مقالة منهجية

تحديد الجمال النائم الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR

DOI:

10.3791/50156

⸱

فبراير 1, 2013

 , 
1Department of Obstetrics, Gynecology & Women's Health, Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, 2Department of Genetics, Cell Biology & Development, Center for Genome Engineering, University of Minnesota, Minneapolis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف طريقة التعرف السائقين غير معروف من التسرطن باستخدام نهج غير متحيز. أسلوب يستخدم الجمال النائم ينقول بوصفها المغير العشوائية الموجهة إلى أنسجة معينة. رسم الخرائط الجينية من الإدراج ينقول التي تدفع تشكيل الورم يحدد الجينات المسرطنة الرواية والجينات الكابتة للورم

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجينومية وتحليل البروتين، transcriptomic، وepigenomic الأورام الإنسان تشير إلى أن هناك الآلاف من الحالات الشاذة في كل جينوم السرطان مقارنة مطابقة الأنسجة الطبيعية. بناء على هذه التحليلات من الواضح أن هناك العديد من السائقين الجينية غير مكتشفة من السرطان 1. للأسف مخفية ضمن برامج التشغيل هذه عدد أكبر بكثير من الحالات الشاذة الركاب في الخريطة الوراثية البشرية التي لا تساهم مباشرة في تشكيل الورم. وثمة جانب آخر للجينوم السرطان أن هناك عدم تجانس كبير الوراثية ضمن أنواع الأورام مماثلة. يمكن لكل ورم تؤوي الطفرات المختلفة التي توفر ميزة انتقائية لتكوين ورم 2. أداء غير منحازة شاشة الوراثية إلى الأمام في الفئران يوفر الأدوات اللازمة لتوليد أورام وتحليل تركيبتها الجينية، مع الحد من خلفية الطفرات الركاب. ونظام النوم الجمال ينقول (SB) هو أسلوب واحد من هذا القبيل 3. النظام يستخدم المحمول SB الخامسectors (ترانسبوزونات) التي يمكن إدراجها في جميع أنحاء الجينوم من قبل انزيم transposase. وتقتصر الطفرات إلى نوع خلية معينة من خلال استخدام أليل transposase الشرطي الذي يتم تفعيلها من خلال لجنة المساواة العرقية Recombinase. خطوط الماوس وجود العديد من لجنة المساواة العرقية التي Recombinase صريحة في أنسجة معينة. عن طريق عبور واحدة من هذه الخطوط إلى أليل transposase المشروطة (مثل السلمون المدخن للتوقف وكس-SB11)، يتم تنشيط نظام SB فقط في الخلايا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية Recombinase. ستقوم لجنة المساواة العرقية Recombinase المكوس شريط التوقف الذي يمنع التعبير عن أليل transposase، وبالتالي تفعيل الطفرات ينقول في نوع من الخلايا المعينة. يبدأ على شاشة SB عن طريق تربية ثلاث سلالات من الفئران المعدلة وراثيا بحيث تحمل الفئران التجريبية أليل transposase المشروط، وهو concatamer من ترانسبوزونات، وRecombinase لجنة المساواة العرقية أليل الأنسجة محددة. ويسمح لهذه الفئران في العمر حتى شكل أورام وتصبح المحتضرة. الفئران هي ثميتم عزل الحمض النووي الجيني وnecropsied من الأورام. المقبل، وتعرض الحمض النووي الجيني لPCR-رابط بوساطة (LM-PCR) التي تؤدي إلى التضخيم من مواضع الجينومية التي تحتوي على ينقول SB. LM-PCR يقوم على وجود ورم واحد سيؤدي إلى مئات amplicons متميزة تمثل مئات مواضع الجينومية التي تحتوي على الإدراج في 4 ينقول ورم واحد. يتم تحليل الإدراج ينقول في جميع الأورام وتحديد المواقع الإدراج المشترك (كيبك) باستخدام الأساليب الإحصائية المناسبة 5. الجينات داخل رابطة الدول المستقلة من المرجح للغاية أن تكون الجينات المسرطنة أو الجينات الكابتة للورم، وتعتبر جينات السرطان مرشح. مزايا استخدام نظام لتحديد الجينات SB سرطان المرشحة هي: 1) يمكن بسهولة أن يكون موجودا ينقول في الجينوم لأنه من المعروف تسلسل لها، 2) تبديل يمكن أن يوجه إلى نوع تقريبا أي خلية و3) وقادر على ينقول عرض كل مكسب والخسارة من وظيفة الطفرات 6. وfollowiنانوغرام بروتوكول يصف كيفية وضع وتنفيذ شاشة الوراثية إلى الأمام باستخدام نظام ينقول SB لتحديد جينات السرطان مرشح (الشكل 1).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تربية الحيوانات والشيخوخة المعدلة وراثيا

