تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

ملخص

في هذا الفيديو، ونحن سوف تظهر كيفية تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحد في إعداد الدماغ كله، الذي يحافظ على الدارات العصبية المعقدة. نحن نستخدم الأسماك المعدلة وراثيا التي يتم تمييزها موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (هرمون GnRH) الخلايا العصبية وراثيا مع بروتين فلوري لتحديد الهوية في إعداد الدماغ سليمة.

الملخص

فهم الفيزيولوجيا الخلية من الدوائر العصبية التي تنظم السلوك المعقد هو تتعزز بشكل كبير عن طريق استخدام نظم نموذج التي يمكن من خلالها تنفيذ هذا العمل في إعداد الدماغ سليمة حيث لا يزال الدوائر العصبية في الجهاز العصبي المركزي سليمة. نحن نستخدم الأسماك المعدلة وراثيا التي يتم تمييزها موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (هرمون GnRH) الخلايا العصبية وراثيا مع بروتين الفلورية الخضراء لتحديد الهوية في الدماغ سليمة. وتحتوي الأسماك السكان متعددة من الخلايا العصبية هرمون GnRH، ووظائفها تعتمد على موقعها في المخ والجينات هرمون GnRH التي يبدونها ^1. فقد ركزنا على مظاهرة لدينا GnRH3 الخلايا العصبية الموجودة في الأعصاب الطرفية (TN) المرتبطة بصيلات الشم باستخدام الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا الميداكا (الشكل 1B و C). تشير الدراسات إلى أن الخلايا العصبية الميداكا TN-GnRH3 هي neuromodulatory، بوصفها جهاز إرسال المعلومات من البيئة الخارجية إلى الجهاز العصبي المركزي؛ رمهلا لا تلعب دورا مباشرا في تنظيم وظائف الغدد التناسلية النخامية، كما يفعل المعروفة طائي GnRH1 الخلايا العصبية ^{2، 3.} نمط منشط من إمكانات العمل العفوي إطلاق الخلايا العصبية TN-GnRH3 هو خاصية ذاتية ^4-6، وتواتر الذي هو عن طريق التضمين الإشارات البصرية من conspecifics ² وkisspeptin نيوروبيبتيدي 1 ^5. في هذا الفيديو، ونحن نستخدم خط مستقر من الميداكا المعدلة وراثيا في الخلايا العصبية التي TN-GnRH3 تعبر عن التحوير الذي يحتوي على منطقة المروج من Gnrh3 مرتبطة تعزيز البروتين الفلوري الأخضر ⁷ لتظهر لك كيفية التعرف على الخلايا العصبية ورصد نشاطهم الكهربائية في الدماغ كله إعداد ^6.

البروتوكول

1. تشريح أدمغة من الكبار الميداكا

1. تخدير الكبار من الذكور أو الإناث (الشكل 1A) من تخبط في 5 مل MS-222 (150 ملغ / لتر، ودرجة الحموضة 7.4)؛ الانتظار بضع دقائق بعد توقف الحركات الخياشيم قبل قطع الرقاب. وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام من جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس.
2. قطع رأس السمكة في المياه المالحة الأسماك في نهاية الذيلية للالوصاد مع مقص في قطر 60 ملم طبق بيتري.
3. نقل رئيس الأسماك ليبلغ قطرها 35 ملم طبق بيتري، وشغل نصف مع الأسماك المالحة واصطف مع Sylgard أن لديه الاكتئاب في ذلك لوضع وتأمين الرأس لتشريح الدماغ. موقف وتأمين رأس يصل الجانب الظهري مع دبابيس الحشرات.
4. قطع بعناية الجزء الظهري للجمجمة حول محيطه مع مقص غرامة وإزالة برفق مع ملقط، ويعرض الجزء الظهري من الدماغ بما في ذلك تماما الجزء الأمامي من الحبل الشوكي.
<لى> ارفع الحبل الشوكي بلطف مع ملقط غرامة طرف وقطع الأعصاب الضام الثنائية مع مقص غرامة ذات الرؤوس: الأعصاب القحفية والأعصاب في العمود الفقري، والأعصاب البصرية على الجانب البطني من الدماغ، والأعصاب الشمية في الجزء الأمامي لل الدماغ.
5. وضع الدماغ تشريح كاملة في طبق بيتري جديدة مليئة المالحة الأسماك، والتحقق بعناية تحت المجهر للتأكد من الدماغ كله غير سليمة (بما في ذلك الغدة النخامية) دون أي جروح أو ثقوب. لا تستخدم العقول التالفة للتجريب.

2. تركيب الدماغ في غرفة تسجيل

1. وضع قطرة صغيرة من فورية الغراء أو بعض الغراء سريع المفعول أخرى مع إبرة في وسط غرفة تسجيل ونشر الغراء حوالي 1 سم ^2.
2. نقل بسرعة الدماغ والغراء عليه في موقف ما يصل الجانب البطني.
3. إضافة 1 مل من المياه المالحة الأسماك بحيث يملأ غرفة تسجيل، ويغطي الدماغ. يروي باستمرارالدماغ مع الغازي المالحة الأسماك بمعدل لا يقل عن 200 ميكرولتر / دقيقة.
4. باستخدام ملقط غرامة غيض إزالة بعناية السحايا على سطح منطقة تسجيل من الدماغ.

