مقالة منهجية

إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

DOI:

10.3791/50227

⸱

يونيو 21, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة تشكيل بروتينات الغشاء وظيفية في الجسيمات الشحمية العملاقة من تكوين المعرفة هو نهج قوية عندما يقترن الكهربية التصحيح، المشبك. ومع ذلك، قد يكون الإنتاج الحويصلية العملاقة التقليدية يتعارض مع استقرار البروتين. نحن تصف بروتوكولات لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة من الدهون نقية أو الجسيمات الشحمية صغيرة تحتوي على القنوات الأيونية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم إعادة تشكيل القنوات الأيونية في الأغشية الدهنية محددة الصفات كيميائيا لتسجيل الكهربية تقنية قوية لتحديد واستكشاف وظيفة هذه البروتينات الهامة. بيد أن الاستعدادات الكلاسيكية، مثل طبقات ثنائية مستو، والحد من التلاعب والتجارب التي يمكن القيام بها على قناة المعاد والبيئة غشاء لها. وتشبه خلية هيكل أكثر من الجسيمات الشحمية العملاقة يسمح تجارب التصحيح، المشبك التقليدية دون التضحية السيطرة على البيئة الدهون.

Electroformation هو يعني كفاءة لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة> 10 ميكرون في القطر الذي يعتمد على تطبيق التيار الكهربائي بالتناوب إلى رقيقة، فيلم الدهون أمرت تترسب على سطح القطب. ومع ذلك، وبما أن بروتوكول الكلاسيكية يدعو إلى الدهون لتودع من المذيبات العضوية، وأنه غير متوافق مع بروتينات الغشاء أقل قوة مثل القنوات الأيونية ويجب أن يتم تعديل. في الآونة الأخيرة، والعلاقات العامةوقد وضعت otocols إلى electroform الجسيمات الشحمية العملاقة من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة جزئيا، والتي تكيفنا مع الجسيمات الشحمية تحتوي على البروتين في المختبر لدينا.

نقدم هنا الخلفية، ومعدات، وتقنيات، ومزالق electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة من التفرق الحويصلية الصغيرة. نبدأ مع بروتوكول الكلاسيكية، والتي ينبغي أن يتقن أولا قبل محاولة البروتوكولات أكثر تحديا التي تتبع. ونحن لشرح عملية جفاف جزئي للرقابة من الجسيمات الشحمية صغيرة باستخدام بخار التوازن مع حلول الملح المشبع. وأخيرا، ونحن لشرح عملية electroformation نفسها. سنقوم بشرح بسيط، تجهيزات رخيصة الثمن التي يمكن إجراؤها في المنزل لإنتاج الجسيمات الشحمية عالية الجودة، ووصف الفحص البصري للإعداد في كل مرحلة لضمان أفضل النتائج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات الشحمية العملاقة (غالبا ما تسمى الحويصلات unilamellar العملاقة، أو GUVs) وقد استخدمت أساسا لدراسة الفيزياء والكيمياء الفيزيائية من طبقات ثنائية الدهون، بما في ذلك دراسات من تشوه طبقة ثنائية، الوحشي مرحلة التعايش ("الطوافات")، والانصهار الغشاء، الخ 1-4. لديهم بشكل صارخ مثل خلية هيكل: قذيفة كروية من الغشاء الذي يحيط الداخلية مائي والتي يمكن بسهولة أن يتم مختلفة من المخزن المؤقت المائية المحيطة بها. ، بحكم تعريفها، ≈ 1-100 ميكرون في القطر، بحيث يمكن تصويرها أنهم باستخدام مجموعة متنوعة من النهج المجهر الضوئي. يمكن أن تكون مصنوعة مشدود باستخدام التدرجات التناضحي أو التوتر تطبيقها ميكانيكيا، بحيث حين ميسرة عموما، يمكن التلاعب ممتلكاتهم لسهولة التعامل. على وجه الخصوص، والسيطرة على "صلابة" من الحويصلية يجعلها واضحة لتشكيل بقع "الحويصلية المرفقة" أو رفعه للالكهربية. في الماضي، تم إجراء إعادة ايون القناة إلى حد كبير في مستو الدهون بilayers. الآن، والقدرة على تشكيل بقع من الجسيمات الشحمية العملاقة واستخدام جعبة كبيرة من الأدوات التي وضعت لالكهربية التقليدية (المجهري مضان، micropipette الطموح، نضح السريع والتحكم في درجة الحرارة، الخ) يجعل الجسيمات الشحمية العملاقة جذابة على نحو متزايد للدراسات إعادة 5،6.

