Method Article

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب انواع معينة ايليجانس 'تنقل

DOI:

10.3791/50226

⸱

May 2nd, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, McMaster University , 2Department of Mechanical Engineering, McMaster University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك طريقة الصغرى الكهربائية فلويديك شبه الآلي للحث تنقل على الطلب في انواع معينة ايليجانس يوصف. ويستند هذا الأسلوب على هذه الظاهرة الفيزيولوجية العصبية من الديدان الاستجابة لمجالات كهربائية خفيفة ("انجذاب كهربي") داخل قنوات ميكروفلويديك. يقدم ميكروفلويديك انجذاب كهربي باعتبارها وحساسة، تقنية السريع منخفضة التكلفة، وقابلة للكشف عن العوامل التي تؤثر على صحة الخلايا العصبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في انواع معينة ايليجانس الخيطية هو النموذج الحي تنوعا للبحوث الطبية الحيوية بسبب صيانته من الجينات ذات الصلة بالمرض والممرات وكذلك سهولة زراعة. عدة C. وقد تم الإبلاغ عن نماذج مرض ايليجانس، بما في ذلك الاضطرابات العصبية مثل مرض باركنسون (PD)، والذي ينطوي على انحطاط الدوبامين (DA) الخلايا العصبية 1. وقد استخدمت كل من الجينات المحورة والمواد الكيميائية أعصاب للحث DA تنكس عصبي وعيوب حركة يترتب على ذلك في الديدان، والسماح لتحقيقات في أساس تنكس عصبي وشاشات للجينات الأعصاب ومركبات 2،3.

شاشات في أقل حقيقيات النوى مثل C. توفير ايليجانس وسيلة فعالة واقتصادية لتحديد المركبات والجينات التي تؤثر على إشارات العصبية. وعادة ما يتم تنفيذ الشاشات التقليدية يدويا وسجل عن طريق التفتيش البصري، وبالتالي، فهي المرة الجدد uming وعرضة للأخطاء البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم التركيز على تحليل المستوى الخلوي في حين تجاهل الحركة والتي هي معلمة أهمية خاصة بالنسبة للاضطرابات الحركة.

لقد قمنا بتطوير نظام الفرز ميكروفلويديك رواية (الشكل 1) الذي يتحكم والكمي C. تنقل ايليجانس 'باستخدام المحفزات الحقل الكهربائي داخل microchannels. لقد أظهرنا أن تيارا الميداني المباشر (DC) يمكن أن تحفز بقوة على الطلب تحرك نحو القطب السالب ("انجذاب كهربي") 4. عكس قطبية الحقل يسبب الدودة لعكس اتجاهه بسرعة كذلك. لقد أظهرنا أيضا أن العيوب في الخلايا العصبية الحسية الدوبامين وغيرها من تغيير استجابة سباحة 5. ولذلك، شذوذ في إشارة العصبية يمكن تحديدها باستخدام تنقل باعتبارها مقروءة إجراءات المغادرة. استجابة حركة يمكن أن يكون كميا بدقة باستخدام مجموعة من المعلمات مثل سرعة السباحة، هيئة تردد الانحناء والوقت الانعكاس.

ق = "jove_content"> كشفت عملنا أن الاستجابة electrotactic يختلف مع تقدم العمر. على وجه التحديد، والاستجابة الشباب إلى مجموعة أقل من الحقول الكهربائية والتحرك على نحو أسرع مقارنة اليرقات 4. أدت هذه النتائج لنا لتصميم جهاز ميكروفلويديك جديدة لفرز بسلبية الديدان حسب العمر والنمط الظاهري 6.

لقد اختبرنا أيضا استجابة من الديدان إلى العاصمة نابض والمتناوب (AC) الحقول الكهربائية الحالية. الحقول DC نابض من دورات العمل المختلفة بشكل فعال انجذاب كهربي ولدت في كلا C. ايليجانس ولها ابن عم C. briggsae 7. في تجربة أخرى، متناظرة حقول AC مع ترددات تتراوح ما بين 1 إلى 3 كيلوهرتز هرتز يجمد الديدان داخل القناة 8.

تنفيذ الحقل الكهربائي في بيئة ميكروفلويديك تمكن التنفيذ السريع والآلي للمقايسة انجذاب كهربي. وعود هذا النهج لتسهيل شاشات الوراثية والكيميائية عالية الإنتاجية لعواملالتي تؤثر على وظيفة الخلايا العصبية وقدرتها على البقاء.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ضوئيه للماجستير تصنيع القالب

