ويرد طريقة بسيطة لاستخلاص والحفاظ الجذعية الظروف المناسبة وخطوط الخلايا السلف من الفئران البالغة هنا. الأسلوب يستخدم الخلايا المغذية القادمة من المقصورة الخلية الجسدية للخصية الفأر الكبار. هذه التقنية قابلة للتطبيق على سلالات الفئران شيوعا، بما في ذلك المعدلة وراثيا، خارج المغلوب، وتدق في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمثل الخلايا الجذعية والسلفية للحيوانات المنوية (SSCs) في الخصية مثالا كلاسيكيا على الخلايا الجذعية للثدييات البالغة وتحافظ على الخصوبة لعمر تقريبا. في حين أن الآليات الدقيقة التي تحكم التجديد الذاتي والتمايز في الجسم الحي تمثل تحديا في الدراسة ، فقد تم تطوير أنظمة مختلفة سابقا لنشر الخلايا الجذعية الجذعية للفئران في المختبر باستخدام مزيج من وسائط الاستزراع المتخصصة والخلايا المغذية1-3.
معظم الغزوات في المختبر في بيولوجيا SSCs قد اشتقت خطوط الخلايا من حديثي الولادة ، ربما بسبب صعوبة الحصول على خطوط الخلاياالبالغة 4. ومع ذلك ، تستمر الخصية في النضج حتى ~ 5 أسابيع من العمر في معظم سلالات الفئران. في فترة ما بعد الولادة المبكرة ، تحدث تغييرات جذرية في بنية الخصية وفي بيولوجيا كل من الخلايا الجسدية المنوية ، بما في ذلك التغيرات في مستويات التعبير عن العديد من الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية. لذلك ، قد لا تلخص خطوط SSC المشتقة من حديثي الولادة بشكل كامل بيولوجيا SSCs البالغة التي تستمر بعد وصول الخصية البالغة إلى حالة مستقرة. < p class = "jove_content"> عدة عوامل أعاقت إنتاج خطوط SSC للبالغين تاريخيا. أولا ، قد تنخفض نسبة الخلايا الجذعية الوظيفية خلال مرحلة البلوغ ، إما بسبب العوامل الجوهرية أو الخارجية5،6. علاوة على ذلك ، كما هو الحال مع الخلايا الجذعية البالغة الأخرى ، كان من الصعب إثراء الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية بشكل كاف من إجمالي خلايا الخصية البالغة دون استخدام مزيج من الانتقاء المناعي أو استراتيجيات الفرزالأخرى 7. تشمل الاستراتيجيات الشائعة استخدام الفئران المشفرة كمصدر للخلايا المانحة بسبب ارتفاع نسبة الخلايا الجذعية إلى أنواع الخلاياالأخرى 8. بناء على الفرضية القائلة بأن إزالة الخلايا الجسدية من الثقافة الأولية تعطل التفاعلات مع مكانة الخلايا الجذعية الضرورية لبقاء SSC ، قمنا سابقا بتطوير طرق لاشتقاق خطوط البالغين التي لا تتطلب الانتقاء المناعي أو المتبرعين ب cryptorchid ولكنها تستخدم التخصيب التسلسلي ل SSCs في الثقافة ، المشار إليها فيما يلي باسم SESC2،3. < p class = "jove_content" > تستلزم الطريقة الموضحة أدناه إجراء بسيطا لاشتقاق خطوط SSC البالغة عن طريق فصل الأنابيب المنوية من المتبرعين البالغين ، متبوعة بطلاء الخلايا على المغذيات المكونة من خط الخلايا اللحمية الخصية (JK1) 3. من خلال المرور التسلسلي ، يتم استنفاد الخلايا غير الجرثومية شديدة الالتصاق والملوثة من المزرعة مع التخصيب المتزامن للخلايا الجذعية الجذعية الجذعية ، تحتوي المزارع المنتجة بهذه الطريقة على خليط من المنوية في مراحل مختلفة من التمايز ، والتي تحتوي على الخلايا الجذعية الجذعية ، بناء على قدرة التجديد الذاتي على المدى الطويل. جوهر طريقة SESC هو أنها تمكن SSCs من إجراء الانتقال الصعب من التجديد الذاتي في الجسم الحي إلى التجديد الذاتي طويل الأجل في المختبر في بيئة مكروية مختلفة جذريا ، وتنتج خطوط SSC طويلة الأجل ، خالية من الخلايا الجسدية الملوثة ، وبالتالي تمكن من التلاعب التجريبي اللاحق ب SSCs.