وقد بذلت الجسيمات الشحمية العملاقة من قبل العديد من الاستراتيجيات. في الواقع، الجسيمات الشحمية العملاقة تشكل عفويا من خلال عملية التورم عند ممهى فيلم الدهون المجففة 4،7،8. الرغبة في إعداد أكثر بسرعة أكبر، أدى الجسيمات الشحمية أكثر اتساقا الباحثين إلى أساليب أخرى، أهمها electroformation 1،9. يعتمد Electroformation أيضا على ترطيب فيلم الدهون المجففة، ولكن تسرع هذه العملية من خلال تطبيق مجال كهربائي تتأرجح عبر فيلم الدهون. يتم تطبيق هذا المجال من خلال قطبين، إما أسلاك البلاتين أو الإنديوم-أكسيد القصدير (ITO) شرائح الزجاج المطلي، وفصلها عن طريق المياه أوالعازلة والتي تترسب على نسبة الدهون. من خلال تسريع تورم الجسيمات الشحمية، واحد يحقق عائدات أعلى من الجسيمات الشحمية أكبر. وهكذا، أصبح electroformation الأسلوب الافتراضي لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة 4.

آلية electroformation ليست مفهومة تماما، ويتم تطوير معظم بروتوكولات تجريبيا (على سبيل المثال 10،11). ومع ذلك، يمكننا أن نتعلم قليلا عن ما يمكن توقعه من خلال النظر في نظرية وبعض النتائج التجريبية. ويعتقد على نطاق واسع أن electroformation يحدث من قبل القيادة تدفق الكهربائية ناضح من عازلة بين طبقات ثنائية الدهون الفردية مكدسة في الفيلم الدهون المودعة 10،11. اقتران كهرباء لتقلبات الحرارية للطبقات ثنائية الدهون وربما أيضا المشاركة 12. هذه الفرضيات التنبؤ نوعيا الحدود العليا لتردد المجال الكهربائي والقوة التي يمكن استخدامها 10،12. على وجه الخصوص، فإنه من المتوقع أن الحلول عالية التوصيل ( أي حلول الملح الفسيولوجية) خفض القوات electrohydrodynamic التي قد تشرع في electroformation الحويصلية 12. انخفاض معدلات تدفق Electroosmotic عموما مع زيادة تركيز الملح وكثيرا ما بلغ ذروته في بعض الكهربائية تيرة التذبذب حقل (على سبيل المثال وإن كان ذلك في الهندسة المختلفة، الأخضر وآخرون 13). وبالتالي، شدة المجال العالي وترددات أعلى معقولة عن حلول الموصلية عالية، في حدود 10.

ومع ذلك، من المحتمل أن تكون غير متوافقة مع الأسلوب المعتاد لإيداع الدهون على أقطاب لهذا الإجراء electroswelling، وبالتحديد في المذيبات العضوية والتي يتم بعد ذلك تبخرت قبالة لترك فيلم الدهون رقيقة بروتينات الغشاء. هناك مسارين الرئيسي للتغلب على هذه الصعوبة: لإدراج البروتينات بعد تشكيل الحويصلية العملاقة، أو للتكيف مع الطريقة التي أودعت الدهون. نهجنا يبني على الآخرين 5،11 لإيداع الدهون وreconstituted بروتين غشاء معا من تعليق "proteoliposomes" صغيرة أو كبيرة. نحن تصف عملية طويلة وأكثر تحديا من إنتاج proteoliposomes من تنقية البروتين والدهون في مكان آخر (كولينز وغوردون، في الاستعراض). نحن هنا وصف بروتوكول في غياب أي بروتين، ولكنه هو نفسه عندما تم دمج بروتين، ونحن وتشمل النتائج تبين أن proteoliposomes تحتوي على قناة TRPV1 أيون يمكن أن تتحول إلى GUVs وتستخدم لالتصحيح، المشبك الكهربية. في أي نهج electroformation، الفحص البصري من العينة الدهون أثناء عملية ترسب الدهون أمر بالغ الأهمية لتحقيق النجاح.

