قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

Summary

وهناك تقنية عالية الدقة باستخدام المجهر intavital 2 الفوتون لتصور مباشرة وتحديد الترشيح gloemrular في الكبيبات السطح. هذا الأسلوب يسمح للتقرير مباشرة من خصائص نفاذية الجزيئات في الدول على حد سواء طبيعية والمريضة.

Abstract

أمراض الكلى التي تنطوي على فقدان البول من الجزيئات الأساسية الكبيرة، مثل ألبومين المصل، منذ فترة طويلة يعتقد أن سببها تغييرات في حاجز نفاذية تتألف من podocytes، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والغشاء القاعدي تعمل في انسجام تام. وكشفت بيانات من مختبرنا باستخدام المجهر حيوي داخلي 2 الفوتون أكثر نفاذية كبيبي حاجز الترشيح (GFB) مما كان يعتقد سابقا في ظل ظروف الفسيولوجية، مع استرجاع تصفيتها الزلال التي تحدث في وقت مبكر فرعية من الخلايا تسمى الخلايا نبيب الداني (PTC) ^{1،2، 3.}

التقنيات السابقة تستخدم لدراسة الترشيح الكلوي وإنشاء سمة من حاجز الترشيح تشارك بزل مجهري من تجويف أنبوبي هذه القطاعات في وقت مبكر مع عينة من المحتوى وتحليل السائل ^4. تحدد هذه الدراسات تركيز الألبومين في السائل اللمعية أن تكون شبه معدومة؛ المقابلة عن كثبلماذا يتم الكشف عادة في البول. ومع ذلك، وتوصيف البوليمرات ديكستران مع الأحجام التي تحددها هذه التقنية كشفت تلك ذات حجم مماثل لألبومين المصل لديهم مستويات أعلى في التجويف الأنبوبي والبول؛ مما يوحي زيادة نفاذية ^5.

وهنا هو مخطط تفصيلي للتقنية المستخدمة لتصور مباشرة وقياس نفاذية كبيبي الألبومين الفلورسنت في الجسم الحي. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ألبومين تصفيتها عبر حاجز الترشيح في الفضاء بومان (الغرفة الأولي من الترشيح البولية)، وأيضا يسمح الكمي لاستيعاب الزلال بواسطة الأنابيب القريبة والتخيل من transcytosis الزلال اللاحقة ^6. غياب الفلورسنت الألبومين في وقت لاحق على طول قطاعات أنبوبي في طريقها إلى المثانة يسلط الضوء على كفاءة مسار استرجاع في قطاعات نبيب الداني في وقت سابق. وعلاوة على ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لتحديد نفاذيةمن تم الإبلاغ عن dextrans وجود حجم مماثل لالزلال القيم نفاذية مطابقة تقريبا ^2. هذه الملاحظات دعم مباشرة على الحاجة إلى توسيع تركيز العديد من الأمراض الكلوية بروتيني البيلة إلى التعديلات المدرجة في القريب أنبوب صغير استصلاح الخلية.

Protocol

1. اقتران من مصل الزلال الجرذ إلى سلفو رودامين 101 كلوريد سلفونيل (تكساس الأحمر)

1. حل 100 ملغ من الجرذ مصل الزلال (RSA) في 6.667 مل من 100 ملي بيكربونات الصوديوم 9.0 درجة الحموضة؛ تركيز النهائي 15 ملغ / مل في 50 مل المخروطية أنبوب.
2. مكان الحل في الجليد / الماء كوب وبارد إلى ما بين 0-4 درجة مئوية.
3. إضافة 200 ميكرولتر من جودة عالية الفورماميد ثنائي ميثيل اللامائية (DMF) إلى قارورة ملغ 10 من تكساس الأحمر كلوريد سلفونيل (المركز التايلندي)؛ دوامة عل....

Results

ويبين الشكل 3 مثالا لصورة مأخوذة من الكبيبة سطح ميونيخ يستار الفئران Frömter والخطوات المتخذة لتحديد نفاذية الفلورسنت الزلال. قيمة GSC لالزلال من 0.0111 المشتق من هذا الخريف الكبيبة الفردية ضمن نطاق ينظر في هذه السلالة من ميونخ فئران ويستار عندما تكون في حالة بنك الاحتياطي الفيدرالي ^3. استقرار ينظر في هذه الصور هو نتيجة لتخطيط دقيق وتنفيذ تعليمات مبين في الشكلين 1 و 2. وكما ذكرنا سابقا، موضع شق المستخدمة في exteriorizing الكلى هي الخطوة.......

Discussion

تمثل الخطوات تسليط الضوء هنا ما نشعر به لتكون تلك التي من شأنها أن تنتج قيم نفاذية متسقة ودقيقة لأنها تحايل على المزالق التالية:

1. نثر: إن استخدام fluorophores ينبعث منها الأحمر يسمح لجمع أكثر كفاءة من الضوء منذ الفوتونات الطول الموجي تعد أقل عرضة للمبعثر. وسوف تستخدم إما fluorophores ينبعث منها الأخضر أو الأزرق إدخال قدر أكبر من التباين في وGSC بسبب زيادة التباين في قيم الكثافة من الحلقات ا.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أوليمبوس فلوفيو 1000 مجهر كونفوكال / متعدد الفوتون	أوليمبوس أمريكا		مرشحات للكشفات: أزرق 430/100 ، أخضر 525/50 ، أحمر 605/90
مغلق Ti: الياقوت ماي تاي ليزر	أطياف الفيزياء		أطوال موجية للإثارة قابلة للضبط: ~ 750-1150 نانومتر
أجهزة الكشف الضوئي من فوسفيد زرنيخيد الغاليوم	Hamamatsu Corp		ملاحظة: التكوينات المثبتة في الأمام أو الجانبي متاحة.
برنامج معالجة الصور المتحولة	الديناميكا الجزيئية		ملاحظة: الإصدار 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		إصدار 2007
التعامل مع الملقط	علوم المجهر الإلكتروني	Cat # 78266-04
Mayo مقص تشريح	علوم المجهر الإلكتروني	Cat # 72962
CA مقص مايكرو موديل 1C300	علوم المجهر الإلكتروني	Cat # 78180-1C3
ملقط مرقئ كيلي (مستقيم)	علوم المجهر الإلكتروني	Cat # 72930
بطانية سترة مائية + وسادة تسخين	Gaymar		T / Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm تحت سخان الخزان	ZooMed		RH-4
تكساس الأحمر سلفونيل كلوريد	Invitrogen / المجسات	الجزيئيةCat # T-353
مصل الفئران الألبومين	Sigma Aldrich	Cat # A-6272
عالي الجودة اللامائي DMF	Sigma Aldrich Cat	# 270547
الأوتوكلاف Strate-Line	Fisher Scientific	Cat # 11-889-1
أطباق سفلية غطاء طبق Willco (50 مم / 40 مم غطاء غطاء)	علوم المجهر الإلكتروني	Cat # 70665-07