يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس الكاتيونات النقل من نا، K-H و، K-أتباز في

10.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50201

⸱

فبراير 19, 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content"> نصف طريقة لتحديد نشاط ATPases من النوع P من K + المضاد عن طريق التعبير غير المتجانس للإنزيمات في بويضات Xenopus وقياس امتصاص Rb + أو Li + في الخلايا الفردية عن طريق القياس الطيفي للامتصاص الذري. هذه الطريقة هي بديل حساس وآمن لتجارب تدفق النظائر المشعة التي تسهل الدراسات الحركية المعقدة.

الملخص

< p class = "jove_content" > في حين أن النقل الكاتيوني بواسطة ناقل الغشاء الكهربائي Na + ، K + -ATPase يمكن قياسه عن طريق الفيزيولوجيا الكهربية ، فإن الفحص في المعدة H + ، K + -ATPase الذي يعمل كهربالكهرباء. تستخدم العديد من فحوصات النقل النظائر المشعة لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية ، ومع ذلك ، فإن التدابير الأمنية اللازمة تفرض قيودا صارمة فيما يتعلق بالتعرض البشري أو تصميم المقايسة. علاوة على ذلك ، يتأثر نقل الأيونات عبر أغشية الخلايا بشكل خطير بإمكانات الغشاء ، والتي لا يتم التحكم فيها بشكل مباشر في زراعة الخلايا أو في مستحضرات البروتيوليبوسوم. هنا ، نستفيد من الحساسية المتميزة لقياس الطيف الضوئي للامتصاص الذري (AAS) تجاه الكميات النزرة من العناصر الكيميائية لقياس نقل Rb + أو Li + بواسطة Na + و K +- أو H + و K + -ATPase المعدي في الخلايا المفردة. باستخدام بويضات Xenopus كنظام تعبير ، نحدد كمية Rb + (Li +) المنقولة إلى الخلايا عن طريق قياس عينات من متجانسات البويضة المفردة في جهاز AAS المجهز بفرن رذاذ الجرافيت المسخن بشكل عرضي (THGA) ، والذي يتم تحميله من جهاز أخذ العينات التلقائي. نظرا لأن خلفية امتصاص Rb + غير المحددة في البويضات المتحكمة أو أثناء تطبيق مثبطات ATPase صغيرة جدا ، فمن الممكن تنفيذ مخططات الفحص الحركية المعقدة التي تتضمن عددا كبيرا من الظروف التجريبية في وقت واحد ، أو مقارنة قدرة النقل وحركية الناقلات المتحولة في الموقع بدقة عالية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن امتصاص الكاتيون يتم تحديده على خلايا مفردة ، يمكن إجراء تجارب التدفق بالاشتراك مع لقط الجهد ثنائي القطب (TEVC) لتحقيق تحكم دقيق في إمكانات الغشاء والتيار. سمح هذا على سبيل المثال بتحديد القياس المتكافئ للنقل 3Na + / 2K + من Na + و K + -ATPase وتم تمكينه لأول مرة من التحقيق في اعتماد الجهد لنقل الكاتيون بواسطة المعدة التي تعمل كهروبدون H + ، K + -ATPase. من حيث المبدأ ، لا يقتصر الاختبار على بروتينات الغشاء الناقلة K + ، ولكنه قد يعمل بشكل جيد لمعالجة نشاط ناقلات المعادن الثقيلة أو الانتقالية ، أو امتصاص العناصر الكيميائية عن طريق عمليات الخلايا الداخلية.

المقدمة

أردنا تطوير بديل حساس وآمن وغير مكلف لتجارب التتبع المشع للتحقيق في نشاط النقل المحدد لبروتينات الغشاء التي تنقل الأيونات من أجل التحايل على القيود المتعلقة بالوصول إلى مختبرات النظائر أو متطلبات السلامة أو استخدام النظائر المشعة المكلفة ، والتي - كما في حالة الليثيوم - قد تكون غير متوفرة بسبب أوقات الاضمحلال القصيرة للغاية. كنا مهتمين بشكل خاص بتحديد نشاط المعدة التي تعمل كهروبايد H + ، K + - ATPase ، لأن الإنزيم لا يولد تيارا وبالتالي لا يمكن معالجة نشاطه بالطرق الفيزيولوجية الكهربية. نظرا لأن Na + و K + - و H + و K + - ATPase نقل Rb + بنفس كفاءة K + (و Li + أيضا) ، فإن الحساسية العالية لتقنية AAS للروبيديوم أو الليثيوم يجب أن تيسر الكشف الحساس عن نشاط النقل. مقاييس الطيف الضوئي للامتصاص الذري هي أجهزة تحليلية شائعة ، يتم توزيعها على نطاق واسع في المختبرات الكيميائية ويجب أن تكون في متناول عدد كبير من العلماء المهتمين. علاوة على ذلك ، أردنا الاستفادة من نظام تعبير البويضات Xenopus ، الذي يستخدم خلايا مفردة كبيرة (قطرها حوالي 1.0-1.5 مم) تسمح بتحقيق تباين منخفض بشكل ملحوظ من خلية إلى أخرى فيما يتعلق بمستوى تعبير البروتين ضمن دفعة واحدة. يوضح حساب بسيط جدوى اختبار AAS: حد الكشف (الكتلة المميزة) للروبيديوم باستخدام تقنية THGA-AAS هو 10 بيكوغرام أو 1.2 · 10-13 مول (Rb: 85.47 جم / مول) ، لليثيوم 5.5 بيكوغرام أو 7.9 · 10-13 مول (Li: 6.94 جم / مول). عند التعبير غير المتجانس عن Na + ، K + -ATPase في بويضات Xenopus ، يمكن تحقيق تيارات مضخة تبلغ 100 نانو أمبير (أي ما يعادل حوالي 6.2 · 1011 شحنات أولية في الثانية ، أو 1.03 · 10-12 مول ثانية -1) ، مما يؤدي إلى نقل 6 · 10-6 درجة مئوية من الشحنة في غضون دقيقة واحدة. نظرا لأن نقل شحنة صافية واحدة يتوافق مع امتصاص اثنين من أيونات Rb + (بسبب القياس المتكافئ 3Na + / 2K +) ، فإن تيار 100 nA لمدة دقيقة واحدة يتوافق مع امتصاص 1.2 · 10-10 مول Rb +. وبالتالي ، حتى عند التخفيف بمقدار 1,000 ضعف (تجانس بويضة بحجم حوالي 1 ميكرولتر في 1 مل من الماء) ، تحتوي عينة THGA-AAS النموذجية (20 ميكرولتر) على 2.4 · 10-12 مول Rb + (أو 204 pg) ، وهو أعلى بكثير من عتبة الكشف. لذلك ، حتى الناقلات التي لديها نشاط نقل أقل بأكثر من 100 ضعف أو تعبير غشاء البلازما يمكن فحصها باستخدام هذه التقنية عن طريق ضبط وقت تدفق التجربة بشكل مناسب.

