جمع وعزل والإثراء التي تحدث بصورة طبيعية بكتيريا Magnetotactic من البيئة

Zachery Oestreicher; Steven K. Lower; Wei Lin; Brian H. Lower

doi:10.3791/50123

مقالة منهجية

جمع وعزل والإثراء التي تحدث بصورة طبيعية بكتيريا Magnetotactic من البيئة

23.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50123

⸱

نوفمبر 15, 2012

Zachery Oestreicher¹ , Steven K. Lower¹^,² , Wei Lin³ , Brian H. Lower²

¹School of Earth Sciences, The Ohio State University, ²School of Environment & Natural Resources, The Ohio State University, ³Institute of Geology and Geophysics, Chinese Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

ونحن يبرهن على وجود طريقة لجمع البكتيريا magnetotactic (MTB) التي يمكن تطبيقها على المياه الطبيعية. يمكن أن تكون معزولة وMTB المخصب من عينات الرواسب باستخدام الإعداد بسيطة نسبيا والتي يستفيد من المغناطيسية البكتيريا الطبيعية. ويمكن بعد ذلك أن تدرس معزولة MTB بالتفصيل باستخدام كل من الضوء والمجهر الإلكتروني.

الملخص

البكتيريا Magnetotactic (MTB) هي الكائنات الدقيقة التي تم المائية الأولى المذكورة لا سيما في 1975 ¹ من عينات الرواسب التي تم جمعها في المستنقعات المالحة من ولاية ماساتشوستس (الولايات المتحدة الأمريكية). ومنذ ذلك الحين تم اكتشاف MTB في المياه والرواسب الطبقية الأعمدة من جميع أنحاء العالم ^2. ميزة واحدة مشتركة بين جميع MTB هو أنها تحتوي على magnetosomes، والتي هي داخل الخلايا، البلورات النانوية المغناطيسية غشاء محدد من أكسيد الحديد الأسود (الحديد ₃ O ₄₎ و / أو greigite (الحديد ₃ S ₄₎ أو ³ على حد ^{سواء، 4.} في نصف الكرة الشمالي، وعادة ما تنجذب إلى MTB الطرف الجنوبي من قضيب مغناطيسي، بينما في نصف الكرة الجنوبي عادة ما تنجذب إلى الطرف الشمالي من المغناطيس ^3،5. يمكن استغلال هذه الخاصية عند محاولة عزل MTB من العينات البيئية.

واحدة من الطرق الأكثر شيوعا لتخصيب MTB هو استخدام الحاويات البلاستيكية واضحة لجمع الرواسب والمياه من مصدر طبيعي،مثل بركة المياه العذبة. في نصف الكرة الشمالي، يتم وضع الطرف الجنوبي من قضيب مغناطيسي ضد خارج الحاوية فقط فوق الرواسب في واجهة الرواسب في المياه. بعد بعض الوقت، يمكن إزالة البكتيريا من داخل الحاوية بالقرب من المغناطيس مع ماصة ثم تخصب باستخدام مزيد من مضمار السباق الشعرية المغناطيس ⁶ و أ. المخصب مرة واحدة، يمكن وضعها على البكتيريا على شريحة المجهر باستخدام أسلوب قطرة شنقا والتي لوحظت في ضوء المجهر أو المودعة على شبكة النحاس، ولاحظ باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (TEM).

باستخدام هذا الأسلوب، قد يكون درس معزولة MTB مجهريا لتحديد خصائص السلوك مثل السباحة، ونوع وعدد من سياط مورفولوجيا الخلايا، الخلايا، شكل بلورات مغناطيسية، وعدد من magnetosomes، وعدد من سلاسل magnetosome في كل خلية، وتكوين بلورات nanomineral، وجود فجوات بين الخلايا.

