مقالة منهجية

تصميم واستخدام المصفوفات ناظم كيميائي تعدد في الإرسال

24K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50262

⸱

فبراير 23, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genome Sciences, University of Washington

في هذه المقالة

ملخص

قمنا بتطوير والتحقق من صحة مجموعة صغيرة من البصمة الكيموستات مصغرة مبنية من قطع جاهزة للتكلفة منخفضة. وكانت نتائج تطور الفسيولوجية والتجريبية مماثلة لالكيموستات حجم أكبر. مجموعة ministat توفر منصة مدمجة، وغير مكلفة، ويمكن الوصول إليها عن تجارب ناظم كيميائي التقليدية، وعلم الجينوم وظيفية، والتطبيقات الكيميائية الفرز.

الملخص

الكيموستات هي أنظمة المستمر في الثقافة التي تزرع الخلايا في بيئة تسيطر عليها بإحكام ثابتة كيميائيا حيث يتم تقييد كثافة الثقافة عن طريق الحد من العناصر المغذية المحددة. 1،2 البيانات من الكيموستات هي استنساخه للغاية لقياس الظواهر الكمية لأنها توفر معدل نمو ثابت والبيئة في حالة مستقرة. يمكن لهذه الأسباب، الكيموستات أصبحت أدوات مفيدة لغرامة على نطاق وتوصيف علم وظائف الأعضاء من خلال تحليل التعبير الجيني 3-6 و غيرها من خصائص الثقافات في حالة استقرار التوازن .. 7 تجارب طويلة الأمد في تسليط الضوء على مسارات محددة الكيموستات أن السكان الميكروبية اعتماد خلال التطور على التكيف في بيئة تسيطر عليها. في الواقع، وقد استخدمت الكيموستات لتطور التجريبية منذ اختراعهم. 8 A نتيجة مشتركة في تجارب التطور البيولوجي لكل تكرار للحصول على ذخيرة فريدة من الطفرات9-13 هذا التنوع يشير إلى أن لا يزال هناك الكثير ليتم اكتشافها من قبل إجراء التجارب مع تطور الإنتاجية أكبر بكثير.

نعرض هنا تصميم وتشغيل بسيط نسبيا، مجموعة انخفاض تكلفة الكيموستات أو مصغرة ministats والتحقق من صحة استخدامها في تحديد وعلم وظائف الأعضاء في التجارب مع تطور الخميرة. هذا النهج ينطوي على نمو عشرات الكيموستات تشغيلها من واحدة المضاعفة مضخة تمعجية. يتم الاحتفاظ الثقافات في وحدة تخزين العامل 20 مل، والذي هو عملية لمجموعة متنوعة من التطبيقات. ويحدونا الأمل في أن زيادة الإنتاجية، وخفض النفقات، وتوفير بناء على تعليمات مفصلة العملية قد تؤدي أيضا إلى تحريك البحث والصناعية تطبيق هذا التصميم كمنصة عامة لوصف وظيفيا أعداد كبيرة من السلالات والأنواع، وعوامل النمو، وكذلك الوراثية المكتبات أو المخدرات.

المقدمة

ديناميات تطور نمو الجراثيم والأحياء الدقيقة من الأمور الأساسية ل، والبيئة، وعلم الوراثة، والتكنولوجيا الحيوية. الأسلوب الأكثر شيوعا لزراعة الميكروبات في دفعة، حيث يتم تلقيح خلايا في منخفض الكثافة في المواد الغذائية الغنية مرق ونمت لالتشبع. على الرغم مباشرة لأداء باستخدام معيار المعدات المختبرية والثقافات دفعة تواجه بيئة الكيميائية تقلب وتغير تبعا لعلم وظائف الأعضاء الخلوية. وهذا يمكن أن البيئة غير متجانسة النمو يؤدي إلى آثار النمو والتوتر التي يمكن أن تحجب الثانوية الاختلافات الفسيولوجية خفية. يمكن تطور التجريبية عن طريق التحويل دفعة مسلسل الاختيار لمخاليط معقدة من النمو التدريجي مجموعات سكانية فرعية محددة، يعقد محاولات للاتصال التكيف مع الظروف انتقائية محددة. يمكن قياس الظواهر الكمية يكون من الصعب بسبب الضوضاء من عينة غير دقيقة وتوقيت الاختلاف في بعض السمات، مثل الوقت الضائع. الثقافات المستمر توفير بديلالنظام النمو حيث يمكن الخلايا المزروعة في بيئة بتكاثر متجانسة كيميائيا بمعدل نمو محدد للوصول إلى حالة فسيولوجية ثابتة. وبسبب هذه المزايا، والدراسات التجريبية والتطور توصيف الدولة الخلوية غالبا ما تستخدم في بيئة تسيطر عليها الثقافات مستمرة مثل ناظم كيميائي 14