البروتوكول
1. إعداد وحدة تغذية الخلايا
ملاحظة أنه ينبغي إعداد كل الكواشف هو موضح أدناه في الأزياء العقيمة (انظر الجدولين 1 و 2). هذا البروتوكول يعمل على خط خلية JK1 (خلية Biolabs، وشركة، وأنواع # CBA-315) مغذيات والذي هو مشتق من تحويل خلايا فأر بالغ الجسدية والخصية وقد وصفت في مكان آخر 3. نلاحظ أيضا أن يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية.
- يمكن الحفاظ على JK1 الخلايا في الثقافة واستخدمت بنجاح ك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ظهور نوع صفر مرور البرية، يظهر الكبار المستعمرات SSC بعد 7 أيام في الشكل 1. وتتكون ثلاثية الأبعاد من المستعمرات طبقة من الخلايا المسطحة التي تعلق على مغذيات أو مصفوفة خارج الخلية تلميذه المودعة من قبل مغذيات مع طبقات متعددة من جان معايير الأمان المتزايد على القمة. في حين جان معايير الأمان الصحي وسهل الانكسار الزاهية وبشكل موحد 11-12 ميكرومتر قطرها، وحدود الخلية من الصعب تمييزها وحجم المستعمرات قد تكون متغيرة بصورة كبيرة، سواء داخل البئر وبين آبار أعدت من الفئران م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا الأسلوب لاشتقاق الكبار جان معايير الأمان باستخدام الخلايا المغذية للخصية الكبار المستمدة قوية ونجحت عندما كانوا يعملون الخلفيات الوراثية الشائعة (مثل FVB، وC57Bl6 129SV/C57Bl/6 مختلطة) وسلالات متحولة مختلفة 2،3،7،14. في الواقع، فإن المكروية التي أنشأتها الثقافة هي نظام كافية للتغلب على بعض الحواجز الوراثية للحفاظ على الكبار جان معايير الأمان في الجسم الحي (على سبيل المثال في حالة plzf - / - الحيوانات) 7. بينما نحن توظيف JK1 ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
MS يتلقى الإتاوات من كلية طب وايل كورنيل من خلال الترخيص لشركة الخليوي، Biolabs لتوزيع JK1 الخلايا.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل إدارة ولاية نيويورك للصحة (C026878). كان لMS الخلايا الجذعية الجديدة يورك مؤسسة، Druckenmiller زميل. بدعم جزئي من البحوث منحة رقم 5 FY11-571 من مارس من الدايمات مؤسسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف / المواد | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| DMEM | كورنينج | 10-013 | مخفف لتفارق العازلة |
| التربسين / EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| متوسطة الجذعية قاعدة الخلية (StemPro-34) | الحياة تكنولوجيز | 10639-011 | يتطلب مكملات حسب شينوهارا وآخرون. (2003) * |
| وقف المكملات المتوسطة الخلية | مختلف | أنظر الجدول 3 | يتطلب مكملات حسب شينوهارا وآخرون. (2003) * |
| JK1 الخلايا | خلية Biolabs، وشركة | CBA-315 | يمكن أن تكون بديلا مع الخلايا اللحمية الكبار الخصية وآخرون في آل Seandel. (2007) |
| ميتوميسين-C (تنبيه) | سيغما الدريخ | M4287 | السامة؛ معالجة بعناية. |
| الجيلاتين | سيغما الدريخ | G1890 | 0.4٪ حل في الماء |
| EVOS XL الرقمية مجهر مقلوب | المجموعة المتقدمة المجهر | - | |
| الجدول 1. الكواشف والمعدات الخاصة. * انظر الجدول 3 | |||
| DMEM | كورنينج | 10-013 | مخفف لتفارق العازلة |
| التربسين (1:250) | الحياة تكنولوجيز | 27250-018 | التفكك العازلة: نهائي 0.05٪ بالوزن / المجلد |
| كولاجيناز، اكتب I، 235 U / مل | ورثينجتون | CLS1 235 | التفكك العازلة: نهائي 0.03٪ بالوزن / المجلد |
| الدناز I | Sigmوالدريخ | DN25 | التفكك العازلة: نهائي 80 U / مل |
| الأبقار مصل الزلال | ICP بيو | ABRE-100G | التفكك العازلة: 0.5٪ بالوزن النهائي / المجلد |
| الجدول 2. التفكك العازلة | |||
| StemPro-34 SFM | الحياة تكنولوجيز | 10639-011 | |
| StemPro-34 الملحق المغذيات | الحياة تكنولوجيز | 10639-011 | |
| ملاحق إضافية ** | |||
| غير الأحماض الأمينية الأساسية | سيغما الدريخ | M7145 | 1X |
| MEM فيتامين الحل | الحياة تكنولوجيز | 11120-052 | 1X |
| الجلوتامين L- | Mediatech | 25-005 | 2 مم |
| الأبقار مصل الزلال | ICP بيو | ABRE | 0.50٪ |
| للمضادات الحيوية درجة التأثير الحل | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D (+) الجلوكوز | سيغما الدريخ | G8769 | 6 ملغ / مل |
| β-استراديول | سيغما الدريخ | E2758 | 30 نانوغرام / مل |
| البروجسترون | Calbiochem | 5341 | 60 نانوغرام / مل |
| المصل البقري الجنين | متغير | N / A | 1٪ |
| الأبقار هولو-ترانسفيرين | سيغما الدريخ | T1283 | 100 ميكروغرام / مل |
| الأنسولين | الجوزاء الحيوية المنتجات | 700-112P | 25 ميكروغرام / مل |
| الإنسان GDNF | الحياة ميتاليكاذكر | PHC7041 | 10 نانوغرام / مل |
| الإنسان bFGF | الحياة تكنولوجيز | PHG0023 | 10 نانوغرام / مل |
| الماوس EGF | الحياة تكنولوجيز | PHG0313 | 20 نانوغرام / مل |
| بوتريسين | البحث العضوية | 0778P | 60 ميكرومترا |
| الصوديوم Selenite | سيغما الدريخ | S5261 | 30 نانومتر |
| حمض البيروفيك | الفا Aesar | A13875 | 30 ميكروغرام / مل |
| DL-حمض اللبنيك | JT بيكر | 0196-04 | 1 ميكروغرام / مل |
| β-المركابتويثانول | الحياة تكنولوجيز | 21985-023 | 50 ميكرومتر |
| حمض الاسكوربيك | سيغما الدريخ | A4544 | 100 ميكرومتر |
| D-البيوتين | سيغما الدريخ | B4639 | 10 ميكروغرام / مل |
| الجدول 3. وقف المتوسطة الخلية | |||
| * ملاحظة: إضافة ملاحق أدناه قبل استخدام المتوسط. تصفية تعقيم وابقائه في C. ° 4 وسيلة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أسابيع. | |||
| ** نحن قد استخدمت شركات مختلفة، تركيبات، و / أو أرقام الكثير من هذه الكواشف دون آثار ضارة أي واضح. بشكل عام، يجب أن تستخدم الكواشف الخلية الصف الثقافة. |
المراجع
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
- Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