  1. يستحم لمدة 3 بوصة رقاقة السيليكون في الأسيتون لمدة 30 ثانية ثم الميثانول لمدة 30 ثانية. شطف مع DH 2 0 الماء لمدة 5 دقائق.
  2. يجف سطح الرقاقة في التعامل مع البندقية ضربة N2. تسخين رقاقة على طبق ساخن عند 140 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  3. البلازما أكسدة سطح رقاقة السيليكون (1 دقيقة، 50 W).
  4. تدور معطف سطح الرقاقة مع 3 مل SU-8 100 مقاوم الضوء (40 ثانية؛ 1،750 دورة في الدقيقة).
  5. قبل خبز الرقاقة المغلفة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم المنحدر درجة حرارة تصل إلى 95 درجة مئوية أكثر من 2 دقيقة. الحفاظ على هذا الإعداد ل1 ساعة إضافية.
  6. محاذاة الضوئية التي تحتوي على تصميم القناة المطلوبة. فضح مقاومة إلى 550-600 ميغا جول / سم 2 من ضوء الأشعة فوق البنفسجية (350-400 نانومتر). ويمكن تصميم Photomasks في أوتوكاد وطباعتها على الشفافية مع طباعة عالية القرار.
  7. بعد خبز الرقاقة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، التعلية رانه درجة الحرارة كما كان من قبل.
  8. تزج الرقاقة في SU-8 حل المطور لمدة 10-15 دقيقة. تحقق لاستكمال التطوير من قبل الشطف مع الأيزوبروبانول. إذا ظهر راسب أبيض، مواصلة تطوير. يظهر القالب الرئيسي في الشكل 2A.

2. الطباعة الحجرية الناعمة لتصنيع متناهية

  1. خلط 35 مل polydimethylsiloxane (PDMS) قاعدة المطاط الصناعي مع 3.5 مل PDMS كيل علاج.
  2. وضع القالب الرئيسي ملفقة (خطة مواجهة) ورقاقة السيليكون فارغ في أطباق بتري واصطف مع رقائق الألومنيوم.
  3. صب 20 مل PDMS سابق البلمرة في القالب طبق رئيسي و 15 مل في طبق الثاني. القضاء على جيوب الهواء تحت رقائق طريق الضغط بلطف عليهم مع قضيب خشبي القابل للتصرف.
  4. تشمل كلا من أطباق ويوضع جانبا لمدة يوم لعلاج. بدلا من ذلك، لسرعة المعالجة، وإزالة فقاعات الهواء من PDMS باستخدام degasifier فراغ ثم ترك الأطباق على طبق ساخن على 80 درجة مئوية لمدة 2الموارد البشرية.
  5. إزالة احباط وقشر PDMS من رقائق.
  6. استخدام هاريس أحادي النواة (2.5 مم) لكمة منافذ الوصول السائل في كلا طرفي القناة. قطع القناة وPDMS فارغة إلى شرائح ذات الحجم المماثل.
  7. تحميل قناة، الفراغ PDMS قطاع وشريحة زجاجية (75 × 25 مم 2) في مؤكسد البلازما، وتقع على الأرجح في غرف الأبحاث. فضح لالبلازما الأكسجين لمدة 40 ثانية في 40 W السلطة.
  8. الصاق قطعة قناة وشريحة زجاجية إلى طرفي نقيض في قطاع فارغة. يوضع جانبا لمدة 2 ساعة لاستكمال الربط.
  9. وضع الجمعية على طبق ساخن عند 120 درجة مئوية. إرفاق أنابيب بلاستيكية (القطر الداخلي 1/32 "، وقطره الخارجي 3/32")، كل لا يقل عن 6 بوصة طويلة، إلى خزانات لكمات باستخدام PDMS سابق البلمرة. يضعوا موصل البلاستيك فلويديك على أحد أو كلا أنابيب للسماح المرفقات حقنة، أو استخدام التجهيزات المتاحة تجاريا.
  10. السماح للPDMS تأمين أنابيب لعلاج. إدراج 3 "أطوال من 22 مقياس معزول الأسلاك النحاسية في مجموعة شرق افريقياح الخزان، بين أنبوب مدخل والقناة، وآمنة مع PDMS سابق البلمرة. يظهر المنتج النهائي في الشكل 2B.