التقدير من هذه المزايا أدت إلى عودة الاهتمام في الثقافات ناظم كيميائي. 15 قتيلا منذ بدء العمل بها في عام 1950، تم وضع نظم ناظم كيميائي 1،2 لتعمل على مجموعة متنوعة من المقاييس التي تتراوح بين لتر إلى لmicroliters ومجموعة متنوعة من التطبيقات 16 -19 هذه التصاميم المختلفة، والتي تتراوح من المفاعلات الحيوية المنتجة تجاريا للسفن glassblown إلى منصات مخصصة على microfluidics، حصة مبادئ التصميم العام. يحرك A غرفة الثقافة والهوائية (عادة فقاعات الهواء من خلال ذلك)، وبقي ما الميكروبات الواردة فيه متجانسةفرقت لي غرفة في جميع أنحاء الثقافة في جميع الأوقات. يضاف المتوسطة جديدة من تكوين مستمر ويعرف معدل بالإضافة إلى ذلك يتحكم معدل النمو ويؤثر على البيئة الكيميائية التي يمر بها الثقافة. تجاوز حجم يضع الثقافة في أنبوب النمو، ومن خلال هذا الفائض سيتم أخذ عينات ثقافة في نفس المعدل الذي يدخل الطازجة المتوسطة. وبهذه الطريقة الوصول بسرعة الثقافات دولة الفسيولوجية التي ثابتا عند العديد من العوامل البيولوجية تظل ثابتة. على الرغم من مزايا الكيموستات والتقارير المقدمة من هذه المنصات المختلفة في الأدب، وقد تم اعتماد واسع النطاق من قبل تقتصر الصعوبات في بناء وتشغيل هذه النظم، وارتفاع التكاليف المرتبطة الخيارات التجارية. وعلاوة على ذلك يمكن وصف كيفية صنع واستخدام هذه الأجهزة تكون مبهمة.

نقدم تصاميم وتعليمات لاستخدام مجموعة صغيرة من البصمة الكيموستات مصغرة مبنية من قطع متوفرة بتكلفة منخفضة. نحن OBServe المعلمات التجريبية متسقة للغاية والنتائج استنساخه عند مقارنة جهدنا لجهاز البيانات المبلغة عن الخميرة مثقف في حجم أكبر المفاعلات الحيوية التجارية. وهذا يشمل استنساخ لفيزيولوجيا الخلوية كما يتضح من خلال الوصول إلى حالة استقرار التوازن خلال 10-15 الأجيال والحصول على كثافة مماثلة في الثقافة التوازن. بالإضافة إلى ذلك، وأنماط التعبير الجيني بين تتفق ministats والتجارية منصة أكبر الحجم. استقرار معدل التخفيف، والكثافة البصرية استنساخ التعبير الجيني بين ثلاث ثقافات تكرار إظهار متانة برنامجنا. نعرض أيضا أن الطفرات تنشأ على نفس التكيف مماثلة الجداول الزمنية تطور التجريبية كما هو الحال مع الكيموستات حجم أكبر.

البروتوكول

استخدام تقنية معقمة مناسبة في جميع أنحاء البروتوكول.

1. تجميع قطع غيار للوإعداد مصفوفة Ministat

  1. من أجل جميع أجزاء.
  2. تنظيف أنابيب زجاجية. بمناسبة أنابيب في حجم 20 مل.
  3. جعل الجمعيات الفلين مع الهواء، ووسائل الإعلام، ومنافذ الصرف ووضعها في الجزء العلوي من أنابيب زجاجية الثقافة تنظيفها.
  4. إعداد غرف الرطوبة وترتيب جميع الأجزاء غير تعقيمها.
  5. جعل الهواء، النفايات السائلة، وأنابيب سائل الإعلام واستخدام أطوال أنابيب كافية وصلات متوافقة.
  6. ربط كل نوع من الأنابيب (الهواء، ووسائل الإعلام، والنفايات السائلة) إلى جمعيات الفلين والمرشحات واحباط وسائل الإعلام. السريع الاتصال إعدادهم للالأوتوكلاف
  7. إعداد الدامجانة زجاجة كبيرة للاستخدام في صنع العقيمة المتوسطة ناظم كيميائي.
  8. إعداد زجاجات أخذ العينات عن طريق إدراج ثقافة سدادة مطاطية لمدة حفرة مع التجهيزات المناسبة. احباط كل مرشح لإعدادهم للالأوتوكلاف.
  9. فاير تجميعها بدقة إلى مجموعة صواني الأوتوكلاف واحد أو أكثر والأوتوكلاف جميع أجزاء.
  10. وجعل وسائل الاعلام تصفية ناظم كيميائي في قوارير تعقيمها.

