يوصف أسلوب لتجميع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان في غرفة الفحص المجهري لدراسات الهجرة حية الخلية. هندسيا يجمع بين البيئة والسطوح المانعة لاصقة المسارات مع التدرجات الحل وبالتالي يسمح احد لتحديد الأهمية النسبية للمنبهات التوجيه.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن الشعور الخلايا وتهاجر نحو تركيزات أعلى من العظة لاصقة مثل البروتينات السكرية من المصفوفة خارج الخلية والعظة للذوبان مثل عوامل النمو. هنا، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لإنشاء تدرجات لاصقة معارضة من العظة وقابل للذوبان في غرفة ميكروفلويديك، والذي يتوافق مع الخلية الحية التصوير. ويعمل A كوبوليمر من بولي-L-يسين والبولي ايثيلين جلايكول (PEG-PLL) إيقاف فاعلية coverslips الزجاج ومنع غير محددة امتزاز الجزيئات الحيوية والخلايا. وتستخدم الطباعة microcontact المقبل، أو الطباعة الحجرية تراجع القلم لخلق مسارات streptavidin على السطوح تخميلها لتكون بمثابة نقطة لرسو الببتيد المعقدة البيروكسيديز أرجينين حمض الأسبارتيك، جليكاين (RGD) كما جديلة لاصقة. يتم وضع الجهاز على سطح ميكروفلويديك تعديل واستخدامها لإنشاء الانحدار من العظة لاصقة (100٪ RGD لRGD 0٪) على المسارين streptavidin. وأخيرا، يتم استخدام نفس الجهاز ميكروفلويديك لإنشاء معامل ليمث جاذب كيميائيح ومصل بقري جنيني (FBS)، كما جديلة للذوبان في الاتجاه المعاكس من التدرج من العظة لاصقة.
المقدمة
توجه الهجرة الخلية هو خاصية أساسية من العديد من الخلايا وهو أحد الجوانب الرئيسية لكثير من العمليات الفسيولوجية العادية، بما في ذلك التطور الجنيني، والدفاع ضد العدوى والتئام الجروح. وبالإضافة إلى ذلك، والهجرة الخلية كما تلعب دورا بارزا في كثير من الأمراض مثل أمراض الأوعية الدموية، ورم خبيث الخلايا المزمن والتهاب 1،2. في حين أن الولايات الكلاسيكية للهجرة الخلية - الاستقطاب والإرشاد بروز وتشكيل التصاق، وتوليد القوة وتراجع الخلفية - والمقبولة عموما 3،4، كان الكشف عن آليات الزمانية المكانية التي يتم من خلالها تنسيق التكامل إشارة أكثر تحديا.
ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التخميل من زجاج Coverslips مع PLL-PEG-البيوتين
تم تصميم هذه الخطوة إيقاف فاعلية سطح الخلايا بحيث تلتزم وتهاجر إلى مناطق معينة على ساترة الزجاج التي يتم إنشاؤها مع الطباعة microcontract (الخطوة 2-3A) أو تراجع الطباعة الحجرية القلم (الخطوة 3B). لالتخميل، يتم استخدام البوليمر المشترك للبولي-L-يسين (PLL) والبولي اثيلين جليكول (PEG) حيث يتم تطعيم 20٪ من الجزيئات PEG لالبيوتين (PLL-PEG-البيوتين).
- لتنظيف الزجاج coverslips (18 ملم × 18 ملم)، غمر لهم في رفوف في الإيثانول بنسبة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لفهم كيفية دمج الخلايا إشارات المهاجرة 25، وقد وضعنا طريقة لخلايا صورة مع المجهري مضان التي تهاجر في بيئة تتنافس مع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان (الشكل 1). تم إنشاء المسارات التي تحتوي على لاصق streptavidin الفلورسنت وRGD المعقدة البيروكسيديز مع المسارات microcontact المطبوعة وتراجع الطباعة الحجرية القلم (الشكل 2). يشار ناجحة الطباعة microcontact من خط صورة للكثافة مضان عبر المسارات حيث المسارات والمناطق لاصقة مانعة للقاذورات يمكن تمييزها.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا (لزجة-3D من الشرائح الانجذاب الكيميائي Ibidi) لدراسة آثار السطوح معدلة كيميائيا والتدرجات جاذب كيميائي على الهجرة الخلية. هذا الإعداد ميكروفلويديك لا يتطلب تدفق لأن يتم تأسيس التدرج عن طريق الانتشار على طول القناة. هذا مهم جدا لأنه يمكن أن يؤثر على تدفق الهجرة بشكل مختلف الخلايا ببطء مثل الخلايا الليفية التي تشكل الالتصاقات البؤرية مستقر وسريع الخلايا المهاجرة مثل معظم الكريات البيض التي تشكل مجمعات التنسيق ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليست لدينا مصالح تجارية في الكشف عنها.
شكر وتقدير
الكتاب يعترف بتمويل من مجلس البحوث الوطني الاسترالي والصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا وأود أيضا أن أشكر مرفق التصنيع الوطنية الأسترالية للسيد SU-8 لطباعة microcontact. ويدعم SHN من قبل وزارة التعليم العالي وماليزيا يونيفرسيتي سينز ماليزيا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
ملابس
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تلطيخ الغطاء توماس | ساينتيفيك | 8542 E40 | رف غطاء |
| فرن | الموثق | ED 53 سلسلة | |
| رقاقة السيليكون | كويست | 708-007 | البورون مخدر < ؛ 100> رقاقة ، قطر 4 بوصة ، 500 مو ؛ م ، جانب واحد مصقول |
| GM1070 SU-8 مقاوم للضوء | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 المطور | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 عامل معالجة | داو كورنينج | ||
| سيلجارد 184 المطاط الصناعي بريبوليمر | داو كورنينج | ||
| PLL-PEG-البيوتين (20٪) | SuSos AG | PLL (20) -g [3.5] -PEG (2) / PEG (3.4) - البيوتين (20٪) 1 | مجم / مل في PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 ملي مولار في PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 مجم / مل في PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 & mu ؛ ز /&مو; ل في PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 مجم / مل في PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 & mu ؛ M في PBS |
| لزجة الشريحة chemotaxis 3D | نفس | المصدر 80328 | |
| 200 & ل طرف مشطوف أصفر | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| شمع البارافين ، MP 55-57 درجة ؛ C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 & mu ؛ م ناتئ | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| صورة J البرمجيات | المعهد الوطني للصحة | rsbweb.nih.gov/ij/download.html< / a> | |
| المكون الإضافي للتتبع اليدوي | فابريس كورديلي &# 232 ؛ res | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
المراجع
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