نهجنا قد تكون ذات صلة وراء تطبيق المتخصصة لايون القناة إعادة. في الوقت منذ وضعنا أول هذا البروتوكول والآن، كما تم إثبات أنه الطريقة التي تترسب الدهون على أقطاب لelectroformation يؤثر على التجانس التركيبي للGUVs الناتجة عن ذلك. Baykآل كاغلار وآخرون. أظهرت أن 14 GUVs شكلت من الجسيمات الشحمية بعناية المجففة كان 2.5 مرات أصغر التباين في امتزاج درجة حرارة التحول من GUVs تشكلت من خليط من مختلف الدهون الفوسفاتية والكوليسترول. عملهم يشير إلى أن الدهون، وخصوصا الكوليسترول، قد يعجل من خليط الدهن عندما تودع من المذيبات العضوية، مما أدى إلى التباين المكاني كبير في تكوين الفيلم الدهون المودعة. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للدراسات من الدهون غشاء السلوك المرحلة، ولكن قد يكون أيضا عاملا حاسما للتجارب الكمية على وظيفة القناة الايونية. بايكال-كاغلار وآخرون. 'ق بروتوكول مماثل ولكن ليست متطابقة إلى منطقتنا، ونحن نشجع القراء لدراستها كذلك.

هذا البروتوكول (انظر نظرة عامة، والشكل 1) هو واحد من العديد من التي يمكن استخدامها. في نجاح electroformation مبدأ يعتمد على خليط الدهون، الماء، درجة الحرارة، والمواد المذابة الأخرى (وخاصة أيونات)، وللبالطبع الجهد والتردد المستخدمة في التشكيل. كما يصبح electroformation فهم أفضل، ونحن نتوقع أن صقل بروتوكول لدينا أكثر من ذلك.

وأخيرا، غالبا ما يكون هناك منحنى التعلم حاد في electroforming الجسيمات الشحمية العملاقة. نقترح اتقان بروتوكول التقليدية (الأقسام 1 و 4، وإذا لزم الأمر، القسم 5) قبل أن تعلم أن تودع الدهون من الايقاف الليبوسومال (الأقسام 2-5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ترسب الدهون من المذيبات العضوية: بروتوكول الكلاسيكية

  1. إزالة الدهون من التخزين عند درجة حرارة -20 ° C أو -80 ° C؛ الحارة لRT تنبيه: الدهون هي استرطابي للغاية، والعديد من حساسة للأكسجين. تغطية نسبة الدهون في الأراضي الجافة الأرجون أو غاز النيتروجين وفي جميع الخطوات تقليل التعرض للهواء.
  2. إذا لزم الأمر، تعلق الدهون في الكلوروفورم أو الهكسان الحلقي في ملغ / مل 1-10، علما أن تركيزات الصانع المعلنة هي عادة الاسمية فقط تحذير: ارتداء القفازات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية الأخرى عند استخدام المذيبات العضوية. إزالة معدات الوقاية الشخصية بسرعة في حال تسرب مذيب عليها، لأن معظم المواد لا تزال قابلة للاختراق لهذه المذيبات وأنها توفر حماية مؤقتة فقط.
  3. تنظيف كلا الجانبين من اثنين 25 × 37.5 ملم ITO الشرائح الزجاجية المغلفة مع الإيثانول
  4. مزيج من الدهون لتحقيق نسب المولي المطلوب. لكل سم 2 من مساحة 1 من ITO ينزلق إلى أن تطلى مع شفةمعرف، مزيج ~ ميكروغرام 15-20 من الدهون. على سبيل المثال، إذا كانت كل 25 × 37.5 ملم الشرائح لتكون مغلفة بشكل كامل، فإننا عادة استخدام 30 ميكرولتر من 10 ملغ / مل خليط الدهن ملاحظة: إضافة 0.1 مول٪ تكساس الأحمر DPPE للتصوير الفلورسنت، وانظر أدناه للحصول تحذر من الأصباغ الفلورية.
  5. تحقق من أن الجانب ITO المغلفة من الشرائح الزجاجية يواجه ما يصل عن طريق قياس مقاومة سطح مع جهاز قياس المقاومة أو المتعدد.
  6. نضح في نسبة الدهون في مقاومة المذيبات حقنة تنبيه: لا الغراء أو البلاستيك، وغيرها من السليكوون، يجب الاتصال المذيب العضوي.
  7. مع إبرة حقنة عدم لمس السطح تماما إيتو، تطبق ببطء الدهون تحريك إبرة ذهابا وإيابا عبر الشريحة. تغطية السطح على نحو متساو، وتبحث عن "قوس قزح لمعان" على سطح الزجاج.
  8. ضع الشرائح بسرعة تحت <1 عربة (1 ملم زئبقي) فراغ ل0.5-1 ساعة لإزالة أي أثر المذيبات. فراغ الإفراج مع غاز خامل.
  9. تطبيق طوقا سيليكون، معطبقة رقيقة من السيليكون الشحوم فراغ في كلا الجانبين. ترك 5 مم على الأقل من الشريحة المكشوف تتعرض في نهاية واحدة من الشريحة.
  10. الشروع فورا في القسم 4.

2. إعداد الحويصلية صغيرة للجفاف الشواهد

  1. تحضير خليط الدهن كما في خطوات 1،1-1،4.
  2. تجفيف الدهون باستخدام تيار من غاز النيتروجين أو الأرجون في 10-15 ملم قطر الأنبوب الثقافة. للحصول على كميات صغيرة من الدهون، ≤ 0.5 ملغ، يمكن للفيلم أن يكون الناتج رطب مباشرة بعد وضعه تحت فراغ ل0.5-1 ساعة لإزالة المذيبات المتبقية؛ انتقل إلى الخطوة 2.5. كميات أكبر من الدهون تميل إلى اعتراض المذيبات العضوية في مادة هلامية سميكة، حتى في ظل فراغ، وتجفيد مستعدون بشكل أفضل، وانظر الخطوات 2،3-4.
  3. تعليق الفيلم الدهون المجففة في الهكسان الحلقي، وغطاء مع الأرجون وختم مع سدادة، ووضع أنبوب في كتلة الباردة والتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة الحد الأدنى.
  4. وضع كتلة الباردة وعينة من المادة الدهنية في نظام فراغقادرة على الوصول إلى 100 mTorr. تطبيق فراغ، بل سوف "المماطلة" في حوالي 1 عربة كما يبخر المذيب قبالة. وبمجرد إزالة المذيب تماما (~ 1 ساعة) فراغ تنخفض الى اقل من هذا المستوى. فراغ الإفراج مع غاز خامل وختم الأنبوب أو هيدرات فورا.
  5. في حين أن الدهون هي تحت فراغ، عازلة الماء ديغا باستخدام فراغ وsparging 15-17.
  6. هيدرات الدهون باستخدام العازلة degassed في تركيز النهائي 1-10 ملغ / مل. تسمح الدهون لترطيب ببطء. بعد 30 دقيقة، 1 ساعة، دوامة لتفتيت كتل المتبقية. الانتظار لمدة 0.5-1 ساعة إضافية للسماح لترطيب كاملة. استخدام osmoticant، مثل السوربيتول أو السكروز تصل إلى 200 ملم، لمنع الجفاف الكامل في الخطوات التالية.
  7. إعداد 100-200 نانومتر الجسيمات الشحمية قطرها بواسطة البثق. انظر البروتوكول قذف الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل. لاحظ أنه يجب أن يكون المخزن المؤقت وستكون هناك حاجة أقل من ~ 25 ملم القوة الأيونية، أو بروتوكولات الجهد electroformation خاصة في القسم 4.