2. إعداد تجربة

  1. قارورة الماء ملء كل مع 700 مل O. 2 DDH
  2. وضع ministats تعقيمها في التدفئة مجموعة كتلة في درجة الحرارة المطلوبة.
  3. وضع شركات الطيران في مشعب 4-الميناء وتشغيل مضخة الهواء.
  4. توصيل خطوط مياه الصرف إلى جمع زجاجات 100 مل.
  5. إزالة احباط من نهاية الأنبوب وسائل الإعلام وسائل الإعلام والاتصال الدامجانة زجاجة كبيرة وسريعة تربط 2. الخيط طول كل أنبوب مضخة من خلال خرطوشة مضخة تمعجية وفوق عليها في مكانها. تشغيل المضخة وسائل الإعلام.
  6. السماح للغرف ملء. إيقاف تشغيل مضخة سائل الإعلام.
  7. رش الجمعيات الفلين مع الايثانول 70٪ وتطعيم الثقافات باستخدام حقنة. حفظ عينة من اللقاح باعتباره الأسهم المجمدة الجلسريناذا شئت. اسمحوا الثقافات تنمو لمدة 30 ساعة.
  8. ضبط ارتفاع الإبرة النفايات السائلة حتى يتم تعيين وحدة التخزين إلى 20 مل ثقافة مع تدفق الهواء إيقاف. قد يستغرق ذلك عدة تعديلات على مدار الساعة. عندما أنهى تحويل تدفق الهواء مرة أخرى.
  9. تحويل وسائل الإعلام على مضخة.
  10. إفراغ زجاجات أخذ العينات السائلة والتي تحتوي على وسائل الإعلام التي تم جمعها أثناء إعداد حجم ثقافة العمل، وتسجيل الوقت.
  11. الى شغل مقعد قياس الوقت من الصفر خطوط أنابيب مياه الصرف في جمع معقمة لمدة 15 دقيقة-2 ساعة (اعتمادا على حجم ما كنت ترغب في عينة لتحليل DNA). أيضا جعل الأسهم المجمدة الجلسرين لكل ثقافة في هذا الوقت اذا شئت.

3. القياسات اليومية

  1. كما هو الحال مع قياس الوقت صفرية الخاص بك، عينة على الجليد للموارد البشرية مين 2 15 (حسب الاقتضاء لتجربتك) على الجليد وتسجيل الوقت لأخذ عينات DNA والعينات المجمدة الأسهم.
  2. لعينات الحمض النووي الريبي جمع إما المجلد الصغيرةUME باستخدام حقنة وإبرة 22G 5 "من ثقافة أو نزع السدادة كل ministat لحصاد ثقافة بأكملها. يجب أن تؤخذ العينات بسرعة، جمعت من قبل الترشيح، وعلى الفور تجميد في النيتروجين السائل.
  3. قياس النفايات السائلة التي تم جمعها منذ آخر أخذ العينات لكل لقياس معدل ministat التخفيف. ضبط معدلات التخفيف إذا لزم الأمر من خلال تصحيح وضع مضخة أو ضبط غرامة على خطوط ضبط مضخة الفردية.
  4. استبدال خطوط الصرف في زجاجات فارغة جمع.
  5. تحديد خلية / مل وكذلك نقاط النهاية الأخرى ذات الاهتمام وجعل الأسهم الجلسرين المجمدة.

4. بعد تجربة تنظيف

  1. إخضاع جميع أنابيب في صواني منفصلة وشطف بشكل مفرط مع DDH 2 O. الجافة باستخدام أنابيب مضخة ماء.
  2. تنظيف الفلين مع جمعيات DDH 2 O واستخدام إدراج إبرة لتنظيف الإبر، والشفط والاستغناء المياه بدورها. مسح السطح الخارجي للالإبر والفلين لإزالة أيالمتبقية وسائل الإعلام.
  3. تكور تنظيف أنابيب الزجاج مع الماء والإيثانول، وإزالة الملوثات المادية مع 3 حتى Kimwipes وملقط.
  4. شطف وتجفيف جميع أنحاء مرة أخرى قبل الاستخدام.

النتائج

وصف مجموعة ministat أعلاه وفي (الشكل 1A، B) تم استخدامه لثقافة فرداني سلالة المختبر ماتا من الخميرة في مهدها (S288c) تحت ظروف منظم للكبريتات كما هو موضح سابقا. اختبار فعالية 10 نحن لتطبيقات ناظم كيميائي المشتركة بما في ذلك تحديد وظائف الأعضاء التجريبية التطور. للتحقق من صحة ministats، كررنا عدة تجارب أجريت سابقا في fermentors الصناعية المحورة المراد استخدامها ناظم كيميائي. تم تشغيلها 10،20،21 ATR Sixfors fermentors في حجم 300 مل العمل، أكثر من عشر مرات حجم من ministats، ولها أوضاع مختلفة إلى حد كبير من تهوية الثقافة والانفعالات. حاولنا لتكرار الاستقرار المعدات وعلم وظائف الأعضاء ثابت الدولة، النتائج التجريبية التطور، وأنماط التعبير الجيني تم الحصول عليها مع هذه fermentors.

منذ توحيد معدل التخفيف والتهوية هي جوانب هامة من تصميم ناظم كيميائي، ونحن ليasured معدل التخفيف الفعلي عبر 32 ministats بعد 15 أجيال من النمو ووجد أن هدفا مع معدل التخفيف بنسبة 0.17 المجلد / ساعة (4-5 قطرات / دقيقة) ونحن تحقيقها معدل التخفيف متوسط ​​0.17208 مع انحراف معياري من 0،0075 عبر 32 مكررات. كان ضمن هذا النطاق تسامحنا نموذجية من الفرق + المجلد / ساعة / -0.01 من تحديد الأهداف، والتي تتجاوز وقد لوحظت تغييرات واسعة في التعبير الجيني. 22-23 عبر 4 ministats تم تحديد معدل التدفق الجوي ليكون 307.5 مل / دقيقة مع انحراف معياري 9.57 مل / دقيقة. هذا يشير إلى أن تدفق الهواء في غرف قوية ومقسمة بالتساوي بين الغرف 4 و هو قيمة مماثلة لتلك التي وصفها لتهوية صناعية في fermentors 20

لاحظنا سابقا التضخيم المتكررة للSUL1 عالية تقارب نقل الكبريت في أيون 8/8 تجارب تطور سلفات محدودة في الخميرة 10 ونظرا لاتساق النتائج في إطار ثيS حالة اخترنا كبريتات-على سبيل الحصر، اختبار قدرة نظامنا على. ومن العناصر اللازمة للثقافة ناظم كيميائي هو الحاجة للحفاظ على البيئة الكيميائية ثابتة. تقلبات في وفرة من التغييرات الحد المغذيات أو غيرها في البيئة يؤدي عادة إلى تغيير في عدد الخلايا في ثقافة معينة. قمنا بقياس الكثافة الضوئية كبديل لعدد الخلايا (الشكل 2A) واستنساخ المقاسة في 16 تكرار الثقافات، وإيجاد A600 متوسط ​​1.12 (~ 10 9 خلايا) بعد أجيال من النمو 15 ~ مع انحراف معياري من 0،057 وحدة، أو 5.1 ٪. على سبيل المقارنة، أظهرت القياسات المأخوذة من 4 الثقافات تكرار تزرع في fermentors الصناعية انحراف معياري قدره 2.5٪. كانت الخلايا الجيدة الخلط في غرفة النمو: قياسات OD وعدد خلايا مأخوذة من المسار النفايات السائلة كانت تعادل العينات المأخوذة مباشرة من الأنبوب الثقافة (المعطيات غير معروضة). هذه النتائج تثبت متانة برنامجنا علىد القدرة على الحفاظ على بيئة ثابتة الكيميائية داخل التسامح مماثلة لfermentor الصناعية.

ونتيجة لقراءات أكثر حساسية من علم وظائف الأعضاء، قارنا الجينوم على نطاق الجينات التعبير حالة مستقرة من ثقافات نمت تحت قيود كبريتات في ministats وفي fermentor الصناعية. وأظهرت التعبير الجيني في ministats درجة عالية من التشابه في ثلاث مكررات البيولوجية (2B الشكل). وانخفض تعبير عن 99٪ من الجينات لاحظنا سابقا أن لRNA المستمدة من اثنين الكيموستات Sixfors تكرار وشارك في تهجين إلى ميكروأري، ضمن نطاق 1.5 أضعاف، والسماح للاستخدام 1.5X باعتبارها قطع أهمية التجريبية 21 من التعبير الجيني اظهرت ثلاثة ministats تكرار، مقارنة البشرى، 99٪ من الجينات تقع ضمن نطاق 1،5-1،7 أضعاف، مقارنة مع نفس الفترة من fermentors الصناعية. تم تهجين العينات ثلاثة إلى صفائف الفرد ونسب البشرى تحسب بعد ذلك، وبالتالي فإن هذه VAوتشمل زهري بين مجموعة الضوضاء بالإضافة إلى الضوضاء البيولوجية، المبالغة في تقدير احتمال الاختلاف بين مكررات بالمقارنة مع النتائج المنشورة المشترك المهجنة. وأعرب عن الجينات تفاضلي 138 مكررات بالمقارنة> 1.5 أضعاف في جميع ministat ثلاثة إلى جمع عينة من ثقافة المتطابقة تزرع في fermentor الصناعية. وقد أثرى بشكل كبير الجينات انخفضت في التعبير في ministats لاستقلاب الحديد. قد تعكس هذا التوقيع تشكيل المعادن المختلفة لكل تكوين الجهاز: جهاز Sixfors يتضمن المكره المعادن والتجمع تهوية مغمورة في الثقافة، وقوارير وسائل الإعلام تستخدم في السابق مطلوب أيضا معدات معدنية. وتستخدم الإبر ministat الفولاذ المقاوم للصدأ، ولكن لا المكونات المعدنية الأخرى. وارتبطت الى حد كبير مع الجينات التعبير المتزايد مع أغشية الخلايا، على الرغم من الأهمية البيولوجية لهذا الارتباط غير واضح.

وأخيرا، نحن اختبار تجريبي unde التطورR هذه الشروط. بعد مرور 250 أجيال من كبريتات محدودة النمو، أظهرت 4/4 استنساخ اختبار من السكان المستقلة 4 تطور التضخيم من SUL1 والكشف عنها بواسطة التهجين الجينومي المقارن مجموعة (CGH، الشكل 2C). هذه النتيجة تتفق مع النتائج في الكيموستات حجم أكبر على فترات زمنية مماثلة 10

figure-results-1
تصميم الشكل B. 1. A. تصميم وترتيب مجموعة ministat. للغرفة الثقافة.

figure-results-2
الشكل 2. A. Experimental البيانات تظهر أن الثقافات وصول إلى التوازن في غضون عشرة أجيال من النمو (ن = 16). البيانات التعبير B. لمدة ثلاثة مكررات البيولوجية S1-3 عينات أثناء حالة مستقرة تحت قيود سلفات مقارنة مرجعية مشتركة نمت في ناظم كيميائي المتطابقة Sixfors سلفات محدودة جيم التكبير SUL1 تعافى في ministats بعد 250 أجيال من النمو في بيئة سلفات محدودة. تمت مقارنة الحمض النووي الجيني من كل استنساخ DNA تطورت لأجدادهم من قبل CGH كما هو موضح 21 متوسط ​​عدد النسخ تم حساب لكل منطقة تضخيمها ويظهر بجانب كل AMPLICON. تودع جميع البيانات في قاعدة البيانات ميكروأري GEO تحت GSE36691 الانضمام. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

المناقشة

زراعة ناظم كيميائي في ministats، كما هو الحال مع أي ناظم كيميائي، يتطلب الاهتمام بالتفاصيل والاضطراب اطلاق النار. منذ التلوث هو مصدر قلق كبير في تجارب زراعة مستمرة، ونحن نتطلع في المعتاد من خلال المجهر للتلوث الجرثومي والفطري عند التلقيح وكل الأجيال خلال 50 تجارب التطور الطويل الأمد. حتى الآن نحن لم يلاحظ التلوث عبر التجارب تطور 96 من أكبر من 300 الأجيال (المعطيات غير معروضة). لاختبار التلوث المتبادل بين ministats واحتمال لاستعمار الميكروبات للغرفة الثقافة عن طريق خط الصرف ركضنا 16 ministats بحيث تم تلقيح كل ministat أخرى مع الخميرة وكما سبق لم تلقيح ما تبقى مع أي ثقافة. وأخذت عينات من الثقافات في وعاء النفايات البلدية، الذي أفرغ كل يوم. وبالتالي إذا كان من الممكن للملوثات للدخول من خلال خط الصرف كنا المرجح لاحظ أنه في هذه experimالأنف والحنجرة. خلال ثلاثة أسابيع، وأكبر من 100 أجيال من النمو في هذا النمط من الثقافات تلقيح الشطرنج وغير الملقحة، ونحن لم نلاحظ النمو في غير تلقيح أنابيب الثقافة ministat، مما يشير إلى أن التلوث من الخميرة أو الميكروبات الأخرى خارج من غير المرجح أن يحدث في تجارب اطر زمنية مماثلة.

على الرغم من تصميم ministats للعمل بطريقة مشابهة لالكيموستات التجارية، وطبيعة وحدات من هذا الترتيب يسمح لتعظيم الاستفادة لتناسب احتياجات المستخدمين والميزانية. يمكن للمضخة تحوي المستخدمة في هذا البروتوكول تحقيق معدلات التدفق بين 0،0186 المجلد / ساعة إلى 3.6 المجلد / ساعة (لا تظهر البيانات). ويمكن تحقيق زيادة الرقابة على أسعار التخفيف مع نماذج مضخة بديلة. لاحظ أن العملية في انخفاض معدلات التخفيف قد تتطلب استبدال إبرة قياس أعلى لتحقيق نفس التردد من تسليم الحبرية. حجم السكان هو أحد الاعتبارات الهامة لتصميم التجارب السليم للتطور.معدل تخفيف تركيز المغذيات القياسية والمستخدمة هنا يوفر الحجم السكاني الكبير نسبيا (~ 10 9 خلايا) من نفس النظام من حيث حجمها الدراسات المنشورة التطور. يمكن الإبقاء السكان 11 أكبر أو أصغر من خلال تغيير حجم العمل أو الحد من تركيز المغذيات. ويمكن أيضا زيادة إمدادات طفرة يمكن الحصول عليها من خلال العمل مع سلالات ذات معدلات مرتفعة الطفرة.

يمكن أيضا أن تتحسن أكثر من ministats دينا تصميم الحالي. ليمكن التكثيف المثال جمع على جدران أنبوب الثقافة وتقلص إلى حد كبير ويمكن باستخدام بالحمام المائي العميق، حاضنة، أو ثابت درجة حرارة الغرفة. على الرغم من تراكمها والنمو في الثقافات الجدار محدودة كبريتات يبدو أن نادر نسبيا، والتي تظهر تطور في التجارب 5/48 بنسبة 300 الأجيال (البيانات لا تظهر)، ومجموعة متنوعة من السطحي المتاحة التي قد تساعد في خفض أو تأخير هذه الصفة. في حالة التثاقل يتداخل مع الثقافة الكافيةويمكن تحقيق الاختلاط والاضطراب عن طريق الحد من زيادة عدد من الطرق وينقسم كل مضخة الهواء، أو عن طريق إضافة أجهزة التحريك. ويمكن أيضا تحقيقات إضافية لتركيز الغاز المذاب، ودرجة الحموضة، أو غيرها من المعالم إدراج، كما هو الحال في بعض التصاميم الأخرى 17

على الرغم من التعديلات المحتملة، وذلك باستخدام ministats كما هو موضح في هذا البروتوكول، لاحظنا المعلمات التجريبية متسقة للغاية والنتائج استنساخه عند مقارنة جهدنا لجهاز البيانات المبلغة عن الكيموستات حجم أكبر التجارية. هذا وشملت استنساخ لفيزيولوجيا الخلوية كما يتضح من خلال الوصول إلى حالة استقرار التوازن خلال 10-15 الأجيال (الشكل 2A) والحصول على كثافة مماثلة في الثقافة التوازن. كانت أنماط التعبير الجيني متسقة عبر ثلاث مكررات البيولوجية في ministats وبين ministats والتجارية الكبيرة الحجم منصات (الشكل 2B)، مع استثناء من الجينات استقلاب الحديد. هذه إكسبهي سبب الخلافات المرجح ression من التغييرات في محتوى المعادن من الجهازين أو تحسينات في نوعية المكونات وسائل الإعلام. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن ministats ستكون مفيدة للتجارب علم وظائف الأعضاء أو المنافسة التي تتطلب بيئة متناسقة.

لاختبار إذا كان تصميم ministat كافية للتطبيقات التجريبية تطور الثقافات تطورت ونحن تحت قيود سلفات ل 250 الأجيال وتستخدم لوصف CGH التضخيم في مكان الجريمة SUL1 - وهو السمة المميزة لتطور طويل الأمد في ظل هذه الظروف في الكيموستات أكبر حجم من 10 لاحظنا التضخيم من SUL1 في استنساخ من 4/4 تجارب تطور مستقل في وسائل الإعلام سلفات محدودة (الشكل 2C). ككل هذه البيانات تشير إلى أن ministats هي منصة القوية التي قد تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات التقليدية ناظم كيميائي. على الرغم من أننا أظهرت استخدامها في زراعة الخميرة في مهدها، ينبغي للministatsكما تكون متوافقة مع غيرها من الكائنات والتصاميم مماثلة في الواقع لقد استخدمت لزراعة البكتيريا والخميرة الأنواع الأخرى. 16،17،25 وعلاوة على ذلك حجم أصغر الثقافة وترتبط الحاجة انخفضت لوسائل الإعلام أن تقدم بديلا جذابا ministats للتجارب التي تتطلب باهظة الثمن أو غريبة الكواشف يمكن أن يكون كما هو الحال في شاشات كيميائية أو وراثية.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد إنشاء الفيديو من المنح المقدمة من المركز الوطني لبحوث الموارد (5P41RR011823-17) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (8 P41 GM103533-17) من المعاهد الوطنية للصحة. كما أيد هذا العمل من قبل NSF منحة 1120425. MJD هو ألين ريتا مؤسسة الباحث. ويدعم AWM في جزء من المعاهد الوطنية للصحة HG00035 T32. نشكر آنا صن شاين للمساعدة في تحسين البروتوكولات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نعترف سارة DiRienzi، باين سيليا، وSirr ايمي كمستخدمين في وقت مبكر من ministats.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
3/32 "× 7/32" سيليكون أنابيب VWR 63009-260 أنابيب: طلب: (حزمة 50 'لفائف)
1/2 "X 5/8" أنابيب السيليكون (كبير جدا) VWR 63009-299 أنابيب: طلب: (حزمة 50 'لفائف)
1/4 "X 3/8" أنابيب السيليكون (متوسطة) VWR 63009-279 أنابيب: طلب: (حزمة 50 'لفائف)
البرتقال الأخضر أنابيب مضخة marprene واتسون، مارلو 978.0038.00 + أنابيب: Order: 6X (حزمة من 6)
أنثى الأنبوب، 1/8 "بارب كول Parmer HV-45500-04 موصلات: طلب: 4X (حزمة من 25)
ذكر بالتركيبة القفل، 1/8 "بارب كول Parmer HV-45503-04 موصلات: طلب: 1X (حزمة من 25)
الحد من الموصل، PVDF، 1/4 "ل1/8" كول Parmer EW-30703-50 موصلات: طلب: 1X (حزمة من 10)
الشائكة Y موصل، 1/8 "ID كول Parmer HV-30703-92 موصلات: طلب: 3X (حزمة من 10)
المشابك الأنابيب المتوسطة VWR 63022-405 المشابك: طلب: 1X (حزمة من 12)
اليوم Pinchcock (المشبك المعدني للأنابيب) VWR 21730-001 المشابك: طلب: 1X (حزمة من 10)
ذكر المضمنة المزودة بصمامات السريع الموصل، يناسب أنابيب: 1/4 بوصة الصياد 05-112-39 موصلات: طلب: 1X (حزمة من 25)
المزودة بصمامات المضمنة الإناث السريع الموصل، يناسب أنابيب: 1/4 بوصة ID، مادة البولي بروبيلين الصياد 05-112-37 موصلات: طلب: 1X (حزمة من 5)
مضخات الهواء الصامتة الحوض Guys.com 212422 العرض الجوي: وسام: 4 مضخات
مرشحات PTFE، 0.45 ميكرومتر، لتنقية الهواء كول Parmeص HV-02915-22 العرض الجوي: طلب: 1X (علبة 100)
1L قارورة مع أسلحة شخصية الصياد 10-181F العرض الجوي: طلب: 2X (حزمة من 6)
# 8 سدادة السيليكون، 3/8 في حفرة، لقوارير أسلحة شخصية الصياد K953715-0801 العرض الجوي: وسام: 8 سدادات
4-ميناء المتعددة كول Parmer EW-06464-85 العرض الجوي: وسام: 8 الفتحات
55 مل غطاء أنابيب برغي الثقافة كورنينج العلوم الحياتية 9825-25 غرفة الثقافة: طلب: 2X (حزمة من 48)
إبرة تحت الجلد العادية محور البيضاء، 16G، 5 بوصة طول الخط لمياه الصرف الصياد 14-817-105 غرفة الثقافة: طلب: 1X (علبة 100)
إبرة في العمود الفقري الحنفية VWR BD40836 غرفة الثقافة: طلب: 4X (حزمة من 10)
إبرة تحت الجلد العادية الوردي الصياد 14-817-104 غرفة الثقافة: طلب: 1X (علبة 100)
رغوة حجم سدادة سيليكون "2"، والوردي كول Parmer EW-06298-06 غرفة الثقافة: طلب: 2X (حزمة من 20)
8-حسنا أنبوب الرف VWR 82024-452 غرفة الثقافة: وسام: 4 رفوف
10L زجاجة مع مخرج الخزان السفلي خرطوم: آمنة فراغ VWR 89001-530 وسائل الاعلام: وسام: 2 أو أكثر
أصفر سدادة سيليكون رغوة، غير القياسية حجم 12 كول Parmer EW-06298-22 وسائل الاعلام: وسام: 2 أو أكثر
الدامجانة زجاجة كبيرة التنفيس تصفية الصياد SLFG 050 10 وسائل الاعلام: وسام: 1X (حزمة من 10)
الشريط الكهربائية والأخضر Amazon.com 10851-BA-10 وسائل الاعلام: وسام 1 لفة.
تصفية زجاجة الأعلى، 1L، 0.2 ميكرون، 45 مم VWR 29442-978 وسائل الاعلام: ترتيب ب: (1 حالة 12)
5000 زجاجة مل خزان أسفل مع مخرج: vacuأم آمنة VWR 89003-384 وسائل الإعلام: (اختياري)
الزرقاء سدادة سيليكون رغوة، nonstandardsize 10 1/2 كول Parmer EW-06298-18 وسائل الإعلام: (اختياري)
205S/CA16، ومضخة خرطوشة 16 واتسون، مارلو 020.3716.00A وسائل الإعلام مضخة: ترتيب: 1
16-قناة مضخة ملحق 205CA رئيس واتسون، مارلو 023.1401.000 وسائل الإعلام مضخة: طلب: رؤساء مضخة التمديد 2
سيليكون الحوض السداده الصياد S18180B وسائل الإعلام مضخة: ترتيب: 1
6 حمام كتلة جافة VWR 12621-120 Heatblock: ترتيب: 2 لمدة 32 أو 1 ministats لمدة 16.
كتلة لdrybath، 6 أنبوب الاختبار X 25 مم في كتلة VWR 12621-120 Heatblock: ترتيب: 12 ministats لمدة 32 أو 6 لمدة 16.
غشاء فلاتر النايلون، 0.45 ميكرون حجم المسام؛ ضياء: 25 مم. الصياد R04SP02500 الحصاد: طلب: 1X (علبة 100) (اختياري)
غشاء فلاتر النايلون، 0.45 ميكرون حجم المسام؛ 45 مم الصياد R04SP04700 الحصاد: طلب: 1X (علبة 100) (اختياري)
47، كبيرة مم جهاز تصفية الصياد XX10 047 30 الحصاد: طلب: 1 (اختياري)
غلاSS تصفية حامل، 25 مم، جهاز التصفية الصغيرة VWR 26316-692 الحصاد: طلب: 1 (اختياري)
ديوار قارورة، 1L لالنتروجين السائل VWR 63380-052 الحصاد: طلب: 1 (اختياري)

المراجع

  1. Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  2. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
  3. Daran-Lapujade, P., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
  4. ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
  5. Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  6. Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
  7. Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
  8. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  9. Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
  10. Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303(2008).
  11. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  12. Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056(2011).
  13. Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. Genetics. 116, 349-358 (1987).
  14. Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
  15. Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture - making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
  16. Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
  17. Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. , (2012).
  18. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  19. Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  20. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
  21. Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
  22. Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107(2006).
  23. Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4(2007).
  24. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  25. Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Mini Statsمضخة 연動يةالتطور التجريبيمستنبت الخميرةحجم المستنبتمعدل تدفق الوسط الغذائيترطيب الهواءزجاجات أخذ العيناتالتعقيم بالموصدة
تصميم واستخدام المصفوفات ناظم كيميائي تعدد في الإرسال
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.