< p class = "jove_content" >نظرا لأن معدل الضخ يعتمد بشكل حساس على درجة الحرارة (طاقات التنشيط النموذجية ل Na + ، K + -ATPase تتراوح من 90 كيلو جول / مول إلى 130 كيلو جول / مول1-3 ، مما يؤدي إلى زيادة بنسبة 30٪ تقريبا في معدل الدوران عند التغيير من 20 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية) ، فمن الضروري إجراء قياسات التدفق تحت تحكم دقيق في درجة الحرارة (تكييف الهواء) مع حلول عازلة متوازنة بشكل جيد. علاوة على ذلك ، يجب اختيار البويضات بعناية فيما يتعلق بالحجم المتجانس للتعبير عن ناقل الأيونات. باستخدام هذه الاحتياطات ، من الممكن تحقيق أخطاء قياسية تجريبية بشكل روتيني أقل من 10 في المائة مع حوالي 10 خلايا لكل حالة تجريبية. باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من تحديد على سبيل المثال التقارب الواضح Rb + لنقل الكاتيون4-6 ، وتأثير الرقم الهيدروجيني خارج وداخل الخلايا7 وتأثير طفرات المخلفات المشاركة في تنسيق الكاتيون أثناء النقل4،8. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية في أنه يمكن أيضا تحديد التدفقات الأيونية بالاشتراك مع لقط جهد البويضات ثنائي القطب ، والذي يضمن من ناحية التحكم الدقيق في إمكانات الغشاء أثناء النقل ومن ناحية أخرى يسمح بربط تدفق الأيونات بتيار الغشاء. وبالتالي ، كان من الممكن التحقق من القياس المتكافئ 3Na + / 2K + ل Na + ، K + -ATPase (انظر النتائج النموذجية أدناه) وتحديد اعتماد الجهد لنقل الكاتيون في المعدة H + / K + -ATPase 7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بناءات cDNA والتعبير البروتيني في بويضات Xenopus

يجب استنساخ cDNA لبروتين الغشاء المستهدف في ناقل مناسب للتعبير في بويضات Xenopus laevis مثل pTLN9 أو pcDNA3.1X10. تحتوي هذه النواقل المُحسَّنة على المناطق غير المترجمة (UTR) 5' و 3' لجين β-globin الخاص بـ Xenopus laevis والتي تحيط بموقع الاستنساخ المتعدد (MCS)، وتسلسل محفز لإنزيم RNA polymerase (في pTLN: SP6، وفي pcDNA3.1X: T7) يقع قبل منطقة 5' UTR، وسلسلة poly-A في الاتجاه 3' من موقع MCS لضمان استقرار cRNA داخل الخلايا، وبالإضافة إلى ذلك، يتوفر في الاتجاه السفلي تسلسل آخر من مواقع إنزيمات القطع التقييدية أحادية القطع لخطية البلازميد ليكون بمثابة قالب لعملية نسخ cRNA in vitro.

للتمييز بين نشاط إنزيم Na+/K+-ATPase البشري مفرط التعبير (الوحدة الفرعية α2+الوحدة الفرعية β1) وإنزيم Na+/K+-ATPase الداخلي للخلايا البيضية، تم إدخال الطفرات Q116R وN127D للحصول على بروتين مقاوم للأواباين بتركيز IC50 في نطاق المليمولار11. وفي حالة H+/K+-ATPase، أُجريت قياسات التدفق باستخدام طفرة S806C في الوحدة الفرعية α لإنزيم H+/K+-ATPase، حيث ارتبطت تدفقات Rb+ بالبيانات الحركية المستمدة من تجارب قياس الفلورية بجهد تثبيت الغشاء (VCF). تعتمد تقنية VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)12 على ربط فلوروفور في موقع محدد ببقايا سيستين تم إدخالها استراتيجياً، والتي تعطي تقريراً عن التغيرات التشكيلية للإنزيم.

2. خطيّة وتنقية قالب الـ DNA

  1. لخطوة خطية قالب DNA، يتم هضم 3 μg من الـ plasmid DNA في حجم تفاعل قدره 50 μl باستخدام 5 μl من منظم pH (buffer) بتركيز 10x مناسب لإنزيم القطع و10 U من إنزيم القطع لمدة 1 hr عند 37 °C.
  2. يتم تنقية الـ DNA الخطي باستخدام High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). أولاً، أضف 350 μl من منظم الربط (binding buffer) (الذي يحتوي على guanidiniumisothiocyanate) إلى أنبوبة الهضم. بعد خطوة التنقية هذه، يصبح قالب DNA الخطي "بدرجة نقاء RNA" لأن guanidiniumisothiocyanate يعمل كمميع فعال للبروتين ويقوم بتدمير إنزيم RNAse بشكل خاص، وهو ملوث شائع في مختبرات البيولوجيا الجزيئية.
  3. ضع أعمدة الطرد المركزي (spin columns) في أنابيب التجميع، ثم حمّل العمود بمحلول DNA من الخطوة 2، وقم بالطرد المركزي عند 13,000 x g لمدة 30 sec وتخلص من السائل المار.
  4. أضف 500 μl من منظم الغسيل (washing buffer) إلى العمود. قم بالطرد المركزي لمدة 1 min عند 13,000 x g وتخلص من السائل المار.
  5. أضف 200 μl من منظم الغسيل إلى العمود. قم بالطرد المركزي لمدة 1 min عند 13,000 x g لتجفيف العمود تماماً.
  6. ضع عمود الطرد المركزي في أنبوبة Eppendorf جديدة سعة 1.5 ml وأضف 50 μl من الماء الخالي من النيوكلياز (Ambion Product # AM9937) إلى العمود. استخلص الـ DNA عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 min بأقصى سرعة.
  7. بعد الاستخلاص، قم بتركيز المحلول الذي يحتوي على DNA إلى حوالي 15 μl. تضمن هذه الخطوة أن يحتوي المحلول على 0.5 μg من الـ DNA الخطي في 3 μl، وهو التركيز الموصى به لتفاعل نسخ cRNA in vitro التالي.

3. تخليق الـ cRNA In Vitro

  1. اختر طقم mMessage mMachine المناسب (Ambion Product #1340, #1344) بناءً على تسلسل المحفز الموجود في البلازميد (SP6, T7). في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 μl، أضف 3 μl من الحمض النووي DNA الخطي من الخطوة السابقة و1 μl من منظم النسخ (transcription buffer) إلى عينات موزعة مسبقاً بحجم 5 μl من خليط NTP-cap. يعد التوزيع المسبق لخليط NTP-cap ضرورياً لتجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة، والتي قد تؤدي إلى تحلل النيوكليوسيد ثلاثي الفوسفات. وأخيراً، أضف 1 μl من إنزيم RNA polymerase المناسب، اخلط المزيج لفترة وجيزة، ثم قم بتدوير خليط التفاعل لترسيب المكونات (spin-down).
  2. حضن خليط التفاعل لمدة تتراوح من 1 إلى 2 ساعة عند 37 °C. يجب ألا يتجاوز وقت التحضين ساعتين، لأن ذلك قد يؤدي إلى انخفاض إنتاجية أو جودة cRNA.
  3. أضف 15 μl من محلول LiCl بتركيز 3 M المبرد بالثلج من الطقم، و15 μl من الماء الخالي من النوكلياز المبرد، اخلط لفترة وجيزة (تجنب استخدام جهاز الـ vortex)، وقم بتدوير العينة لفترة وجيزة عند 11,000 x g لمدة 10 ثوانٍ، ثم احفظها عند -20 °C لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بترسيب cRNA.
  4. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقاً إلى 4 °C وقم بإجراء الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 13,000 x g بعد الترسيب.
  5. أزل الطافي بعناية وبشكل كامل من الراسب البني الفاتح الموجود في قاع الأنبوب، وأضف 150 μl من إيثانول درجة RNA بتركيز 70% المبرد إلى -20 °C. قم بإجراء الطرد المركزي عند 4 °C لمدة 5 دقائق عند 13,000 x g.
  6. أزل الطافي تماماً، وجفف راسب cRNA المتبقي لفترة وجيزة (1-2 دقيقة) في مبخر طرد مركزي (مثل Eppendorf Concentrator model 5301) في درجة حرارة الغرفة.
  7. أذب الراسب في 12 μl من الماء الخالي من النوكلياز المبرد. تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة مع حفظ عينة cRNA على الثلج.
  8. حدد تركيز cRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي Spectrophotometer (مثل Eppendorf BioPhotometer).
  9. تحقق من سلامة cRNA عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. تنبيه: هذا التحقق المتقاطع ضروري، لأن RNA المتحلل جزئياً يعطي امتصاصاً للأشعة فوق البنفسجية بقيمة غير صفرية. لعمل الرحلان الكهربائي لـ cRNA، استخدم غرفة رحلان كهربائي نظيفة تماماً مملوءة حديثاً بمنظم TAE وهلام أغاروز بتركيز 1% محضر حديثاً. إذا اشتبهت في تلوث غرفة الرحلان الكهربائي أو المنظم بإنزيم RNAse، املأ الغرفة بـ 0.1 M HCl لمدة ساعة واحدة للتنظيف، وحضر منظم TAE باستخدام ماء خالٍ من النوكلياز.
  10. احفظ cRNA عند -20 °C حتى وقت الاستخدام. يمكن تخزين cRNA لمدة سنة واحدة على الأقل عند -20 °C.

4. الحصول على مادة المبيض من إناث Xenopus laevis عن طريق استئصال المبيض الجزئي

لقد تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل السلطة الحكومية المسؤولة (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin، مجلس شيوخ برلين، ألمانيا).

  1. لا تقم بإطعام الضفدع لمدة 12 hr على الأقل قبل الجراحة لمنع القيء.
  2. قم بتحضير محلول مكون من 2 g من المخدر الموضعي tricaine (MS-222) المذاب في 1 L من الماء مع ضبط pH عند 7.0 باستخدام 5 mM من HEPES buffer. تحذير: ارتدِ قفازات النتريل في جميع الأوقات عند التعامل مع MS-222 وقم بتحضير المحلول في خزانة السلامة الكيميائية.
  3. اغمر الضفدع في محلول tricaine (لمدة 10 min كحد أقصى) حتى لا يظهر الحيوان أي منعكسات تصحيحية للوضع. وللتحقق من عدم الاستجابة، حاول قلب الضفدع على ظهره بين يديك وراقب أي حركات دفاعية.
  4. أخرج الضفدع من محلول tricaine يدوياً واشطف الحيوان بماء الصنبور البارد لإزالة المخدر.
  5. ضع الضفدع وظهره للأعلى فوق سرير من الثلج مغطى بمنشفة ورقية مبللة لتجنب إتلاف جلد الضفدع بسبب التلامس المباشر مع الثلج. حافظ على رطوبة جلد الحيوان في جميع الأوقات أثناء العملية لتجنب الجفاف. إن وضعه على الثلج يطيل مدة التخدير.
  6. قم بعمل شق بطني صغير (بطول 8-10 mm) باستخدام مقص حاد على الجانب الأيسر أو الأيمن من الخط الناصف للضفدع. تحذير: احذر من إصابة الخط الجانبي. يجب إجراء الجراحات اللاحقة على جوانب متبادلة للسماح بالتعافي الجيد لأنسجة المبيض الأساسية. عادةً، يجب اختراق ثلاث طبقات من الأنسجة (الجلد الخارجي، وطبقة رقيقة من النسيج الضام الأبيض - اللفافة - وطبقة عضلية).
  7. بعد فتح البطن، امسك أجزاء من فصوص المبيض باستخدام ملاقط غير حادة واسحبها بلطف إلى الخارج. كإرشاد عام، قم بإزالة حوالي 3-5 cm من مادة المبيض من خلال الشق. في حالة إصابة الأوعية الدموية الصغيرة وحدوث نزيف، قم بالضغط باستخدام قضيب بلاستيكي معقم أو برد الإصابة بالثلج حتى يتوقف النزيف.
  8. أغلق الشق جراحياً باستخدام نمط غرز متقطعة بخيط 4.0 Ethicon Vicryl (Johnson & Johnson #V633H). استخدم الأدوات الجراحية للخياطة واربط عقدتين أو ثلاث عقد بشكل منفصل على طول الشق. تحذير: من المهم أن تقوم كل عقدة بخياطة طبقات الأنسجة الثلاث في خطوة واحدة.
  9. بعد العملية، ضع الضفدع في حوض مائي مائل قليلاً (30 L)، يحتوي على كمية كافية من الماء لتغطية الجزء السفلي منه بحيث تكون فتحات أنف الحيوان فوق مستوى الماء للسماح بالتنفس. غطِّ الحيوان خلال فترة الإفاقة (حوالي 1-2 hr) بمنشفة ورقية مبللة لتجنب جفاف الجلد الحساس.
  10. عندما يستعيد الحيوان نشاطه، املأ حوض الماء واحتفظ بالضفدع بشكل منفصل عن الحيوانات الأخرى لمدة 3-4 days لمراقبة التعافي والتئام الجرح.
  11. بعد الجراحة، امنح الضفدع فترة راحة من العمليات اللاحقة لمدة 3 months على الأقل للسماح بالتعافي الكامل للحيوان وأنسجة المبيض. كإرشاد عام، يمكن إجراء 6-8 عمليات جراحية كحد أقصى لكل ضفدع.

5. العزل الإنزيمي للبويضات الفردية

  1. يتم تقطيع مادة المبيض إلى قطع أصغر باستخدام مقص، ثم تُنقل الأنسجة إلى محلول رينجر للبويضات الخالي من Ca2+ (110 mM NaCl، 5 mM KCl، 1 mM MgCl2، 5 mM HEPES، pH 7.4) والذي يحتوي على الكولاجيناز (20 mg/ml، النوع 1A المستخلص من Clostridium hystolyticum، Sigma #C9891) ومثبط التربسين (10 mg/ml، النوع III-O المستخلص من بياض بيض الدجاج، Sigma #T2011).
  2. يُرج محلول الهضم بلطف لمدة 2.5 hr عند درجة حرارة 18 °C. بعد ذلك، يتم متابعة تقدم عملية الهضم على فترات زمنية مدتها 15 min حتى تنفصل معظم البويضات عن النسيج الجريبي.
  3. تُغسل البويضات عدة مرات في أنبوب فالكون سعة 50 ml باستخدام محلول رينجر للبويضات الخالي من Ca2+ حتى يصبح المحلول خالياً تماماً من بقايا الأنسجة.
  4. تُحفظ البويضات في محلول رينجر للبويضات الذي يحتوي على Ca2+ (110 mM NaCl، 5 mM KCl، 1 mM MgCl2، 2 mM CaCl2، 5 mM HEPES، pH 7.4) مضافاً إليه الجنتاميسين (50 μg/ml) عند درجة حرارة 18 °C.