  1. تحديد سلالات من الفئران المعدلة وراثيا المناسبة لتجربتك. وهناك تجربة نموذجية استخدام ثلاثة خطوط المعدلة وراثيا؛ ماوس transposase المشروط، ماوس لإيواء concatamer من ترانسبوزونات والفأر معربا عن لجنة المساواة العرقية في الخلايا Recombinase يعتقد أن خلايا المنشأ للسرطان المطلوب. إذا كان السرطان يجري على غرار لديه طفرة معروفة في نسبة كبيرة من المرضى قد يكون من المستحسن أن تدرج هذه الطفرة في البداية. ومن أمثلة هذه الطفرات "المهيئة" تشمل KRAS تفعيلها، TP53 السلبية السائدة أو....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تم تأسيس نظام التربية، وينبغي أن مربي إنتاج القمامة كل يوم 19-21. سوف تختلف حجم القمامة ما بين 5 و 12 الجراء، وهذا يتوقف على عمر من المربين والخلفية الوراثية. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن التركيب الوراثي من القمامة يلي مندلية الوراثة كوسيلة لتأكيد أن المخطط تربية صحيحة على حد سواء وناجحة.

للتجربة أن تكون ناجحة، يجب أن حدوث الأورام في حيوانات التجارب تكون أكبر بكثير من حدوث الأورام في الحيوانات السيطرة. إذا ل.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شاشة الوراثية إلى الأمام باستخدام نظام النوم ينقول الجمال يوفر طريقة لتحديد الطفرات التي تسبب السرطان. عن طريق اختيار المروج المناسبة لمراقبة لجنة المساواة العرقية Recombinase بالإضافة إلى أي طفرات المهيئة، فإن الشاشة SB تحديد جينات جديدة معروفة وسرطان مرشح.

نجاح على شاشة SB يعتمد إلى حد كبير على الفئران التي اختيرت لإنشاء الشاشة. لينقول، نوصي باستخدام الماوس سلالتين مختلفة تحمل concata.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر براندن Moriarity، Largaespada ديفيد، وكنج فنسنت في جامعة مينيسوتا، ودوبوي آدم في جامعة ولاية ايوا لمساعدتهم في تطوير بروتوكول الموصوفة أعلاه.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
متأكد الختم التعريفي غرفة الدماغ شجرة العلمية EZ-177
Cryovial Bioexpress C-3355-2
التخزين المؤقت الفورمالين 10٪ سيغما الدريتش HT501128-4L
البروتين الأمطار الحل QIAGEN 158910
الخلية تحلل العازلة QIAGEN 158906
بروتين K QIAGEN 158920
ريبونوكلياز A QIAGEN 158924
TE العازلة Promega V6232
BfaI نيو انغلاند Biolabs R0568S
NlaIII نيو انغلاند Biolabs R0125S
MinElute 96 لوحات جيدة QIAGEN 28051
QIAvac متعددة فراغ 96 QIAGEN 19504
صفيحة ميكروسكوبية متعددة الجني، 120V العلمية للصناعات، وشركة SI-4000
T4 يغاز DNA مع العازلة ربط 5X إينفيتروجن 15224-041
BamHI نيو انغلاند Biolabs R0136S
25mM dNTPs Bioexpress C-5014-200
البلاتين طق إينفيتروجن 10966-034
FastStart البلمرة DNA طق روش 12032929001
الاغاروز Promega V3121
TAE عازلة Promega V4271
TE العازلة Promega V6232
إيثيديوم بروميد Promega H5041

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
  2. Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
  3. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H.,....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة