مقالة منهجية

العزلة وتمايز الخلايا إلى خلايا الأوعية الدموية اللحمية بيج / برايت

38.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

مارس 28, 2013

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن تكون متباينة preadipocytes البيضاء الابتدائية معزولة عن الأنسجة الدهنية في الفئران البيضاء إلى خلايا بيج / برايت. قدم هنا هو نظام موثوق لدراسة نموذج الخلوية الجزيئية لتنظيم "براوننج" من الدهون البيضاء.

الملخص

الخلايا الشحمية البني لديها القدرة على فك الارتباط بين سلسلة الجهاز التنفسي في الميتوكوندريا وتبديد الطاقة الكيميائية في شكل حرارة. هو فعل شديدة تطوير UCP1 إيجابية الخلايا الشحمية براون في الأنسجة الدهنية البيضاء (ما يسمى الخلايا البيج أو برايت) من خلال مجموعة متنوعة من العظة البيئية مثل التعرض للبرد المزمن أو منبهات PPARγ، لذلك، وهذا نوع من الخلايا لديها امكانات كهدف العلاجية ل السمنة العلاج. ورغم أن معظم خطوط خلية شحمية خلد لا يمكن تلخيص عملية "إنضاج" من الدهون البيضاء في الثقافة والخلايا الشحمية الأساسية معزولة عن جزء الأوعية الدموية اللحمية في النسيج تحت الجلد الدهنية البيضاء (WAT) توفير نظام موثوق الخلوية لدراسة السيطرة الجزيئية لتطور الخلايا بيج / برايت . نحن هنا وصف بروتوكول للعزلة فعالة من preadipocytes الابتدائية ولإحداث تمايز الخلايا إلى البيج / برايت في الثقافة. ويمكن تقييم تأثير براوننج عن طريق التعبير عن علامة الدهون انتقائية البنيالمتطلبات البيئية مثل UCP1.

المقدمة

السمنة هي زيادة في جميع أنحاء العالم بشكل كبير وتعتبر الآن واحدة من الاهتمامات الأكثر خطورة على الصحة العامة 1. ويرتبط هذا الشرط لmisbalance في استهلاك الطاقة النسبية للإنفاق والنتائج في تخزين الطاقة الزائدة كما الدهون في الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). ويرتبط WAT الموسع مع زيادة كتلة الجسم والوزن، في حين بني الأنسجة الدهنية لديه القدرة على تبديد الطاقة الزائدة لإنتاج الحرارة. بالتالي يمكن BAT يعمل وحماية ضد كل من البرد والسمنة 2،3. ويتحقق ذلك عن طريق uncoupling من نقل الإلكترون في الميتوكوندريا من Uncoupling البروتين 1 (UCP1). ويعتبر هذا البروتين علامة مميزة لتوليد الحرارة بلارعدة في BAT 3. كشفت العديد من الدراسات في السنوات الأخيرة أن يكون البشر البالغين 4-8 و BAT وظيفية، وبالتالي التلاعب BAT في البشر يمكن أن يكون التدخل العلاجي المحتملة في المعركة ضد البدانة والأمراض المرتبطة بها.

jove_content "> الأدلة الحالية تشير إلى أن نوعين من الخلايا الشحمية البنية موجودة في القوارض،" الكلاسيكية "أو" الموجودة من قبل "براون الدهون تطور خلال المرحلة السابقة للولادة وتشكل مستودعات مخصصة الدهنية في منطقة بين الكتفين البني والأنسجة الطرفية الأخرى من ناحية أخرى. ، وهو "محرض" شكل من أشكال الدهون البني (يسمى الخلايا برايت أو البيج) تطور خلال المرحلة ما بعد الولادة ويظهر يتخلل في الأنسجة الدهنية البيضاء. يتم فصل أيضا النوعين من الخلايا الشحمية من أصول بنى التنموية المختلفة. على الرغم من أن القائمة من قبل الخلايا الشحمية البنية تنشأ عن مثل myoblastsic Myf5 السلائف، ومحرض برايت / بيج الخلايا يتخلل في WAT تنشأ من النسب غير Myf5 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، المسارات التنظيمية لهذا النوع من الخلايا ومن المرجح أن يكون مختلفا عن بني Myf5 المشتقة يمكن الخلايا الشحمية 11. تفعيل وتطوير الخلايا بيج (أي "براوننج" من الدهون البيضاء) ردا على التعرض للبرد المزمن وإلىβ3-المستقبلات ناهضات منبهات أو PPARγ في البالغين 12-14. الخلايا بيج / برايت من المحتمل أن تكون هدفا واعدا العلاجية للتلاعب من ميزان الطاقة الإجمالي ويمكن أن تصبح جزءا من المحتمل علاج السمنة، وبالتالي، فإنه من المهم أن نفهم الآليات الجزيئية الدقيقة ومسارات الإشارات التي تتحكم في الإشارات البيئية تطوير البيج الخلايا.

لفهم التحكم الجزيئي للبراوننج من الدهون البيضاء، في التجارب المختبرية هي الأنسب والتفريق بين preadipocytes يحدث بشكل غير متزامن وليس وأنه من الصعب للكشف عن خلايا في 15 الموقع. على الرغم من أن الدراسات على التنمية خلية شحمية وحتى الآن تم تنفيذ خطوط الخلايا في المقام الأول على مثل 3T3-L1، F442A-3T3 أو HIB1، وهذه خطوط الخلايا يبدو تفتقر إلى توقيع الجزيئي للخلايا البيج. من ناحية أخرى، معزولة عن الخلايا الشحمية الأساسية WAT تحت الجلد هي الأكثر احتمالا أن ألخص في بروسسليالي براوننج من الدهون البيضاء في الأزياء حكم ذاتي الخلية. هنا نقدم بروتوكول لعزل الفعال لجزء من انسجة والأوعية الدموية والأنسجة الدهنية لإحداث براوننج من الدهون البيضاء استجابة لمنبهات PPARγ. وقد تبين أن تكون روزيجليتازون وسيطا فعالا خاصة في إنضاج هذه الخلايا. كما اقترح سابقا 16، يمكن استخدام هذا النظام لخدمة الخلوية نظام موثوق الخلوية لدراسة تطوير خلايا بيج / برايت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد متوسطة الهضم

5 مل جعل الفئران بنسبة 5 في الأنسجة (حوالي 1 مل / ج 1 الدهنية الأنسجة).

  1. تزن في أنزيمات الهضم:
    - D Collaginase: 1.5 U / مل (1108874103، 1 غرام، روش، 70334223)
    - Dispase II: 2.4 U / مل (04942078001، 0980 ملغ / ليو، روش، 11466200)
  2. إضافة 25 مل PBS وتخلط جيدا لإذابة
  3. إضافة CaCl 2 قبل فقط لهضم الأنسجة عند تركيز النهائي من 10 ملم

2. تشريح الأنسجة الدهنية من الفئران

  1. يجب أن يتم تنفيذ تشريح بعناية، ومباشرة بعد الفئران (6-8 أسابيع من العمر) وضحى. العمل العقيمة مع الإيثانول يرش على الفراء الماوس قبل فتحه. وضع الأنسجة مباشرة في برنامج تلفزيوني نظيفة، BAT بين الكتفين منفصلة وتحت الجلد WAT الأربية.
  2. لBAT بين الكتفين: يكون وضع الماوس مع الجزء الخلفي حتى تواجه، وقطع مفتوحة على طول الظهر وعلى طول الطريق إلى الرقبة. البنيويمكن الاطلاع على الأنسجة الدهنية تحت الجلد الحق بين الكتفين (بين الكتفين). ويمكن رؤية BAT وفصين، فراشة الشكل. وينبغي لA طبقة رقيقة من الدهون البيضاء التي تغطي BAT يمكن إزالتها بعناية.
  3. لWAT تحت الجلد (الأربية WAT): إزالة الجلد. تم العثور على الأربية WAT مباشرة تحت الجلد على كلا الجانبين، بدءا تقريبا على ظهره ويذهب إلى جانب، داخل الفخذين وأسفل نحو الخصية.

3. قطع وهضم الأنسجة الدهنية

  1. إزالة التلوث بسرعة جميع، مثل العضلات، والشعر والهيكل العظمي والنسيج الضام من أقسام الأنسجة.
  2. يجف بسرعة على الورق الأنسجة لعدم تمييع المتوسطة تشريح مع PBS ووضعه على طبق جاف.
  3. إضافة الهضم المتوسطة (CaCl أضاف 2 قبل الهضم) واللحم المفروم النسيج الى قطع صغيرة. تخلط جيدا جدا من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل. نقل الأنسجة المفروم في 50 مل أنابيب مع بقية م الهضمedium، مزيج أكثر من pipetting صعودا وهبوطا.
  4. خلاصة في 37 ° C مع التحريض المستمر عند 150 دورة في الدقيقة ل 40-50 دقيقة. تأكد من كل 10-15 دقيقة للتأكد من عملية الهضم يسير على ما يرام ومنع الإفراط في الهضم.

ملاحظة: تصحيح المتوسطة الهضم والوقت الهامة. النسيج يحتاج إلى هضم بشكل جيد، ولكن يمكن أن تلحق الضرر الهضم الزائدة الخلايا.

4. تصفية خلية تعليق

  1. وقف الهضم عن طريق إضافة 5 مل المتوسطة كاملة (FPS DMEM/F12 تحتوي على 10٪ وP / S). يجب أن تكون الخلايا تقريبا متجانسة تماما. مزيج جيد من قبل pipetting.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. ويمكن الآن SVF أن ينظر إليه باعتباره بيليه البني على الجزء السفلي من الأنبوب. نضح في طبقة زيتية على رأس خلية شحمية ناضجة وأكثر من طبقة السائل - الحفاظ على بيليه وحلها في المتوسط ​​10 مل كاملة. تخلط جيدا.
  4. وضع مصفاة الخلية (50-70 ميكرون قطر) على مدى 50 جديد مل أنبوب تصفية والتعليق الخلية.

5. لوحة خلايا

  1. نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب الطرد المركزي 15 مل ب 700 وXG لمدة 10 دقيقة.
  2. نضح المتوسطة وبيليه اعادة تعليق في المتوسط ​​10 مل كاملة. ماصة وتخلط جيدا.
  3. تقدير عدد لوحات المطلوبة. قد تختلف هذه ويعتمد على حجم بيليه. والقاعدة العامة هي لوحات 2 من 10 سم الفئران في الفترة من 5 WAT لوحة واحدة والأربية 10 سم لBAT.
  4. الخلايا المغلفة لوحة على أطباق الكولاجين (R & D) في المتوسط ​​كاملة
  5. 1-2 ساعة بعد الطلاء الخلايا والمتوسطة الرشفة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة المتوسطة. هذه الخطوة مهمة لأن ذلك يمكن أن إزالة خلايا الدم الحمراء، وخلايا المناعة وغيرها من الملوثات.

6. التفريق خلايا

  1. جعل وسائل الصيانة والحث.

صيانة المتوسطة

استكمال المتوسطة مع إضافة:

الأنف والحنجرة "> الأنسولين، اضرب النهائي. 5 ميكروغرام / مل (5 ملغ / مل الأوراق المالية، و*** 100 ميكرولتر من حمض الخليك في 10 مل O 2 H لإعداد يحمض حموضة المياه 2.5. الأسهم المتجر حل الأنسولين في الماء المحمض. في -20 ° C)

3،3 '،5-Triiodo-L-ثيرونين (T3)، اضرب النهائي. 1 نانومتر (10 ميكرومتر الأسهم، *** حل هيدروكسيد الصوديوم 1N في T3 وإضافة إلى جعل 10 متوسطة الأسهم ميكرومتر. سيغما القط # T-2877)

المحل في 4 درجات مئوية، وحسن لمدة أسبوع

الحث المتوسطة

صيانة المتوسطة التي تحتوي على مركبات التالية:

اندوميثاسين، اضرب النهائي. 125 ميكرومتر (0.125 M الأسهم في الإيثانول، سيغما القط # I-7378). يجب أن تكون ساخنة الإندوميتاسين إلى 60 درجة مئوية إلى أن تحل.

ديكساميثازون، اضرب النهائي. 2 ميكروغرام / مل (2 ملغ / مل في جورب الإيثانول، سيغما القط # D-1756)
3-الاستيوفينون-1-الميثيل (IBMX)، اضرب النهائي. 0.5 مم (0.25 M الأسهم في DMSO، سيغما القط # I-5879)
روزيجليتازون، اضرب النهائي. 0.5 ميكرومتر(10 ملم في DMSO الأسهم، سيغما القط # R-2408)

ملاحظة: تحقق الحث الطازجة المتوسطة في كل مرة.

  1. تنمو الخلايا الشحمية الأساسية لالتقاء 95-97٪ في المتوسط ​​كاملة (متموجة ولكن ليس معبأة جدا)
  2. تغيير كامل المتوسطة منتظمة مع الحث المتوسطة (يوم 0)
  3. بعد 48 ساعة (يوم 2)، تغيير المتوسطة والمتوسطة الصيانة مع روزيجليتازون (0.5 ميكرومتر)
  4. بعد 48 ساعة إضافية (يوم 4)، تغيير والمتوسطة صيانة جديدة مع روزيجليتازون (1 ميكرومتر) ل2-3 أيام إضافية. 6-7 أيام بعد إضافة وسيلة تحريض، وخلايا متباينة تماما حتى تنضج الخلايا الدهنية وتمتلئ قطرات النفط. سوف تظهر حول قطرات 3-4 أيام بعد التعريفي.

ملاحظة: متوسط ​​تتغير كل 2-3 أيام حتى يتم متباينة تماما الخلايا.

ويمكن الآن أن تحصد الخلايا والتعبير مرنا من Ucp1 وآلات موسيقية أخرىويمكن قياس R البني خلية شحمية محددة من الجينات QRT-PCR. وسوف تستخدم لطخة ويسترن للكشف عن البروتينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن الوصول إلى إنضاج الخلايا الشحمية من الأساسي من خلال قياس التعبير مرنا من Ucp1 وغيرها من البني الجينات الدهون محددة أو انتقائية من قبل QRT-PCR. المقدمة في الشكل 1 هي بيانات التعبير الجيني في الخلايا الشحمية WAT المستمدة الأربية الأولية. وقد حثت الخلايا للتمييز في وجود اثنين من جرعات مختلفة من روزيجليتازون في 50 نانومتر ونانومتر 500، على التوالي. كان يعالج مجموعة فرعية من الخلايا مع forskolin في 10 ميكرومتر لمدة 4 ساعة قبل الحصاد. وهذا لحث-AMP الحلقي (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نقدم نظام موثوق الخلوية لدراسة تطوير خلايا بيج / برايت في الخلايا الشحمية مثقف الأولية في الفئران. بالمقارنة مع العديد من خطوط الخلايا خلد المتاحة، هذا النظام من المرجح أن تقدم أهمية تعزيز للبراوننج من الدهون البيضاء في الجسم الحي.

على الرغم من أن دراسة هذه الخلايا الشحمية الأولية يقدم بعض المزايا، توجد أيضا بعض القيود والمخاوف التي تعتبر مهمة للنظر فيها. أولا، هذا النظام هو يعتمد اعتمادا كبيرا على ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

شكر وتقدير

نشكر Haruya اونو، شينودا Kosaku، وشارب لويس، Tomoda إيمي، ورويز لورين للمناقشة، والمساعدة التقنية والمساعدة التحريرية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DK087853)، من برنامج للبحوث الطبية الحيوية والاختراق من شركة فارم لAsubio SKULA أيده SHARE زمالات الدكتوراه من جامعة كوبنهاغن ومشروع الاتحاد الأوروبي FP7 DIABAT (HEALTH-F2 -2٬011-278٬373) لمادسن ليز وكارستن كريستيانسن. نعترف أيضا مركز DERC منحة (NIH P30 DK063720).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف
Collaginase D روش 11088874103
Dispase II روش 04942078001
CaCl 2
DMEM المتوسطة الصياد 10017-CV مع الجلوكوز ز / لتر 2،5 & L-الجلوتامين دون البيروفات الصوديوم
الأنسولين
T3 (3،3 '،5-Triiodo-L-ثيرونين) سيجما T-2877
اندوميثاسين سيجما I-7378
ديكساميثازون سيجما D-1756
IBMX سيجما I-5879
روزيجليتازون سيجما R-2408
معدات
أطباق الكولاجين مطلية BD 354450 لوحات 10 سم
70 ميكرون فلتر BD الصقر 352350 مصفاة الخلية، و 70 ميكرومتر النايلون 1/ea

المراجع

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

UCP1 Q RT PCR RO Glitazone

مقالات ذات صلة