6. حقن الـ cRNA

  1. للتعبير عن Na+,K+- أو H+,K+-ATPase، يتم حقن البويضات بـ 50 nl من محلول cRNA يحتوي على 25 ng من α-subunit و 5 ng من β-subunit cRNA باستخدام مضخة حقن Nanoject II التي تعمل كهربائياً (Drummond Scientific Inc.)، مع أنابيب هيماتوكريت مقاس 3.5 بوصة (Drummond #3 000-203-G/X). تنبيه: قد تختلف كمية mRNA وفقاً للبروتين المستهدف وقد تتطلب تعديلاً لتحقيق أقصى قدر من التعبير عن طريق تقنية Western blotting.
  2. لكل حالة تدفق (على سبيل المثال عند تركيز محدد من Rb+)، يتم حقن 18-22 بويضة. ومن بين هذه البويضات، يتم فحص 50% تحت ظروف "+flux" (على سبيل المثال تركيز معين من Rb+)، و 50% تحت ظروف "-flux" (على سبيل المثال مع تركيز Rb+ المختار ومثبط محدد للإنزيم بتركيز مشبع، مثل 10 mM من ouabain لـ Na+,K+-ATPase أو 10 μM من SCH28080 عند pH 5.5 لـ H+,K+-ATPase).
  3. بعد الحقن، تُنقل البويضات بشكل منفصل إلى أطباق ذات 96 بئراً مملوءة إلى النصف بمحلول Oocyte Ringer Solution يحتوي على Ca2+ و 50 μg/ml من gentamycin عند 18 °C.
  4. يُغطى الطبق ذو الـ 96 بئراً بـ Parafilm لمنع التبخر المفرط.
  5. تُحضن البويضات لمدة 2-7 أيام (اعتماداً على البروتين المستهدف) عند 18 °C. وفي حال تطلب الأمر تخزين البويضات لأكثر من 3 أيام، يُوصى بتغيير محلول الحضن داخل الآبار الدقيقة كل 3 أيام.
  6. لكل مجموعة من بيانات التدفق (على سبيل المثال تجربة معايرة [Rb+])، يجب فحص حوالي 10 بويضات ضابطة غير محقونة (أو محقونة بـ 50 nl من ماء خالٍ من النوكلييز) تحت ظروف "+flux" و "-flux". وبناءً على ذلك، يتم تحضين عدد كافٍ من الخلايا الضابطة بنفس طريقة البويضات المحقونة بـ cRNA قبل تحليل التدفق.

المعالجة المسبقة للبويضات التي تعبر عن إنزيم ATPase غير متجانس

إجراء تحميل +Na

من أجل القياسات الوظيفية لـ Na+/K+-ATPase، من المهم رفع تركيز Na+ داخل الخلايا13، وذلك على النحو التالي:

  1. انقل البويضات إلى محلول تحميل Na+ (110 mM NaCl، و2.5 mM Na-citrate، و2.5 mM MOPS، و2.5 mM TRIS، pH 7.4) لمدة 45 دقيقة على الثلج.
  2. من أجل الاسترداد اللاحق، قم بتحضين البويضات في محلول ما بعد التحميل "PLB" (100 mM NaCl، و1 mM CaCl2، و5 mM BaCl2، و5 mM NiCl2، و2.5 mM MOPS، و2.5 mM TRIS، pH 7.4) لمدة 30 دقيقة على الأقل على الثلج.
  3. احفظ البويضات في PLB على الثلج حتى وقت الاستخدام.

7. الحجب المسبق للصوديوم الداخلي (Endogenous Na)+،K+أدينوزين ثلاثي الفوسفاتيز (-ATPase)

تنبيه: بما أن بويضات Xenopus تعبر عن مضخة Na+,K+-ATPase داخلية، فمن المهم تثبيط هذه المضخة الداخلية قبل إجراء تجارب تدفق Rb+، وذلك على النحو التالي:

  1. الآن يتم تثبيط Na+,K+-ATPase الداخلي عن طريق تحضين البويضات في محلول منظم ما بعد التحميل (Post Loading Buffer) يحتوي على 100 μM من الأوابين (ouabain) لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة.

8. الفيزيولوجيا الكهربائية

  1. قم بتجهيز الأقطاب الكهربائية الدقيقة عن طريق سحب الشعيرات البوروسيليكاتية (GB150F-8P, Science Products GmbH) باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة ثنائي الخطوة (Model PC-10, Narishige).
  2. املأ الأقطاب الزجاجية من الخلف بـ 3 M KCl. وبالنسبة لتجارب TEVC الخاصة بـ H+,K+-ATPase، نوصي باستخدام 3M NaCl بدلاً من ذلك، مما أدى إلى تسجيلات تيار أكثر استقراراً. قم بتثبيت الماصة فوق سلك Ag/AgCl الموجود في حاملات الأقطاب الكهربائية الدقيقة في إعداد تثبيت الجهد ثنائي القطب.
  3. أدخل الأقطاب الكهربائية الزجاجية الدقيقة وجسري أغار (يجب تحضيرهما باستخدام NaCl/agar بدلاً من KCl/agar الشائع استخدامه)، واللذين يربطان أقطاب Ag/AgCl المرجعية بمحلول الحمام، داخل غرفة التسجيل (Warner Instr., model RC-10) المملوءة مسبقاً بمحلول القياس المنظم (على سبيل المثال PLB مع 10 μM ouabain لـ Na+,K+-ATPase).
  4. حول مضخم تثبيت الجهد (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germany) إلى وضع "OFF".
  5. افحص مقاومة كل قطب زجاجي على حدة (يجب أن تكون كلتاهما في نطاق 0.5-2 MΩ).
  6. افحص جهود الإزاحة للقطب الكهربائي للجهد والتيار على شاشة مضخم TEVC المناسبة. في حالة وجود اختلاف عن الصفر، اضبط الإزاحة باستخدام منظمات الإزاحة المقابلة في المضخم.
  7. ضع بويضة في منتصف الغرفة واخترق الغشاء بلطف باستخدام قطبي التيار والجهد.
  8. افحص قراءة الجهد في المضخم. تعطي قراءة جهد قطب الجهد الآن قيمة جهد الراحة للخلية.
  9. حول المضخم إلى وضع VC (تثبيت الجهد).
  10. باستخدام برنامج pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)، قم بتثبيت جهد غشاء الخلية عند قيمة محددة مسبقاً. يمكن أن تكون هذه القيمة هي قيمة جهد الراحة الذي تم قياسه سابقاً (للتسجيل تحت ظروف تيار غشاء صفري) أو أي قيمة جهد اختبار مطلوبة. انتبه إلى سعة واستقرار تيار التسرب (في غياب K+/Rb+/Li+)، والذي - كإرشاد عام - يجب ألا يتجاوز -200 nA عند -30 mV.
  11. قم بتروية البويضة لفترة زمنية معينة (على سبيل المثال 3 min لـ Na+,K+-ATPase) بمحلول يحتوي على Rb+ (لتحقيق أقصى تيار، استخدم تركيزات مشبعة من قياسات التدفق تحت ظروف غير مثبتة) وسجل تيار المضخة باستخدام برنامج pCLAMP في وضع التسجيل المستمر. تأكد من إيقاف امتصاص Rb+ تماماً بعد ذلك عن طريق تروية الخلية بمحلول خالٍ من Rb+ لمدة 30 sec.
    1. أوقف تجربة تثبيت الجهد ثنائية القطب، وأخرج البويضة من غرفة التسجيل، ثم انتقل إلى خطوة الغسيل 4 في فقرة "تجارب امتصاص Rb+" لتحليل امتصاص Rb+ باستخدام مطيافية الامتصاص الذري.
  12. قم بإجراء طرح تيار الإزاحة وتقييم التكامل الزمني لتيار المضخة باستخدام برنامج Clampfit من حزمة pCLAMP.

9. قياسات امتصاص Rb+

  1. اقطع طرف ماصة أصفر سعة 200 μl وأذبه ليصل قطره إلى حوالي 2 mm. يضمن استخدام هذه الأطراف نقل الحد الأدنى من المحلول عند نقل البويضات بين أطباق الحضن أو الغسيل. أذب طرف الماصة سريعاً باستخدام لهب ولاعة جيبية؛ إذ تمنع خطوة الصقل هذه تلف البويضات.
  2. جهّز لكل بويضة سيتم قياسها أنبوب Eppendorf سعة 1.5 ml مملوء بـ 1 ml من ماء Millipore. رتب ثلاثة أطباق Petri تحتوي على محلول غسيل منظم خالٍ من Rb+ (مثل PLB) وطبقاً واحداً يحتوي على ماء Millipore.
  3. انقل خمس بويضات محُضنة مسبقاً في آن واحد إلى طبق Petri بقطر 3.5 cm مملوء بمحلول منظم لتدفق Rb+ (بتركيزات تتراوح من 0 إلى 15 mM Rb+) واحضنها لمدة 3 min (لـ Na+,K+-ATPase) أو 15 min (لـ H+,K+-ATPase) تحت تحكم في درجة الحرارة (مثلاً 21 °C في غرفة مكيفة أو على لوح تسخين).
  4. انقل البويضات في آن واحد إلى الطبق الأول الذي يحتوي على محلول غسيل منظم خالٍ من Rb+ (ويمكن استخدام PLB في حالة Na+,K+-ATPase). من الضروري الحفاظ على الفروق بين أوقات الحضن بحيث تكون أقل من 5 sec. اشطفها بلطف.
  5. انقل البويضات إلى الطبق الثاني والثالث اللذين يحتويان على محلول غسيل منظم خالٍ من Rb+، واشطفها بلطف.
  6. انقل البويضات إلى الطبق الذي يحتوي على ماء Millipore، واشطفها بلطف.
  7. انقل كل بويضة على حدة إلى أحد أنابيب Eppendorf المجهزة والمملوءة بـ 1 ml من ماء Millipore.
  8. قم بتجنيس البويضة عن طريق السحب والدفع باستخدام طرف ماصة سعة 200 μl حتى يصبح المحلول عكراً بشكل متجانس.

