مقالة منهجية

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

DOI:

10.3791/50310

⸱

أبريل 4, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف أسلوب لتجميع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان في غرفة الفحص المجهري لدراسات الهجرة حية الخلية. هندسيا يجمع بين البيئة والسطوح المانعة لاصقة المسارات مع التدرجات الحل وبالتالي يسمح احد لتحديد الأهمية النسبية للمنبهات التوجيه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن الشعور الخلايا وتهاجر نحو تركيزات أعلى من العظة لاصقة مثل البروتينات السكرية من المصفوفة خارج الخلية والعظة للذوبان مثل عوامل النمو. هنا، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لإنشاء تدرجات لاصقة معارضة من العظة وقابل للذوبان في غرفة ميكروفلويديك، والذي يتوافق مع الخلية الحية التصوير. ويعمل A كوبوليمر من بولي-L-يسين والبولي ايثيلين جلايكول (PEG-PLL) إيقاف فاعلية coverslips الزجاج ومنع غير محددة امتزاز الجزيئات الحيوية والخلايا. وتستخدم الطباعة microcontact المقبل، أو الطباعة الحجرية تراجع القلم لخلق مسارات streptavidin على السطوح تخميلها لتكون بمثابة نقطة لرسو الببتيد المعقدة البيروكسيديز أرجينين حمض الأسبارتيك، جليكاين (RGD) كما جديلة لاصقة. يتم وضع الجهاز على سطح ميكروفلويديك تعديل واستخدامها لإنشاء الانحدار من العظة لاصقة (100٪ RGD لRGD 0٪) على المسارين streptavidin. وأخيرا، يتم استخدام نفس الجهاز ميكروفلويديك لإنشاء معامل ليمث جاذب كيميائيح ومصل بقري جنيني (FBS)، كما جديلة للذوبان في الاتجاه المعاكس من التدرج من العظة لاصقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجه الهجرة الخلية هو خاصية أساسية من العديد من الخلايا وهو أحد الجوانب الرئيسية لكثير من العمليات الفسيولوجية العادية، بما في ذلك التطور الجنيني، والدفاع ضد العدوى والتئام الجروح. وبالإضافة إلى ذلك، والهجرة الخلية كما تلعب دورا بارزا في كثير من الأمراض مثل أمراض الأوعية الدموية، ورم خبيث الخلايا المزمن والتهاب 1،2. في حين أن الولايات الكلاسيكية للهجرة الخلية - الاستقطاب والإرشاد بروز وتشكيل التصاق، وتوليد القوة وتراجع الخلفية - والمقبولة عموما 3،4، كان الكشف عن آليات الزمانية المكانية التي يتم من خلالها تنسيق التكامل إشارة أكثر تحديا.

المصفوفة خارج الخلية (ECM) بمثابة الركيزة للالتصاق الخلية، ومن خلال الكيميائية الكامنة 5 و المادية التنوع 6، يقدم العظة الاتجاه للملاحة الخلية 7،8. وبالإضافة إلى هذه العظة لاصقة 9، العوامل القابلة للذوبان 10-12 </ سوب> مثل كيموكينات وعوامل النمو يمكن أن تحدث الموجهة الهجرة الخلية من خلال مستقبلات الإشارات الخاصة بهم وجاذب كيميائي motogenic المصب. حاليا، من غير المعروف ما إذا كان يشير من خلال المشاركة ومستقبلات الالتصاق (أي integrins) أو مستقبلات جاذب كيميائي، مثل مستقبلات التيروزين كيناز (RTK)، هي المهيمنة. ولا هو يعرف ما إذا كان التسلسل الهرمي للأنظمة هي مستقبلات معينة من الخلايا النوع.

الحية المجهري خلية يعطي ثروة من المعلومات التي لا يمكن الوصول إليها في معظم المقايسات ويمكن دمجها مع أجهزة ميكروفلويديك لتوليد تدرجات من ثبتوا العظة وقابل للذوبان 13،14 15 16. الطريقة الموضحة هنا يستخدم سلسلة من الخطوات البسيطة، وأنشأ لتعديل السطح جنبا إلى جنب مع غرفة لميكروفلويديك المتاحة تجاريا لإنشاء فحص التصوير للهجرة الخلية التي يمكن بسهولة أن تنفذ في مختبر البيولوجيا خلية (الشكل 1). وتجميعهاالجهاز ميكروفلويديك والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها على الزجاج (17) والتدرجات من الجزيئات إنتشاري مستقرة للا يقل عن 16 ساعة. ويمكن استخدام هذا النظام لتقنيات المجهر epifluorescence والمتقدمة. على عكس غيرها من الاجهزة الكيميائي 18، هذا النظام هو مناسبة لتسجيل المهاجرة ببطء، والخلايا الملتصقة. الأهم من ذلك أن النظام هو وحدات ويسمح بسهولة إدخال بديلة أو لاصقة قابلة للذوبان العظة الهجرة وفحص أنواع الخلايا المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التخميل من زجاج Coverslips مع PLL-PEG-البيوتين

تم تصميم هذه الخطوة إيقاف فاعلية سطح الخلايا بحيث تلتزم وتهاجر إلى مناطق معينة على ساترة الزجاج التي يتم إنشاؤها مع الطباعة microcontract (الخطوة 2-3A) أو تراجع الطباعة الحجرية القلم (الخطوة 3B). لالتخميل، يتم استخدام البوليمر المشترك للبولي-L-يسين (PLL) والبولي اثيلين جليكول (PEG) حيث يتم تطعيم 20٪ من الجزيئات PEG لالبيوتين (PLL-PEG-البيوتين).

  1. لتنظيف الزجاج coverslips (18 ملم × 18 ملم)، غمر لهم في رفوف في الإيثانول بنسبة 100٪ ووضع رف في الحمام لمدة 30 دقيقة sonicating. تجفيف coverslips الزجاج في الهواء أو تحت تيار من النيتروجين.
  2. المقبل، ويصوتن coverslips الزجاج لمدة 30 دقيقة في هيدروكسيد الصوديوم M 1. بعد ذلك شطف الأسطح الزجاجية بواسطة غمس بعناية رف في كوب مملوء 1.5 L-Q الملة O. 2 H تكرار عملية الشطف باستخدام ثلاث مرات الطازجة الملة-Q H 2 O في كل مرة. تجفيف coverslips الزجاج فيفرن عند 60 ° C.
  3. 1/2 بدلا من الزجاج نظيفة coverslips بشكل فردي في غرفة رطبة، وهو مصنوع من صفيحة مليئة جيدا 24-H 2 جزئيا مع O. بنسبة 15 ميكرولتر من PLL-PEG-البيوتين (1 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني على كل ساترة الزجاج. اتخاذ النصف الآخر من الزجاج coverslips نظيفة المتبقية بعناية وساندويتش الحل PEG. ترك لcoverslips 1 ساعة في غرفة رطبة. حرك بلطف بعيدا coverslips تقع من بعضها البعض دون إلغاء سطح PEG المغلفة وشطف لهم الملة-Q O. 2 H ينبغي أن تنزلق المياه قبالة بسهولة على الجانب PEG المعاملة. إذا لزم الأمر، والهواء الجاف وcoverslips الزجاج على منشفة ورقية مع سطح تعامل تواجه التصاعدي. تخزين coverslips الزجاج داخل مجفف فراغ حتى استخدامها مرة أخرى.

2. تصنيع طوابع للطباعة Microcontact

وصفنا لعمليتين المسارات نمط streptavidin على الزجاج وcoverslips تخميلها. أول واحد، هيئة التصنيع العسكريrocontact الطباعة، يتطلب عادة على درجة الماجستير تصنيع السيليكون الذي يتم تلقي طابع PDMS. في حالتنا، على نمط الطابع PDMS هي 100 ميكرون على نطاق الخطوط التي متباعدة 290 ميكرومتر إلى مركز مركز مع ارتفاع ميزة من 25 ميكرومتر. أدناه، وصفنا لفترة وجيزة كيفية افتعال ماجستير السيليكون مناسبة (2،1-2،3 الخطوة) وختم PDMS (الخطوة 2.4). ومع ذلك، هناك بروتوكولات متعددة للطباعة microcontact وصفها في المؤلفات 19-23، والتي هي مناسبة لطباعة أنماط البروتين على coverslips الزجاج. ويمكن أيضا أن يتم الماجستير المخصصة والتي تم شراؤها من مصادر تجارية.

  1. أولا، قم بتنظيف رقاقة السيليكون (4 "في قطر) من خلال احتضان في حل البيرانا (3:1 الخامس: الخامس من حامض الكبريتيك و 30٪ بيروكسيد الهيدروجين). لمدة 20 دقيقة يشطف جيدا الرقاقة 10 مرات مع 2 MilliQ O. H تجفيف رقاقة في الفرن على 150 درجة CO / N.
  2. شطف رقاقة السيليكون نظيفة وجافة مع الأسيتون 100٪، تليها ايزوبروبيل 100٪. التاليتدور معطف 2 مل من GM1070 SU-8 مقاومة للضوء (Gersteltec SARL) على الرقاقة على 3،100 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية لخلق طبقة سميكة ميكرومتر 25. تخبز ثم العينة على لوحة الساخن في C ° 65 لل5 دقائق تليها 5 دقائق أخرى في 95 ° C.
  3. كشف SU-8 مقاومة للضوء للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية تحت ألواح photomask مع نمط المطلوب (على سبيل المثال باستخدام قناع اليجنر Quintel Q6000) وتكرار هذه العملية الخبز في وصف 2.2. ثم يتم وضع العينة عن طريق غمر الرقاقة في 8-SU المطور (Gersteltec SARL) لمدة 4 دقائق، تشطف في ايزوبروبيل 100٪ ويجفف تحت تدفق النيتروجين. وبالتالي تتم إزالة منطقة مقاومة للضوء SU-8 التي لم تتعرض للأشعة فوق البنفسجية، وخلق نمط معكوس الطابع PDMS.
  4. والخطوة التالية هي أن يلقي طابع PDMS من سيد السيليكون. الأول، مزيج دقيق 1 الجزء (وزن / وزن) وكيل علاج مع 10 أجزاء من المطاط الصناعي سابق البلمرة (Sylgard 184). لإزالة أي فقاعات الهواء، ديغا الخليط داخل مجفف تعلق على خط الفراغل1 ساعة. المقبل، صب المطاط الصناعي PDMS على سيد السيليكون داخل طبق بتري إلى 1 سم في الطول وعن علاج الخليط الماجستير وPDMS في فرن في 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وأخيرا، تتم إزالة الطابع PDMS من سيد السيليكون وخفض لحجم.

3. Streptavidin الزخرفة أو الإشارات لاصق على الزجاج Coverslips تخميلها

بعد تخميل coverslips الزجاج ويتم طباعة أنماط البروتين مع الطباعة microcontact (3A الخطوة) أو تراجع من ركلة جزاء الطباعة الحجرية (الخطوة 3B). في حالتنا، يتم طباعة streptavidin كخطوط، والتي تشكل الأساس لالتدرجات RGD (الخطوة 4). ويمكن أيضا نفس الإجراء يمكن استخدامها لطباعة مصفوفة البروتينات لخلق أنماط لاصقة.

طريقة بديلة لطباعة microcontact للتنميط من الجزيئات الحيوية على السطوح هو تراجع الطباعة الحجرية القلم. في مجمع دبي للاستثمار الطباعة الحجرية القلم، يتم استخدام ناتئ لنقل وحدة تخزين صغيرة من الحل على السطح. حجم الكابولي، والخامسiscosity من الحل، اتصل مرة من على سطح ناتئ، hydrophobicity من السطح والرطوبة في غرفة الطباعة تحديد حجم ملامح المطبوعة. وميزة هذا الأسلوب هو أن يمكن طباعة أنماط مختلفة لكل تجربة، وليس هناك حاجة الى افتعال الماجستير والطوابع. والعيب هو ان الامر يستغرق وقتا أطول لطباعة نمط معين والتي تراجع الطباعة الحجرية أداة القلم يتطلب المتخصصة التي قد لا تكون متاحة في العديد من المختبرات. كان القلم أداة الطباعة الحجرية مجمع دبي للاستثمار التي استخدمناها في NanoeNabler من علم النانو BioForce العلوم. هنا، نحن المطبوعة النقاط الصغيرة التي كانت <10 ميكرومتر في القطر، التي كنا SPT10 الكابولي.

3A. Microcontact الطباعة (μCP) وتقنيات

  1. لتنظيف وجعل الطابع PDMS أكثر ماء، وعلاج الجانب نمط من الطوابع PDMS في الأشعة فوق البنفسجية والأوزون (على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية الأوزون Procleaner من علم النانو BioForce العلوم) مقابل 1.5 ساعة. بدلا من ذلك، استخدام البلازماأنظف لوقت أقصر لنفس الغرض. هذه العملية يخلق أكسدة سطح PDMS 24، مما يحسن من عملية الطباعة.
  2. مباشرة بعد نشر العلاج بالأوزون أو البلازما، مكان و 10 ميكرولتر streptavidin (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) على الطوابع PDMS ويترك لمدة 1 ساعة في غرفة الرطبة (مثل لوحة 6 جيدا ملء جزئيا، انظر الخطوة 1.3) . إذا المسارات يجب أن تكون مرئية تحت المجهر الفلورسنت، واستخدام streptavidin هذا هو مترافق إلى fluorophore مثل streptavidin-AlexaFluor350.
  3. إزالة streptavidin الزائدة من الطابع مع المناديل الورقية والهواء الجاف الطابع لحوالي 1 دقيقة. اضغط برفق على الطابع ساترة الزجاج وPLL-PEG-البيوتين المغلفة.
  4. إذا تم استخدام الفلورسنت streptavidin في 3.a2 الخطوة، ودراسة نمط استخدام تحت ميكروسكوب epifluorescence. تخزين الأسطح المطبوعة داخل مجفف.

3B. تراجع القلم الطباعة الحجرية

  1. الأول، مزيج 1 جزء من 1 ملغ / مل أو streptavidin streptavidin-AlexaFluor350 مع 10 أجزاء من الجلسرين (V / V) وتحميل 5 ميكرولتر من الخليط على ناتئ. ثم تبدأ عملية الطباعة كما هو موضح في دليل تشغيل الطباعة الحجرية أداة القلم مجمع دبي للاستثمار. للحد من حجم البقعة إلى ما يقرب من 5 ميكرون، وضبط سرعة الطباعة، اتصل وقت ناتئ على مسافة السطح أو العمودي للناتئ إلى السطح. في المثال المبين في الشكل 2C، وطبعت في النقاط مع خط الصف والفصل العمود تعيين إلى 10-15 ميكرومتر. هذه المسافة كافية لمنع النقاط من الاندماج في بعضها البعض ولكن يسمح للمشاهدة من النقاط المتعددة في حقل واحد من الإعدادات الأكثر مشاهدة مع المجهر.
  2. تخزين الأسطح المطبوعة داخل مجفف.

4. إنشاء تدرجات لاصق على Streptavidin من الطراز السطوح

نخلق تدرجات لاصقة من البيوتين-RGD على coverslips الزجاج التي يتم بها طلاء مع streptavidin (الشكل 3) أو المشتركntain أنماط streptavidin على coverslips الزجاج تخميلها (الشكل 5). لإنشاء الانحدار السطح، استخدمنا جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا (وتسمى زجة-3D من الشرائح الانجذاب الكيميائي Ibidi) أن يخلق التدرج حل مستقر عن طريق الانتشار السلبي. للتنافس على مواقع الربط streptavidin، لدينا اثنين من العاملين التدرجات معارضة من البيوتين، والبيوتين RGD لم يكن مترافق لRGD (انظر الشكل 1).

  1. الالتزام الزجاج منقوشة أو streptavidin المغلفة-coverslips على الجانب زجة من الجهاز الانجذاب الكيميائي لزجة-3D الشرائح. لضمان عدم وجود تسرب لعدة ساعات، وختم حواف الجهاز مع طبقة رقيقة من الفازلين وتحسنت مع طبقة ثانية من خليط من 1 جزء من الفازلين إلى 1 جزء من شمع البارافين (وزن / وزن).
  2. ملء القناة للجهاز مع 6 ميكرولتر PBS في القناة. ثم ملء خزانين مع 70 ميكرولتر من 0.03 ميكروغرام / ميكرولتر البيوتين-فلوريسئين-4 في برنامج تلفزيوني و 70 و مش؛ لتر من 0.03 ميكروغرام / ميكرولتر البيوتين-RGD في برنامج تلفزيوني، على التوالي. احتضان العينات في RT في الظلام لمدة 1 ساعة.
  3. إزالة حلول البيوتين وشطف بعناية السطح بينما لا تزال تعلق على الجهاز ميكروفلويديك مرتين مع برنامج تلفزيوني. بمناسبة اتجاه الانحدار لاصقة وإذا لزم الأمر، حافظ على بقاء الجهاز مليئة PBS في C ° 4 لولكن تأكد من أن الجهاز لا تجف. إذا لزم الأمر، وتحليل الانحدار لاصقة مع المجهر الفلورسنت.

5. وسمها مع خلايا Fluorophores لايف التصوير الخليوي

وصفت الخلايا مع الأصباغ الفلورية التي تساعد الخلية تتبع تحت المجهر الفلورسنت. تحقيقات شيوعا هي علامات الفلورسنت عضية، مثل Syto 64 الأحمر، التي تصف نواة الخلية. للقيام بذلك، يتم غسلها 1 الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم حضنت مع الأحمر 64 1 ميكرومتر Syto في وسائل الإعلام والثقافة لمدة 45 دقيقة وأخيرا غسلت أخرى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. يرجى ملاحظة أن الخلايا لا ينبغي أن يكونيوضع في PBS لفترات طويلة من الزمن.

الأصباغ البديلة لتتبع الخلايا التي هي سلسلة CellTracker وصمة عار السيتوبلازم ويتم الاحتفاظ أثناء الهجرة الخلية والانقسام. ترنسفكأيشن من الخلايا مع البروتين الانصهار الفلورسنت مفيد جدا لتسجيل توزيعات التحت خلوية من البروتين من الفائدة خلال الهجرة. ومع ذلك، عادة البروتينات الفلورية الصور التبييض أسرع من الأصباغ العضوية بحيث قد الملاحظات على المدى الطويل لن يكون ممكنا.

6. التحميل من الخلايا القابلة للذوبان مع التدرج في الجهاز على microfluidics

  1. عد الخلايا fluorescently وصفت وتنقسم الى اثنين من أنابيب أعداد الخلايا متساوية. غسل و resuspend أنبوب واحد من الخلايا التي تحتوي على وسائل الإعلام مع جاذب كيميائي، مثل النسر انخفاض الجلوكوز في Dulbecco متوسطة التعديل (DMEM) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS). غسل و resuspend الأنبوب أخرى من الخلايا في وسائل الإعلام دون جاذب كيميائي، أي DMEM FBS مع 0٪. تركيز النهائيوينبغي من الخلايا في كل أنبوب تكون 5 × 10 5 خلية / مل.
  2. إزالة كافة الحلول من الجهاز ميكروفلويديك (من الخطوة 4.3) ووضعه على المسرح المجهر (انظر الخطوة 7). تحميل 70 ميكرولتر من الخلايا (5 × 10 5 خلية / مل في DMEM FBS 0٪) إلى واحدة و 70 خزان ميكرولتر من خلايا هيلا (5 × 10 5 خلية / مل في DMEM FBS 10٪) إلى آخر. وضع شريط فضفاضة على الخزانات لتجنب التبخر. إذا الخلايا على السطح قبل المحتضنة قبل التصوير، فإنه من المستحسن أن يتم تحميل خلايا في الجهاز في وسائل الإعلام دون نمو التدرج. ثم يتم وضع الجهاز على المسرح المجهر واستبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام أي التدرج DMEM FBS في واحدة من دون خزان وDMEM FBS مع 10٪ في المجموعة الأخرى.

7. يعيش خلية التصوير وتحليل البيانات

  1. تشغيل المجهر (نيكون تي E) والاحماء المرحلة على الأقل 1 ساعة قبل بدء التجربة.
  2. تأكد من أن قناة للميكرالجهاز هو ofluidic في مجال الرؤية والخلايا هي في التركيز. حدد الصورة المعلمة اقتناء مثل التعرض مرات والمرشحات الفلورسنت، وتسلسل الصور من الميدان مشرق ومضان الذي يلتقط الخلايا والمسارات وكذلك نقاط الوقت وطول تسجيل (مثل كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة).
  3. تحليل البيانات مع برامج مناسبة مثل يماغيج دليل تتبع الانجذاب الكيميائي أو Ibidi وأداة الترحيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم كيفية دمج الخلايا إشارات المهاجرة 25، وقد وضعنا طريقة لخلايا صورة مع المجهري مضان التي تهاجر في بيئة تتنافس مع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان (الشكل 1). تم إنشاء المسارات التي تحتوي على لاصق streptavidin الفلورسنت وRGD المعقدة البيروكسيديز مع المسارات microcontact المطبوعة وتراجع الطباعة الحجرية القلم (الشكل 2). يشار ناجحة الطباعة microcontact من خط صورة للكثافة مضان عبر المسارات حيث المسارات والمناطق لاصقة مانعة للقاذورات يمكن تمييزها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا (لزجة-3D من الشرائح الانجذاب الكيميائي Ibidi) لدراسة آثار السطوح معدلة كيميائيا والتدرجات جاذب كيميائي على الهجرة الخلية. هذا الإعداد ميكروفلويديك لا يتطلب تدفق لأن يتم تأسيس التدرج عن طريق الانتشار على طول القناة. هذا مهم جدا لأنه يمكن أن يؤثر على تدفق الهجرة بشكل مختلف الخلايا ببطء مثل الخلايا الليفية التي تشكل الالتصاقات البؤرية مستقر وسريع الخلايا المهاجرة مثل معظم الكريات البيض التي تشكل مجمعات التنسيق ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليست لدينا مصالح تجارية في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعترف بتمويل من مجلس البحوث الوطني الاسترالي والصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا وأود أيضا أن أشكر مرفق التصنيع الوطنية الأسترالية للسيد SU-8 لطباعة microcontact. ويدعم SHN من قبل وزارة التعليم العالي وماليزيا يونيفرسيتي سينز ماليزيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

ملابس

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تلطيخ الغطاء توماسساينتيفيك8542 E40رف غطاء
فرنالموثقED 53 سلسلة
رقاقة السيليكونكويست708-007البورون مخدر < ؛ 100> رقاقة ، قطر 4 بوصة ، 500 مو ؛ م ، جانب واحد مصقول
GM1070 SU-8 مقاوم للضوءGersteltec Sarl
SU-8 المطورGersteltec Sarl
Sylgard 184 عامل معالجةداو كورنينج
سيلجارد 184 المطاط الصناعي بريبوليمرداو كورنينج
PLL-PEG-البيوتين (20٪)SuSos AGPLL (20) -g [3.5] -PEG (2) / PEG (3.4) - البيوتين (20٪) 1مجم / مل في PBS
FluoresceinSigma469551 ملي مولار في PBS
Streptavidin-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 مجم / مل في PBS
Biotin-4-fluoresceinInvitrogenB-13700.03 & mu ؛ ز /&مو; ل في PBS
Biotin-RGDGenScriptSC12080.03 مجم / مل في PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 & mu ؛ M في PBS
لزجة الشريحة chemotaxis 3Dنفسالمصدر 80328
200 & ل طرف مشطوف أصفرGreiner Bio-One739261
VaselineSigma16415
شمع البارافين ، MP 55-57 درجة ؛ CSigma327204
Nano eNabler 10 & mu ؛ م ناتئ BioForceSPT-S-C-10s
صورة J البرمجياتالمعهد الوطني للصحةrsbweb.nih.gov/ij/download.html< / a>
المكون الإضافي للتتبع اليدويفابريس كورديلي &# 232 ؛ resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
chemotaxis and Migration ToolIbidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271(2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Adhesive GradientSoluble GradientMicrofluidic ChamberPLL PEG PassivationMicrocontact PrintingDip Pen LithographyStreptavidin PatterningBiotinylated RGDFBS GradientLive Cell Imaging

مقالات ذات صلة