3.ترسب الدهون بسبب الجفاف الشواهد من الليبوزومات الصغيرة

  1. تحذير: يتطلب بروتوكول لدينا الدهون إلى وضعها في حالة توازن مع حلول بخار مشبع من الملح لعدة ساعات. ونحن نوصي بشدة أداء البروتوكول في جو غاز خامل، وذلك باستخدام علبة القفازات أو الضميمة مماثلة.
  2. تحذير: إذا إعداد العينات التي تحتوي على البروتينات، وتجنب الجفاف الكامل. هيدرات الغلاف الجوي في أي الضميمة مع كوب من الماء الدافئ، أو المرطب على sonicator. استخدام مقياس درجة الرطوبة لضمان وجود الرطوبة النسبية 30٪ على الأقل. استخدام السوربيتول أو السكروز في المخزن المؤقت الحويصلية الصغيرة كإجراء وقائي إضافي لمنع إجمالي الجفاف.
  3. إعداد محلول الملح المشبع من الرطوبة النسبية الملائمة. الرطوبة الهدف يعتمد على الأسمولية من إعداد حويصلة. للتحضير مع الأسمولية الفسيولوجية، واستخدام 30-45٪ RH، بينما منخفض الاستعدادات حويصلة الأسمولية يمكن أن يكون المجففة بشكل كاف فيالتوازن مع 75-90٪ RH (انظر أيضا الجدول 1).
  4. وضع محلول الملح المشبع والملح الزائد في وعاء قابل للغلق بإحكام مع الرف الداخلية. حاويات المواد الغذائية تجارية للالزبادي والجرانولا تعمل بشكل جيد جدا. استبدال الرف بعد التعبئة، وجعل السائل بالتأكيد هو 5-10 ملم تحت الرف.
  5. نظيفة ITO الشرائح المغلفة كما هو الحال في القسم 1. استخدام المتعدد لتحديد الجانب الذي هو موصل، وتسمية الجانب غير موصل مع اسم العينة.
  6. بخفة الشحوم كلا الجانبين من السيليكون (USP الصف السادس) طوقا (s) مع واحد أو ثقوب متعددة.
  7. ضع الشرائح الجانبية الموصلة حتى على مقاعد البدلاء، وتطبيق سيليكون طوقا (ق) إلى كل الشريحة التي سيتم تطبيقها الدهون، والتأكد من وجود ما لا يقل عن 5 ملم من الشريحة تتعرض في نهاية واحدة للاتصال الجهاز electroformation. تمهيد طوقا لضمان ختم جيدة.
  8. تمييع إعداد حويصلة في منطقة عازلة متسق الضغط التناضحي قليل الملح إلى ~ 1-2 ملغ / مل. نجد أن أعلى concentrations تنتج النتائج السيئة.
  9. تطبيق المادة الدهنية إلى الشريحة في قطرات ميكرولتر 1-10. قطرات أصغر تنتج عادة نتائج أفضل.
  10. ضع الشريحة على الرف الداخلية فوق محلول الملح المشبع وختم الحاوية بإحكام. ترك في RT لمدة 3 ساعة إلى O / N. الحاوية يمكن وضعها في 4 درجات مئوية، ولكن سوف نلاحظ أنه بالنسبة لبعض الأملاح، وRH يعتمد بشدة على درجة الحرارة، وهذا البرد زيادة موازنة الوقت.
  11. قد يكون الفيلم الناتج لمعان قوس قزح طفيفة عليها، ولكن على أي حال يجب أن تظهر المجفف تقريبا. قد تكون الحلول بدءا الاسموزي للغاية من المستحيل حتى يجف تماما لفيلم الدهن، وهذا لن يؤثر سلبا على النتائج.

4. Electroformation من الليبوزومات العملاق

  1. يتم فكها الأفلام الدهون، وخاصة تلك التي يتم تشكيلها من الجسيمات الشحمية المجففة، وبسهولة. هيدرات بعناية كل بئر من خلال وضع 27 G إبرة حقنة على حافة طوقا وتطبيق ببطء العازلة. يمكن مخازنوتشمل المياه، ≤ 200 ملي السكروز، ≤ 1 M السوربيتول و≤ 5 HEPES ملي. أكثر من 10 ملي محلول الملح قد تتطلب بروتوكولات الجهد electroformation بديل. فعم كل طوقا بشكل جيد من قبل ~ 10٪.
  2. ملاحظة: بمجرد أن الدهون هي رطب، والمضي قدما بسرعة من خلال الخطوات المتبقية، منذ الأفلام الدهون تبدأ في delaminate فورا. إلى أقصى حد العائد وحجم إذا يبدأ electroformation فورا.
  3. في اقتراح واحد على نحو سلس، وتطبيق الشريحة ايتو والوجه الثاني في موصل، إلى الأعلى من وحشية. تأكد من أن يكون لا يقل عن 5 ملم من عبء خارج منطقة طوقا والعكس عبء الأول. اضغط بلطف لضمان ختم جيدة.
  4. تنظيف يتدلى اثنين باستخدام الإيثانول والتحقق من أن الجانبين التي تواجه طوقا هي موصل مع المتعدد الخاص بك.
  5. الدائرة يمكن تأمين مزيد مع parafilm أو ضوء كليب ربيع التوتر اذا شئت.
  6. ربط غرفة electroformation إلى مصدر التيار الكهربائي من خلال تأمين الألومنيوم أو النحاس القضبان، "EMI gaskوآخرون رغوة "، أو شريط لاصق موصل إلى السطوح موصل من الشرائح اثنين. نحن نستخدم EMI طوقا رغوة. خطط لرقصة والمشبك وتظهر في الشكل 5.
  7. تحقق من وجود أي تماس كهربائي بين الأسماء، وأن اتصالات الاتصال بشكل صحيح إلى السطوح ايتو، وذلك باستخدام المتعدد.
  8. تسخين غرفة 10 ° C فوق أعلى درجة حرارة انصهار أي من نسبة الدهون في الحاضر؛ على سبيل المثال لDPPC، والحرارة إلى 52 درجة مئوية كحد أدنى، و 10 درجة مئوية فوق درجة حرارة انصهار سلسلة من 42 درجة مئوية.
  9. لمخازن قليل الملح، وتطبيق 10 هرتز موجة جيبية، ~ 0.7 V RMS لكل ملليمتر الفجوة بين اثنين من الأسطح المطلية إيتو، ل60-90 دقيقة. لمخازن عالية من الملح، وبروتوكولات الجهد أخرى ينبغي أن تستخدم (انظر المراجع).

5. التصوير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

  1. صورة الحويصلية باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مكعب مرشح لرودامين أو الأصباغ الحمراء تكساس. يجب أن يكون الحويصلية كروية،في الغالب unilamellar بالعين، وخالية من العيوب مثل "سلاسل" شنقا قبالة الحويصلية.
  2. إذا كانت الجسيمات الشحمية هي صغيرة جدا، استخدام كميات أقل من الدهون.
  3. إذا كان هناك العديد من العيوب أو بعض الجسيمات الشحمية، وهذا قد يكون راجعا إلى نسبة الدهون في مراحل هلام. النظر في رفع درجة الحرارة electroformation.
  4. إذا قليلة أو معدومة الجسيمات الشحمية العملاقة التي تشكلت في كل من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة، والحد من قوة ناضح من المخزن المؤقت الحويصلية، أو زيادة قوة ناضح من المخزن المؤقت electroformation. وتدفق من العازلة في مركزة حل العازلة الخلالي يمكن أن يسبب التبطين من الفيلم الدهون المودعة.
  5. إذا العائد حويصلة، والجودة، أو حجم والفقراء، وأنت شملت أملاح أو مخازن درجة الحموضة في electroformation أو الحويصلية المخازن المؤقتة، والنظر في بروتوكولات الجهد electroformation البديلة. على سبيل المثال، بوت، وآخرون. 11، يوصي البروتوكول الخطوة الثالثة باستخدام 500 هرتز شركة Sinewave، ورفع الجهد من 50-1،300 بي بي / م أكثر من 30 دقيقة، وعقد لمدة 90 دقيقة، فين خفض تردد إلى 50 هرتز أكثر من 30-60 دقيقة. قد تكون هناك حاجة البلاتين أو التيتانيوم الأقطاب في هذه الحالة، ولكن هذا لن يغير كثيرا في البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الأمثلة لدينا، ونحن نستعد الجسيمات الشحمية من خليط من ما يقرب من 55٪ POPC مول (1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-phosphocholine)، 15٪ مول الملوثات العضوية الثابتة (1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-phosphoserine ، 30٪ مول الكوليسترول، و 0.1٪ مول تكساس الأحمر المسمى 1،2-dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE). وقد تم اختيار هذا التكوين ممثلا تقريبا من الدهون عقدة الجذر الظهري 18. ونلاحظ أن 15٪ مشحونة مول الدهون (هنا POPS) بالقرب من حدود ما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت Electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة إلى تقنية مرنة متوافقة مع الدهون المختلفة، والأعمال التحضيرية، ومخازن. التحكم الدقيق في عملية ترسب الدهون هو الأكثر أهمية لتحقيق النجاح. لقد قدمنا ​​أدوات بسيطة لجعل ترسب الدهون رقابة من الاستعدادات الحويصلية صغيرة عملية مباشرة. الرطوبة النسبية أمر بالغ الأهمية لجفاف السليم للالجسيمات الشحمية الأولي، وسوف تختلف القيمة المثلى مع التركيز المبدئي من المواد المذابة في تعليق الحويصلية. مطلوب الرطوبة النسبية أقل ليذوى عينات أكثر ترك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بريان Venema واريك مارتنسون لبناء جهاز electroformation. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM100718 إلى SEG) والمعهد الوطني للعيون التابع لمعاهد الصحة القومية (R01EY017564 إلى SEG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