10. تحضير جهاز AAnalyst 800 باستخدام نظام فرن THGA

  1. افتح صمام الغاز الخامل المطلوب (الأرجون) وأدخل مصباح الكاثود المجوف المناسب (مصابيح HCL أحادية العنصر لـ Li+ أو Rb+؛ Photron، ملبورن، أستراليا) في موضع مقبس عشوائي.
  2. قم بتشغيل برنامج التحكم WinLab32 (Perkin Elmer) وقم بتشغيل مصباح الكاثود المجوف المناسب. يتم التعرف على مصابيح الكاثود المجوف من نوع Perkin Elmer Lumina تلقائياً وتظهر في قائمة الاختيار. أما مصابيح الكاثود المجوف غير المتوافقة، فيجب إدخال بياناتها يدوياً.
  3. اترك فترة إحماء تبلغ حوالي 10-15 دقيقة لتحقيق توازن المصابيح.
  4. تأكد من سلامة أنبوب المذرر الجرافيتي المسخن عرضياً (THGA tube, Perkin Elmer, #B3000641) عن طريق الفحص البصري. يجب استبدال أفران THGA كل 300 حقنة (متوسط العمر الافتراضي المحدد من قبل الشركة المصنعة)، ولكنها قد تتحمل أعداداً أكبر من العينات.
  5. حدد تقنية "THGA furnace" في برنامج WinLab32.
  6. قم بتحضير خمس عينات معايرة على الأقل تحتوي على Rb+/Li+ تركيزات تتراوح بين 10 و 50 μg/L (على سبيل المثال (عن طريق التخفيف المناسب من محلول RbCl أو LiCl بتركيز 1 مولار) ومسبار فارغ واحد يحتوي على ماء Millipore فقط. ملاحظة: يجب أن تكون الأملاح بأعلى درجة نقاء متاحة ("puriss." أو من معايير المعايرة المتوفرة تجارياً لأغراض مطيافية الامتصاص الذري AAS).
  7. اختر ملف التهيئة المناسب (والذي يُسمى ملف "الطريقة" method، والذي يوفر مرجعاً لمعلمات المعايرة ويُحمّل إعدادات الجهاز، على سبيل المثال طول موجة الكشف بجهاز طيف الامتصاص الذري، والأطوال الموجية لعنصر الروبيديوم (Rb)+ و Li+ (هما 780 نانومتر و670.8 نانومتر، على التوالي) ثم أدخل مواضع وتركيزات عينات المعايرة. ولأجل ذلك، اختر المغير الآلي المناسب (صينية عينات تحتوي على 88 أو 148 موضع سحب عينات لجهاز AAnalyst 800).
  8. قياس منحنى المعايرة.
  9. انقل الآن كل مستخلص متجانس من البويضات إلى أكواب عينات فردية من البولي بروبيلين سعة 1.2 مل (Perkin Elmer, #B0510397)، ثم ضع أنابيب الاختبار هذه في صينية جهاز السحب الآلي للعينات.
  10. قم بإنشاء ملف معلومات عينة لتحديد المجسات في مواضع المغير الآلي للعينات، ثم اضبط حجم العينة إلى 20 μl، ثم ابدأ بتشغيل الجهاز.
  11. بعد اكتمال التشغيل (أو أثناء الفحص البصري كل ساعة في حال وجود سلاسل طويلة من العينات)، يتم التحقق من المجسات التي تكون فيها كمية Rb المقاسة+ تتجاوز الحد الأقصى لمنحنى المعايرة. وفي هذه الحالة، يتم تخفيف العينات المعنية بشكل مناسب وقياسها مرة أخرى.

11. ملاحظات حول قياس أعداد العينات الكبيرة (أكثر من 50)

  • في حالة تشغيل الجهاز طوال الليل، يوصى بملء خزان جهاز أخذ العينات التلقائي بماء Millipore لمنع تبخر المتجانسات الموجودة في أنابيب الاختبار.
  • يوصى بوضع أنبوب اختبار يحتوي على 2% HNO3 بعد كل 20 عينة لمنع انسداد الشعيرة الحقنية لجهاز أخذ العينات التلقائي.

بروتوكول درجة الحرارة الموصى به لتقنية THGA-AAS لتقدير الروبيديوم

الخطوةدرجة الحرارة (°C)وقت الصعود (sec)وقت التثبيت (sec)تدفق غاز الأرجون (ml/min)
التجفيف 1110120250
التجفيف 2130530250
التحلل الحراري300-6001020250
التذرية1700-1800050
التنظيف240012250

بروتوكول درجة الحرارة الموصى به لتقنية THGA-AAS لتقدير الليثيوم

الخطوةدرجة الحرارة (°C)وقت التصاعد (sec)وقت التثبيت (sec)تدفق غاز الأرغون (ml/min)
التجفيف 1110130250
التجفيف 21301530250
التحلل الحراري9001020250
التذرير2200050
التنظيف245013250

تحليل البيانات

  1. احسب متوسط امتصاص Rb+ لكل حالة قياس. يعطي مطياف الامتصاص الذري (AAS) قيمًا بوحدة μg/L، والتي يجب تحويلها إلى pmol/oocyte/min.
  2. بالنسبة للتحليلات الحركية (قيم KM الظاهرية)، اطرح امتصاص Rb+ الخلفي الذي تم تحديده من البويضات الضابطة غير المحقونة من نفس الدفعة عند تركيز RbCl المعطى.
  3. قم برسم البيانات باستخدام برنامج Origin، وطبق مواءمة دالة Hill صيغة معادلة Hill؛ مخطط الحركية الكيميائية الحيوية؛ تحليل ألفة الارتباط؛ إنزيم الركيزة. أو دالة Michaelis-Menten معادلة حركية الإنزيم؛ الصيغة A = Amax[S]/(K0.5 + [S])؛ مفهوم الكيمياء الحيوية. على البيانات. في هذه المعادلات، يمثل [S] تركيز الركيزة، وnH معامل Hill، وK0.5 تركيز الركيزة اللازم لنصف التنشيط الأقصى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسمح تقدير كمية امتصاص Rb+ بواسطة مضخات P-type ATPases التي تعمل بالنقل المضاد لـ K+ (أو Rb+) بواسطة AAS في نظام التعبير في بويضات Xenopus بالتحديد الموثوق لمعاملات حركية الإنزيم.