البروتوكول

1. MTB كوكتيل

عند اتخاذ قرار بشأن موقع لجمع المياه العذبة البكتيريا magnetotactic (MTB)، فمن الأفضل أن تبدأ في كثير من الأحيان مع بركة أو تيار بطيئة الحركة لديها طبقة ناعمة الرواسب الطينية. في هذه المظاهرة جمعنا عينة على حافة نهر Olentangy في حرم جامعة ولاية أوهايو (OSU) في كولومبوس، أوهايو (الولايات المتحدة الأمريكية). ورغم أن هذا كان موقع مناسب للتظاهر لدينا، وبروتوكول الموصوفة هنا تنطبق على أي مكان المائية. ويمكن الاطلاع على المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. العثور على الموقع حيث عمق المياه ما بين 10 و 100 سم. في مثل هذا الموقع، يجب ان تجمع طبقة العلوية معظم الرواسب باستخدام واضحة والمسمار قمة الحاوية. حلج القطن الرواسب والمياه في وعاء حتى يتم ملأها ثلث إلى نصف الرواسب المتبقية وحجم بالماء. إبقاء الحاويات الغارقة حتى يتم ملأها بالماء ثم الغطاء بإحكام ث الحاوياتإيث في أعلى غطاء المسمار. انها ليست ضرورية لخلط الرواسب. مسح خارج الحاوية الجافة مع منشفة وثم أخذ عينة إلى مختبر الخاص بك. فإنه ليس من الضروري الاستعجال في عينة المختبر الخاص بك مرة أخرى إلى. لقد تركنا عينات MTB في حاويات بلاستيكية في هذا المجال لعدة أيام قبل إعادتهم إلى مختبرنا. يجب أن تكون قابلة للحياة MTB لعدة أسابيع إلى أشهر ما دمت تخزين العينات في مكان بارد ومظلل في الميدان.
مرة واحدة في العينة في المختبر الخاص، وتخفيف الغطاء وترك الأمر تغطي الحاوية لتقليل كمية التبخر. تخزين الحاويات في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة، درج، أو تغطي كامل الحاوية مع رقائق الألومنيوم. السماح للالرواسب والجسيمات الدقيقة لتسوية تماما إلى أسفل الحاوية من خلال ترك العينة لعدة ساعات دون عائق لعدة أيام. فإنه ليس من الضروري أن يمزج الرواسب، MTB تفضل بيئة دون عائق. الجدران واضحة من وعاء من البلاستيكسوف تسمح لك للتأكد من أن الجزيئات قد استقروا إلى أسفل. اعتمادا على نموذج الخاص بك، يمكن أن يبقى على قيد الحياة MTB في العينة لعدة شهور.

2. MTB عزل

عندما كنت على استعداد لعزل مغناطيس MTB مكان، على جانبي الحاوية البلاستيكية حوالي 1 سم فوق واجهة الرواسب في المياه (الشكل 1A). يجب الحرص على عدم تعكير صفو الرواسب في قاع الإناء. وضع القطب الجنوبي للقضيب مغناطيسي على جانب واحد من الحاويات والجانب الشمالي من المغناطيس شريط آخر على الجانب المقابل (الشكل 1A). يمكن أن تستخدم أي تقريبا المغناطيس، مثل قضيب تحريك مغناطيسي أو كبيرة مغناطيس الثلاجة. ويمكن استخدام أي شيء لدعم مغناطيس في الارتفاع الصحيح فوق واجهة الرواسب في المياه. لقد وجدنا أن يستريح في مغناطيس على الجزء العلوي من الورق المقوى أو البلاستيك مربع هو أفضل، ومع ذلك، يمكن أيضا أن تكون مسجلة المغناطيس إلى خارج الحاوية البلاستيكية. انتظر 30 دقيقة لعدةساعات للبكتيريا على السباحة إلى المغناطيس.
استخدام ماصة معقمة لجمع بعناية المياه من داخل الحاوية (الشكل 1A) بالقرب من موقف قضيب مغناطيسي القطب الجنوبي (على العينات التي تم جمعها في نصف الكرة الشمالي). يجب أن تحتوي على هذه المياه التي تم MTB لجذب المغناطيس شريط القطب الجنوبي. المقبل، يجب استخدام مضمار السباق الشعرية لإثراء MTB.

3. MTB مضمار السباق

من أجل إثراء عينتك مع البكتيريا magnetotactic، مضمار السباق الشعرية ضروري (أرقام 1B و 1C). هذه يجب القيام بها قبل عزل الخلايا من الحاوية البلاستيكية واضحة.
استخدام بوصة 5.75 (146 ملم) والزجاج ماصة باستور لإجراء مضمار السباق. استخدام قلم الماس أو ملف لقطع الجزء العلوي من ماصة، وطول ماصة ليست حاسمة، ولكن يجب أن تكون قادرة على احتواء ما يقرب من 1-2 مل من الماء. بعد ذلك، استخدم ناسخ بنسن لإذابة بحيث تلميحيصبح مختومة (الشكل 1C). ينبغي أن يكون لها ماصة الناتجة نهاية مفتوحة ومغلقة نهاية.
جعل العديد من هذه حلبة والأوتوكلاف ذلك الحين. بالإضافة إلى ذلك، سوف تحتاج إلى الأوتوكلاف القطن والإبر عدة معدنية طويلة.
إضافة تصفية المياه عينة، تم جمعها من الرواسب بالقرب من واجهة الماء هو مبين في الشكل 1A، إلى مضمار السباق تعقيمها باستخدام إبرة معدنية طويلة تعلق على حقنة تصفيتها. يجب أن يكون حجم المسام للمرشح أن يكون 0.22 ملم للقضاء على الحطام والملوثات من المياه. من المهم أن تكون متأكدا تماما من أنه لا توجد فقاعات الهواء في الزجاج الشعرية.
توصيل الجزء السفلي من مضمار السباق مع القطن المعقم (1B الشكل). استخدام إبرة معدنية لدفع القطن في نهاية مختومة من مضمار السباق لذلك هو 0،5 حتي 1 سم بعيدا عن الطرف مختومة (الشكل 1C).
باستخدام ماصة معقمة، إضافة المياه التي تحتوي على MTB (من القسم 2.2) لعينة البحثeservoir (نهاية مفتوحة) لمضمار السباق استعدادا MTB (1B الشكل).

4. MTB التخصيب

مرة واحدة يتم تعبئة السوائل مضمار السباق مع العينة، وضع على جانبها على سطح أفقي (على سبيل المثال، وهو الفوق) ووضع القطب الجنوبي للقضيب مغناطيسي (في نصف الكرة الشمالي) بالقرب من غيض مختومة من مضمار السباق (أرقام 1B و1C).
إنتظر من 5 إلى 30 دقيقة لMTB للهجرة من خلال القطن. ثم يجب عليك جمع السائل بالقرب من غيض من مضمار السباق. يمكن انتظار طويل جدا، أعرض الملوثات، مثل البكتيريا متحركة أخرى، لغيض من شعري. اختياريا، يمكنك استخدام المجهر ضوء لعرض غيض من مضمار السباق ومشاهدة MTB جمع معلومات سرية في مضمار السباق في. وهذا سوف يسمح لك لتحديد كم من الوقت يستغرق لMTB للهجرة من خلال المكونات القطن.
استخدام السكين برفق الماس لجعل الصفر قليلا بالقرب من المكونات القطن والمفاجئة قبالة نهاية مضمار السباق.

5. MTB المراقبة من المجهر الضوئي

وضع قطرة (10-20 ميكرولتر) من العينة MTB المخصب على ساترة.
الوجه بسرعة ساترة أكثر من ذلك الانخفاض يواجه الآن إلى أسفل وتتدلى من ساترة.
وضع ساترة على عصابة س، وهذا هو يستريح على شريحة زجاجية. ينبغي لليا الدائري ويبلغ قطرها أصغر قليلا ثم ساترة (حوالي 1 سم، الشكل 2).
ضع هذا الانخفاض في الصعود إلى منصة الشنق المجهر الخفيفة والتركيز على حافة واحدة من الهبوط. والهدف 60X الجافة يعمل بشكل جيد جدا لأن معظم لديها فتحة عالية العددية (NA، على سبيل المثال، 0.93) ولكن لا تتطلب النفط، والتي من الصعب استخدام للأسلوب قطرة شنقا (الشكل 2).
وضع الطرف الجنوبي من شريط المغناطيس إلى إغلاق د شنقاوسوف تبدأ شرطة عمان السلطانية وMTB إلى الهجرة نحو حافة الهبوط الأقرب إلى المغناطيس (الشكل 3). في غضون بضع دقائق وينبغي أن يكون العديد من MTB على حافة الهبوط (الشكل 3). تثبت لنفسك أن البكتيريا ممغنطة عن طريق عكس قطب المغناطيس ثم مراقبة البكتيريا السباحة في الاتجاه المعاكس.

6. MTB مراقبة من قبل المجهر الإلكتروني بالإرسال (TEM)

وضع قطرة (~ 20 ميكرولتر) من MTB المخصب على شبكة النحاس والسماح للبكتيريا لتسوية لمدة 10 دقيقة.
الفتيل من الماء الزائد مع قطعة من ورق الترشيح نظيفة.
اختياريا، يمكن الشبكة ملطخة سلبا مع خلات اليورانيل 2٪، 2٪ حامضي الفسفوتنغستيك 7.2، أو 2.5٪ الصوديوم موليبديت ^{7 و 8 و 9.} يتم ذلك عن طريق وضع شبكة النحاس على قطرة من وصمة عار على الفور بعد احتضان الشبكة مع MTB المخصب. احتضان الشبكة مع وصمة عار سلبية، فإن بعض الأحيان تختلف تبعا للشارععين المستخدمة، والفتيل ثم قبالة السائل مع قطعة من ورق الترشيح نظيفة.
مراقبة MTB باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (TEM، الشكل 4). لعمل صفها هنا وكثف لMTB استقرت Formvar والكربون المغلفة النحاس شبكة الشبكات 200 (تيد بيلا # 01800). وضعت شبكات مع الجانب الكربون أسفل على قطرة من تعليق الخلية لمدة تصل إلى 10 دقيقة، ثم يغسل مرة واحدة على الفور عن طريق وضع شبكة على قطرة ماء لمدة 30 ثانية. لتلطيخ، وضعت على شبكات قطرة من خلات اليورانيل 2٪ (تيد بيلا # 19481) لمدة 30 ثانية إلى 5 دقائق ثم تجفف وباستخدام تماما قطعة من ورق الترشيح. تم تحليل الشبكات بواسطة TEM باستخدام إما الروح Tecnai الاتحاد الدولي للفروسية في 80kV أو F20 Tecnai FEI باستخدام زاوية الحلقي عالية STEM مجال الظلام في 200kV.