3. انجذاب كهربي التجربة

  1. وضع متناهية على المسرح (ويفضل XY-المنقولة) من المجهر مع كاميرا محمولة متصلة إلى جهاز (الشكل 1).
  2. توصيل التيار الكهربائي أو الأسلاك الناتج مكبر للصوت لأقطاب متناهية ل. A بسيط العاصمة امدادات الطاقة غير كافية إذا كان المطلوب فقط إشارة DC، لكن مكبر للصوت متصلا وظيفة مولد يسمح تطبيق نابض العاصمة وإشارات AC كذلك.
  3. إرفاق متناهية في أنبوب الإخراج إلى الحقنة. يغرق مصب أنبوب مدخل في M9 العازلة الفسيولوجية وبلطف يطمح السائل في القناة عن طريق تطبيق الضغط السلبي داخل الحقنة (إما يدويا أو باستخدام مضخة محقنة). عندما يتم ملأ كل مدخل ومخرج أنابيب مع M9، افصل جمعة حقنةROM الأنبوب. المستويين أنابيب إلى نفس الارتفاع لمنع تدفق مدفوعة hydrostatically.
  4. تطبيق الجهد DC إلى القناة والتأكد من أن المقاومة (R = V / I) هو حوالي 0.6 MΩ (ل50 مم طويل، 0.3 ملم واسعة و~ 0.1 ملم متناهية العميقة).
  5. إذا كنت راضيا عن سلامة القناة، اتبع الخطوات المذكورة أعلاه لتحميل الديدان من تعليق المخفف في القناة.
  6. قطع المحقنة وhydrostatically التلاعب في تدفق من خلال تعديل ارتفاع نسبي الأنابيب '. استخدام هذا الأسلوب لوضع دودة في وسط القناة ثم وضع كل من أنابيب شقة في نفس الارتفاع.
  7. تعيين التيار الكهربائي إلى الجهد المناسب: 4-12 V / سم لL3 الحيوانات المرحلة، 4-10 V / سم لL4s، و2-4 V / سم للصغار البالغين. تفعيل إشارة كهربائية والسماح 1 دقيقة من قبل التعرض لدودة للتأقلم إلى الميدان. وينبغي أن تبدأ الدودة تتحرك نحو القطب السالب. عندما اجتاز دقيقة، استخدام الكاميرا لبدء التسجيل.
  8. لميلان ونبضد التجارب العاصمة، ويمكن اعتماد أقصى الحقل الكهربائي استجابة من دورة أعلاه وتردد واجب يمكن أن يكون إشارة التضمين كما تريد 7، 8.
  9. عندما يتم الانتهاء من التجربة، وإزالة جميع السائل (والديدان) من القناة، وشطفه مع DH 2 0، وترك الجهاز على طبق ساخن عند 125 درجة مئوية لتجف.
  10. استخراج البيانات الحركي من أشرطة فيديو مسجلة يدويا باستخدام يماغيج المعاهد الوطنية للصحة ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) أو العرف القائم على MATLAB تتبع البرمجيات دودة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض شريط فيديو ممثل انجذاب كهربي البرية من نوع الديدان الخيطية الشباب الكبار وموقفها والمخرجات سرعة من برنامج تتبع دودة في التكميلية فيديو (1) والشكل (3). برنامج تحليل الحركة نفسها لا تعترف اتجاه قطبية المجال والوقت من انعكاس القطبية، بل يجب الحصول على هذه المعلومات من مصدر الفيديو. ويمكن القيام بذلك باستخدام جديلة السمعية أو البصرية في الفيديو أو الكتابة أسفل الظروف التجريبية والتلاعب.

يتم ع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستفادة من هذه الظاهرة السلوكية وصف لأول مرة من قبل غابل والزملاء وبناء على أعمال التلاعب dielectrophoretic من تشوانغ وزملاؤه 11،12، يوفر لنا مقايسة انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك وسيلة سهلة وقوية وحساسة للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية في الديدان باستخدام حركة كما يبلغ حجم انتاجها. تحليل حركة المعلمات يسمح مقارنة كمية بين الأنماط الجينية المختلفة. دقة متناهية تلفيق وتطبيق الحقل الكهربائي معا تقديم كل بيئة يمكن السيطرة عليها ووسيلة للتواصل مع دودة للسيطرة على الحرك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد قدم ميكروفلويديك انجذاب كهربي تكنولوجيا الفحص لبراءات الاختراع في الولايات المتحدة الأمريكية وكندا.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا، كندا برنامج كراسي البحث والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، وزارة أونتاريو للبحوث والابتكار من خلال بهم الباحثون المبكر برنامج جائزة للحصول على الدعم المالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مختبرات الأسيتونكاليدون1200-1-30
مختبرات الميثانولكاليدون6700-1-30
مختبرات الأيزوبروبانولكاليدون8600-1-40
SU-8شركة ميكروكيم.Y131273SU-8 100
SU-8 DeveloperMicrochem Corp.Y020100
92 × 16 مم طبق بتريSarstedt82.1473.001
Sylgard 184 مجموعة المطاطسيليكون Dow Corningيحتوي على قاعدة مطاطية وعامل معالجة
مولد وظيفةTektronix Inc.نموذج AFG3022B
مكبر للصوتTrek Inc.نموذج 2210-CE
مضخة حقنةهارفارد جهاز70-4506موديل 11 ELITE
لوح تسخينفيشر Scientific11675916Qموديل HP131725Q
الصناعي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
  3. Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
  4. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
  5. Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
  6. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
  7. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).
  8. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).
  9. van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027(2008).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
  12. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
  13. Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5(2005).
  14. Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ElectrotaxisC Elegans LocomotionElectric Field StimulationMicrochannel DesignPDMS MoldingWorm Tracking SoftwareSwimming Speed AnalysisBody Bend FrequencyReversal Time MeasurementNeurodegenerative Disorder Screening

Related Articles