تحديد قياس اتحادية النقل لـ Na+/K+-ATPase

بالنسبة لـ Na+/K+-ATPase المولدة للكهرباء، يمكن تحديد تدفقات Rb+ في تجارب تثبيت الجهد ثنائية القطب التي تهدف إلى إيجاد الارتباط بين نقل الشحنة الصافي (الت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أثبتت الطريقة الموصوفة لقياس كمية Rb + (أو Li +) المأخوذة في بويضات Xenopus الفردية التي تعبر عن Na + أو K +- أو H + أو K + - - ATPase أنها تقنية متعددة الاستخدامات ومرنة ودقيقة لتحديد المعلمات الحركية أو الديناميكية الحرارية للنقل من النوع P1،4،5،7،8. إنه بديل آمن وموثوق لمقايسات تدفق التتبع الإشعاعي ، ويسمح بمعالجة نطاق كبير من الأسئلة التجريبية في غضون فترة زمنية قصيرة جدا. وفقا لذلك ، تم الحصول على بيانات محدودة للغاية فقط باستخدام ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون إرنست بامبرغ (معهد ماكس بلانك للفيزياء الحيوية ، فرانكفورت ، ألمانيا) على الدعم السخي خلال المرحلة الأولى من تطوير الطريقة ، وكازوهيرو آبي (جامعة كيوتو ، اليابان) على العديد من المناقشات المثمرة والدكتور مايكل كول (Analytik-Service ، Woltersdorf ، ألمانيا) على الدعم الفني. يقر المؤلفون بامتنان بالتمويل المقدم من مؤسسة الأبحاث الألمانية DFG (مجموعة التميز "توحيد المفاهيم في التحفيز") ، والتي مولت أيضا جهاز Perkin Elmer AAnalyst 800 (SFB 498).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4.0 مادة خياطة Ethicon Vicrylجونسون جونسونV633H
كولاجيناز نوع 1A من Clostridium hystolyticum< / em>Sigma AldrichC9891
طقم تنقية منتج PCR عالي النقاءRoche العلوم التطبيقية11732676001
المياه الخالية من NucleaseAmbionAM9937
mMessage mMachine Kit SP6 / T7Ambion1340 ، 1344
Ouabain أوكتاهيدراتSigma AldrichO3125
Tricain (ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات)Sigma AldrichA5040
مثبط التربسين من النوع III-O من بياض بيض الدجاجSigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800Perkin Elmer0993-5256
WinLab32TMPerkin Elmer
BioPhotometerEppendorf6131 000.012
علوم الشعيرات الدموية البورسليكاتGB150F-8P
أنابيب الهيماتوكريت 3.5 "Drummond Scientific3 000-203-G / X
مصباح الكاثود المجوف ليثيومPhotronP929LL
مصباح الكاثود المجوف روبيديومفوترونP945
مجتذب الماصات الدقيقة Narishigeنموذج PC-10
غرفة تسجيل البويضات RC-10Warner Instr.W4 64-0306
حقن Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
برنامج pCLAMPالأجهزة الجزيئية
كوب عينة من مادة البولي بروبلين (1.2 مل)Perkin ElmerB0510397
Speedvac - موديل المكثف 5301Eppendorf5301 000.210
THGA TubePerkin ElmerB3000641
مكبر للصوت توربو TEC-10CXNPI للإلكترونياتTEC-10CX
منتجات مضخة

المراجع

  1. Tavraz, N. N., et al. Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine. Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).
  2. Castillo, J. P., et al. Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).
  3. Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump. Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).
  4. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase. J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).
  5. Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions. J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).
  6. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes. Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).
  7. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes. PLoS One. 7, e33645(2012).
  8. Tavraz, N. N., et al. Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2. J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).
  9. Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).
  10. Koenderink, J. B., et al. Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation. Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).
  11. Price, E. M. J., Lingrel, B. Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme. Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).
  12. Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).
  13. Lafaire, A. V., Schwarz, W. Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis. J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).
  14. Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature. 450, 1043-1049 (2007).
  15. Toustrup-Jensen, M. S., et al. The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935. J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).
  16. Morth, J. P., et al. The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).
  17. Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).
  18. Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit. J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).
  19. Vedovato, N., Gadsby, D. C. The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions. J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).
  20. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J. Vis. Exp. (16), e758(2008).
  21. Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).
  22. Koenderink, J. B., et al. Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket. J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).
  23. Gottardi, C. J., Caplan, M. J. Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly. J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).
  24. Mathews, P. M., et al. Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase. Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).
  25. Horisberger, J. D., et al. The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps. J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).
  26. Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase. J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).
  27. Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase. Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تثبيت الجهد ثنائي القطبامتصاص الروبيديوممرذذ الغرافيت المسخن عرضياًالتحكم في جهد الغشاءقياس اتحادية النقل
قياس الكاتيونات النقل من نا، K-H و، K-أتباز في
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.