تقنيات ذلك تعمل تتوفر يمكن

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Digital MultimeterAgilent Technologies ، www.agilent.com< / a>U1232A أو ما شابهذلك ، فإن أي مقياس متعدد سيفي بالغرض ، ولكن تجنب مقاييس الأومتر التناظرية ذات الطراز القديم التي تطبق المزيد من التيار على المقاومة قيد الاختبار.
Fluke117 أو 177أي مقياس متعدد سيفي بالغرض ، ولكن تجنب مقاييس الأومتر التناظرية ذات الطراز القديم والتي تطبق المزيد من التيار على المقاومة قيد الاختبار.
Function GeneratorAgilent Technologies ، www.agilent.com< / a>33210A أو ما شابهمعظم مولدات الوظائف لبروتوكولات بسيطة. هذا النموذج القابل للبرمجة مفيد لبروتوكولات التكوين الكهربائي المتقدمة. تأكد من أن المولد يمكنه دفع 10 فولت من الذروة إلى الذروة إلى 50 &# 937 ؛ تحميل
شرائح الزجاج المطلي ITODelta Technologies ، Loveland ، CO www.delta-technologies.com< / a>CB-90IN-S107 أو ما شابهذلك ، قم بتقسيم هذه الشرائح إلى نصفين لعمل شريحتين ، 25 مم × 37 مم
وحدة تحكم في درجة الحرارةأوميغا الهندسية ستامفورد ، CT www.omega.com< / a> CNi3233 أو ما شابه
ذلك من مقياس الرطوبةExtech ، ناشوا ، نيو هامبشاير ، www.extech.com< / a>445815
لوح مطاط السيليكونMcMaster-Carr Elmhurst ، IL www.mcmaster.com< / a> 87315K64 < / a>استخدم السيليكون USP Grade VI لحشية EMI عالية النقاء
Laird Technologies www.lairdtech.com< / a>4202-PA-51H-01800 أو ما شابه ذلكموزعة بواسطة Mouser www.mouser.com< / a>
TxR-DHPELife Technologies ، Carlsbad ، CA www.lifetechnologies.com< / a>T1395MPدهون أخرى مصنفة فلورسنت ، ولكن TxR-DHPE هي واحدة من ألمع الدهون وأكثرها قابلية للتصوير.
يمكن طلب الدهون POPCAvanti Polar Lipids ، Alabaster ، AL www.avantilipids.com< / a>850457P أو 850457Cطلب الدهون كمساحيق (P) أو في الكلوروفورم (C)
POPSAvanti Polar Lipids840034P / C
الكوليسترولسيجما ألدريتشC8667

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  2. Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
  3. Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  5. Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529(2011).
  6. Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
  7. Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
  8. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  9. Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
  10. Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
  11. Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
  12. Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
  13. Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
  14. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  15. Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
  16. Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
  17. Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
  18. Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
  19. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
  20. Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
  21. Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
  22. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
  23. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
  24. Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  25. Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
  26. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  27. Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
  28. Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
  29. Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
  30. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
  31. Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
  32. Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
  33. Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
  34. Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة