C ° 37 من 16 إلى 24 ساعة.
  8. إزالة ثقافة المتوسط ​​من الآبار. تنبيه: لتعطيل نمو الخلايا، إضافة إلى حل جديدة من ميتوميسين-C في 10 ميكروغرام / مل مخففة في DMEM إلى كل بئر (مثل 200 ميكرولتر / جيد لوحة 48 أيضا). ميتوميسين-C هي سامة. التعامل معها والتخلص منها بعناية. احتضان في37 ° C لمدة 4 ساعة.
  9. إزالة ميتوميسين-C حل من الخلايا. يغسل 3 مرات مع DMEM قبل الخلايا الجذعية الطلاء.
  10. إزالة الخلايا المغذية DMEM من الآبار وإضافة ما يكفي من الخلايا الجذعية متوسطة (100 ميكرولتر / جيد من 48 لوحة جيدا، وانظر الجدول 3) لمنع الجفاف من خلال الركض مغذيات. إضافة جان معايير الأمان في نفس اليوم، كما هو موضح أدناه في الأقسام 3.1 أو 3.4، استخدام أحجام المشار إليه يحتوي على مغذيات من الآبار.

2. تفكك نسيج الخصية ماوس للحصول على خلايا جرثومة المانحة

  1. الخصيتين الحصاد الماوس الكبار في عالم الأزياء العقيمة والتخزين المؤقت لالخصيتين في طبق بتري المغطاة (بدون أي سائل مضاف). يجب وضع الطبق على الفور على الجليد لمنع أصاب والحفاظ على بقاء الخلية.
  2. باستخدام ملقط معقم وغرامة غرامة مقص في خلية ثقافة هود، وجعل شق عرضي في الغلالة البيضاء الغلالة دون transecting تماما الخصية (أي قطع ½ ~ - ¾ المسافة عبتيough) واستخدام ملقط للضغط على الأنابيب المنوية في زاوية من اللوحة؛ الغلالة تجاهل والأنسجة المرفقة. تبقي لوحة على الجليد في جميع أنحاء الأنسجة للحفاظ على مبرد، مما يحافظ على سلامتها ومنع التبخر.
  3. اللحم المفروم بسرعة الأنابيب مع مقص الربيع غرامة لا تقل عن 3 دقائق في الخصية، مع الحفاظ على لوحة الجليد.
  4. جمع شظايا أنبوب صغير في أنبوب مخروطي 50 مل مل ويغسل في 40 ~ من المصل البقري المبرد PBS / 1٪ الألبومين.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 60 x ج لمدة 10 دقيقة لفصل أجزاء من الحيوانات المنوية أنبوب صغير والحطام. تجاهل طاف.
  6. في أنبوب 15 مل المخروطية، وإعادة تعليق بيليه في 3 مل لكل من الخصية العازلة التفكك قبل تحسنت (DMEM، التربسين 0.05٪، 0.03٪ كولاجيناز نوع I، 80 U / مل من الدناز I و 0.5٪ مصل بقري الزلال، وانظر الجدول (2) لتفاصيل أكثر تحديدا من التفكك العازلة).
  7. وضع أنبوب مخروطي الشكل أفقيا في رفوف في مجموعة شاكر إلى 150 دورة في الدقيقة في C ° 37 لمدة 15 دقيقة لتحقيق أقصى قدر منgitation.
  8. تدور باستمرار في 60 x ج لمدة 10 دقيقة واحدة للخلايا منفصلة عن قطع undissociated.
  9. حفظ أجزاء تحتوي على بيليه حتى الخطوة التالية. جمع طاف من الخطوة 2.8 وإضافة 3 مل DMEM/10٪ مصل بقري جنيني لتحييد التفكك العازلة. وضع أنبوب على الجليد مؤقتا.
  10. كرر الخطوة 2،6 حتي 2،7 مع بيليه حفظ من الخطوة 2.9 إلى إعادة هضم قطع المتبقية بعد الخطوة 2.8.
  11. إضافة حجم مساو من FBS DMEM/10٪ لتحييد التفكك العازلة.
  12. التعليق أعد تجميع من الخطوة 2،11 مع التعليق الخلية حفظ من الخطوة 2.9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 300.
  13. إعادة تعليق بيليه في وسط الخلايا الجذعية في حجم من 16 مل لكل زوج من الخصيتين (انظر الجدول 3).

3. الطلاء من تعليق الخلية الخصية

  1. لوحة 2 مل من تعليق خلية لكل بئر في 6 خلايا لوحة المغذية بشكل جيد تحتوي على ميتوتيكلي] المعطل مع C-ميتوميسين ومكان في خلية حاضنة الثقافة في 37 ودرجة؛ C في 5٪ CO 2.
  2. بعد 48 المتوسطة، والموارد البشرية الرشفة، إضافة 2 مل الطازجة المتوسطة والعودة إلى الحاضنة.
  3. بعد 48 ساعة، إضافة 0.5 مل الخلايا الجذعية متوسطة جديدة إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة.
  4. بعد 48 ساعة، في وقت لاحق تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك على النحو التالي حتى كبيرة، والمستعمرات سرية (> 50 خلية) تظهر (في غضون 7 إلى 21 يوما). ل(الاثنين والأربعاء مثلا) الأولى والثانية تغذية إزالة كل أسبوع ~ 50٪ من المتوسط ​​وإضافة إلى الوراء 50٪ من حجم متوسط ​​الطازجة. للتغذية الثالثة (على سبيل المثال الجمعة)، نضح المتوسطة واستبدال جميع مع متوسط ​​2 مل الطازجة. ويستند هذا النهج على الأساس المنطقي أن تجنب التغييرات المتوسطة كاملة يقلل التقلبات في تركيزات إشارات نظير الصماوي أن تفرز في ثقافة المتوسط ​​9.

4. الإلتقاط المستعمرة لمرور الأول

  1. إزالة المستعمرات المتوسطة من الآبار التي تحتوي على أن passaged وإضافة جديدة المتوسطة الخلايا الجذعية.
  2. تحديد الهدف باستخدام المستعمرات 10X. مع المجهر قليلا دي مركزة، سوف المستعمرات SSC على حافة البئر تظهر كتل متجانسة مشرق، يتألف من العديد من الخلايا قطر 11-12 ميكرومتر، والتي من الصعب أو من المستحيل تمييز حدود الخلايا الفردية، لأن الخلايا تظهر تنصهر معا (الشكل 1A). يجوز لغير SSC المستعمرات تظهر أكثر قتامة وأكثر الحبيبية، أو متجانسة أقل، بحدود ملحوظ (الشكل 1A، أقحم).
  3. باستخدام ماصة تلميح إلي 200 ميكرولتر، مع مجموعة pipetteman إلى 50 ميكرولتر، واتخاذ أولا المتوسطة من البئر وطرد لترطيب الطرف. ثم، دفع بلطف مع طرف مستعمرة قبل الانسحاب بسرعة 50 ميكرولتر من المتوسط ​​لطرد المستعمرة عن طريق الشفط في تلميح (1B الشكل).
  4. طرد المتوسطة التي تحتوي على مستعمرة واحدة من لوحة جيدا 48-المغذية بشكل جيد تحتوي على خلايا المعطل مع 100 ميكرولتر من الخلايا الجذعية متوسطة (الشكل 1C).
  5. كرر الخطوة4.3 و تضيف ما يصل إلى 8 المستعمرات إلى البئر نفسه دون تجاوز 500 ميكرولتر لكل بئر.
  6. كرر الخطوات 4،3 حتي 4،5 لإعداد آبار إضافية من لوحة 48 جيد مع مرور SSC المستعمرات واحد.
  7. وسوف تكون على استعداد لآبار تقسيم في 7-14 أيام أو بعد كتل كبيرة تصل إلى خلايا ظهرت دينا 500 (1D الشكل).

5. لاحقة التوسع والركض من جان معايير الأمان من سحن

  1. وينبغي subcultured الخلايا في إحدى الفقرات على مغذيات جديدة بعد تصل إلى 14 يوما في نسبة انقسام 01:02 لأول 3 مقاطع ومن ثم 1:04 حتي 01:06 (كل 7 أيام) بعد ذلك على النحو التالي. يسحن بلطف المستعمرات من بئر شبه متموجة (على سبيل المثال ~ 300،000 جان معايير الأمان / 6 جيدا جيدا لوحة) مع نصيحة 1 مل ماصة عن طريق الغسيل المتوسطة عبر الخلايا. ويمكن ملاحظة مستعمرات فصل. والكثير من القوة مع تيار من السائل يدفع الخلايا المغذية للخروج من الملعب غير المرغوب فيها أيضا.
  2. جمع الخلايا triturated في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة5 دقائق. ملاحظة: قد يكون خطوة trypsinization أضاف بأمان هنا إذا رغبت من قبل المحقق.
  3. نضح طاف والمتوسطة في الخلية الجذعية الطازجة إعادة تعليق من جانب pipetting بدقة أعلى وأسفل لتعطيل المستعمرات.
  4. جان معايير الأمان على الخلايا المغذية لوحة الطازجة المعطل مع ميتوميسين-C كما هو موضح في القسم 1.
  5. تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع على النحو التالي. للتغذية الأولى والثانية (على سبيل المثال الاثنين والأربعاء) إضافة 50٪ من حجم متوسط ​​الطازجة. للتغذية الثالثة (على سبيل المثال الجمعة)، نضح المتوسطة واستبدال جميع مع متوسط ​​2 مل الطازجة. وسوف تصبح لوحات متموجة في 7-10 أيام. يجب أن تتألف من الثقافات> الخلايا الجرثومية 98٪ (أي <1٪ تلويث الخلايا الجسمية) بعد الممرات 5-7 و يعتمد على المناعية (على سبيل المثال باستخدام الخلايا الجرثومية الفئران علامة GCNA) لتمييز الخلايا الجرثومية من خلايا جسدية 10. ملاحظة: تم تطوير تلك الأساليب في الامتثال للأنظمة والشروط المنصوص عليها من قبل المؤسسةشركة رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام في كلية طب وايل كورنيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ظهور نوع صفر مرور البرية، يظهر الكبار المستعمرات SSC بعد 7 أيام في الشكل 1. وتتكون ثلاثية الأبعاد من المستعمرات طبقة من الخلايا المسطحة التي تعلق على مغذيات أو مصفوفة خارج الخلية تلميذه المودعة من قبل مغذيات مع طبقات متعددة من جان معايير الأمان المتزايد على القمة. في حين جان معايير الأمان الصحي وسهل الانكسار الزاهية وبشكل موحد 11-12 ميكرومتر قطرها، وحدود الخلية من الصعب تمييزها وحجم المستعمرات قد تكون متغيرة بصورة كبيرة، سواء داخل البئر وبين آبار أعدت من الفئران م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا الأسلوب لاشتقاق الكبار جان معايير الأمان باستخدام الخلايا المغذية للخصية الكبار المستمدة قوية ونجحت عندما كانوا يعملون الخلفيات الوراثية الشائعة (مثل FVB، وC57Bl6 129SV/C57Bl/6 مختلطة) وسلالات متحولة مختلفة 2،3،7،14. في الواقع، فإن المكروية التي أنشأتها الثقافة هي نظام كافية للتغلب على بعض الحواجز الوراثية للحفاظ على الكبار جان معايير الأمان في الجسم الحي (على سبيل المثال في حالة plzf - / - الحيوانات) 7. بينما نحن توظيف JK1 ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

MS يتلقى الإتاوات من كلية طب وايل كورنيل من خلال الترخيص لشركة الخليوي، Biolabs لتوزيع JK1 الخلايا.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل إدارة ولاية نيويورك للصحة (C026878). كان لMS الخلايا الجذعية الجديدة يورك مؤسسة، Druckenmiller زميل. بدعم جزئي من البحوث منحة رقم 5 FY11-571 من مارس من الدايمات مؤسسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
DMEM كورنينج 10-013 مخفف لتفارق العازلة
التربسين / EDTA Mediatech 25-051-CI
متوسطة الجذعية قاعدة الخلية (StemPro-34) الحياة تكنولوجيز 10639-011 يتطلب مكملات حسب شينوهارا وآخرون. (2003) *
وقف المكملات المتوسطة الخلية مختلف أنظر الجدول 3 يتطلب مكملات حسب شينوهارا وآخرون. (2003) *
JK1 الخلايا خلية Biolabs، وشركة CBA-315 يمكن أن تكون بديلا مع الخلايا اللحمية الكبار الخصية وآخرون في آل Seandel. (2007)
ميتوميسين-C (تنبيه) سيغما الدريخ M4287 السامة؛ معالجة بعناية.
الجيلاتين سيغما الدريخ G1890 0.4٪ حل في الماء
EVOS XL الرقمية مجهر مقلوب المجموعة المتقدمة المجهر -
الجدول 1. الكواشف والمعدات الخاصة.
* انظر الجدول 3
DMEM كورنينج 10-013 مخفف لتفارق العازلة
التربسين (1:250) الحياة تكنولوجيز 27250-018 التفكك العازلة: نهائي 0.05٪ بالوزن / المجلد
كولاجيناز، اكتب I، 235 U / مل ورثينجتون CLS1 235 التفكك العازلة: نهائي 0.03٪ بالوزن / المجلد
الدناز I Sigmوالدريخ DN25 التفكك العازلة: نهائي 80 U / مل
الأبقار مصل الزلال ICP بيو ABRE-100G التفكك العازلة: 0.5٪ بالوزن النهائي / المجلد
الجدول 2. التفكك العازلة
StemPro-34 SFM الحياة تكنولوجيز 10639-011
StemPro-34 الملحق المغذيات الحياة تكنولوجيز 10639-011
ملاحق إضافية **
غير الأحماض الأمينية الأساسية سيغما الدريخ M7145 1X
MEM فيتامين الحل الحياة تكنولوجيز 11120-052 1X
الجلوتامين L- Mediatech 25-005 2 مم
الأبقار مصل الزلال ICP بيو ABRE 0.50٪
للمضادات الحيوية درجة التأثير الحل Mediatech 30-004-CI 1X
D (+) الجلوكوز سيغما الدريخ G8769 6 ملغ / مل
β-استراديول سيغما الدريخ E2758 30 نانوغرام / مل
البروجسترون Calbiochem 5341 60 نانوغرام / مل
المصل البقري الجنين متغير N / A 1٪
الأبقار هولو-ترانسفيرين سيغما الدريخ T1283 100 ميكروغرام / مل
الأنسولين الجوزاء الحيوية المنتجات 700-112P 25 ميكروغرام / مل
الإنسان GDNF الحياة ميتاليكاذكر PHC7041 10 نانوغرام / مل
الإنسان bFGF الحياة تكنولوجيز PHG0023 10 نانوغرام / مل
الماوس EGF الحياة تكنولوجيز PHG0313 20 نانوغرام / مل
بوتريسين البحث العضوية 0778P 60 ميكرومترا
الصوديوم Selenite سيغما الدريخ S5261 30 نانومتر
حمض البيروفيك الفا Aesar A13875 30 ميكروغرام / مل
DL-حمض اللبنيك JT بيكر 0196-04 1 ميكروغرام / مل
β-المركابتويثانول الحياة تكنولوجيز 21985-023 50 ميكرومتر
حمض الاسكوربيك سيغما الدريخ A4544 100 ميكرومتر
D-البيوتين سيغما الدريخ B4639 10 ميكروغرام / مل
الجدول 3. وقف المتوسطة الخلية
* ملاحظة: إضافة ملاحق أدناه قبل استخدام المتوسط. تصفية تعقيم وابقائه في C. ° 4 وسيلة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أسابيع.
** نحن قد استخدمت شركات مختلفة، تركيبات، و / أو أرقام الكثير من هذه الكواشف دون آثار ضارة أي واضح. بشكل عام، يجب أن تستخدم الكواشف الخلية الصف الثقافة.

المراجع

  1. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
  2. Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
  3. Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).
  4. Ogawa, T., et al. Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines. Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).
  5. Schmidt, J. A., et al. In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).
  6. Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. Aging of male germ line stem cells in mice. Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).
  7. Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1. Cell. 142, 468-479 (2010).
  8. Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).
  9. Csaszar, E., et al. Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).
  10. Enders, G. C., May, J. J. Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female. 163, 331-340 (1994).
  11. Oatley, J. M., Brinster, R. L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).
  12. Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).
  13. Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545(2012).
  14. Arnold, K., et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).
  15. Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية المكونة للنطافإثراء الخلايا الجذعية المكونة للنطافخصية فأر بالغزراعة الخلايا المغذيةالتمرير المتسلسلالتقاط المستعمراتعلامات الخلايا الجرثوميةزراعة الخلايا الجذعية المكونة للنطافالتعطيل بواسطة ميتوميسين Cوسط الخلايا الجذعية
مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.