3. الكهربية

1. فضفاض تسجيل التصحيح من عمل اطلاق النار المحتملة
   1. هي التي شيدت microelectrodes الزجاج (6-10 MΩ) من الماصات الزجاج البورسليكات (1B150F-4، الآلات الدقيقة الدولي) باستخدام مجتذب الكهربائي (مثل سوتر P-87)، وتملأ مرة أخرى مع تسجيل حل فضفاضة التصحيح في منتصف الطريق حتى القطب.
   2. باستخدام مجهر الفلورسنت تستقيم مع تبريد الجهاز المسؤول عن جانب (CCD) وكاميرا، والعثور على GFP، معربا عن TN-GnRH3 الخلايا العصبية من خلال 10X (1B الشكل)، ثم الأهداف مياه الغمر 40X (الشكل 1C). فهي تقع في أو بالقرب من السطح البطني للبصيلات الشم، الأمامي فقط إلى الدماغ الانتهائي.
   3. التبديل إلى جهاز الفيديو التي يتم توفيرالصور في الوقت الحقيقي من المجهر لتحديد موقع الخلايا العصبية كتلة TN-GnRH3 (الشكل 1C).
   4. ضع مسرى مكروي في الحمام بحيث غيض من القطب هو فوق الهدف الخلايا العصبية. تطبيق الضغط الايجابي المستمر طفيف على مسرى مكروي بحيث لا تصبح مسدودة، والاقتراب بلطف الخلايا العصبية المستهدفة مع غيض من القطب.
   5. تحقق ورصد مقاومة القطب في وضع الجهد المشبك باستخدام برنامج مسجل المحاور ومكبر للصوت Axoclamp 200B مع برنامج مسجل المحاور (أكسون صكوك). عندما ترون من الشاشة الفيديو التي غيض من القطب هو على سطح الخلايا العصبية ومن العرض مسجل المحاور أن المقاومة تغييرات طفيفة، الافراج عن الضغط الايجابي وتطبيق ضغط سلبي طفيف إذا لزم الأمر لجعل منخفضة المقاومة الختم على الخلايا العصبية (<100 MΩ).
   6. التبديل إلى الوضع الحالي، المشبك، وتسجيل غشاء الجهد باستمرار دون أي المدخلات الحالية، وتعديل نطاقمن الجهد ومعدل التسجيل في حال الضرورة. ويتم جمع البيانات وتحليلها بواسطة برنامج Powerlab (ADInstruments شركة).
   7. سجل النشاط الكهربائي خط الأساس في المياه المالحة الأسماك العادية لمدة 5 دقائق قبل أي علاج (الشكل 2A). نضح حمام من الأدوية، الهرمونات، والببتيدات، الخ. وأضاف أن المياه المالحة الأسماك لا تزال بمعدل 200 ميكرولتر / دقيقة، تليها فترة إخفاق في الحالات العادية الأسماك المالحة ^{5، 6، 11.}
2. تسجيل خلية كاملة من غشاء المحتملة
   التصحيح خلية كاملة المشبك الكهربية الإجراء هو نفسه كما ان من إجراء التسجيل فضفاضة التصحيح خارج الخلية المذكورة أعلاه، من خطوات 3.1.1 - 3.1.4. ثم الإجراءات تحيد تبعا لذلك:
   1. تحقق ورصد مقاومة القطب في وضع الجهد المشبك. عندما ترون من الشاشة الفيديو التي غيض من القطب هو على سطح الخلايا العصبية والذبذبات من أن التغييرات المقاومة قليلا، والإفراج عن إيجابيةالضغط وتطبيق الضغط السلبي قليلا لجعل مقاومة عالية ختم على الخلايا العصبية (~ 3 جيجا Ω). تطبيق طيف الامتصاص عن طريق الفم إلى تمزق غشاء مرقع، وسوف نرى انخفاض مفاجئ للمقاومة إلى حوالي 120-250 MΩ.
   2. التبديل إلى الوضع الحالي، المشبك، وتسجيل غشاء الجهد باستمرار دون أي المدخلات الحالية، وتعديل حجم الجهد ومعدل التسجيل في حال الضرورة.
   3. سجل النشاط الكهربائي خط الأساس في المياه المالحة الأسماك العادية لمدة 5 دقائق قبل أي علاج، كما هو موضح أعلاه في 3.1.7 (الشكل 2B).

النتائج

ويرد مثال على مجموعات ثنائية من GFP المسمى TN-GnRH3 الخلايا العصبية من الدماغ رفعه من الأسماك الميداكا في أرقام 1B و 1C. كل مجموعة تحتوي على حوالي 8-10 الخلايا العصبية هرمون GnRH. وسجلت أنشطة الخلايا العصبية عفوية من الهدف TN-GnRH3 في الوضع الحالي، المشبك (I = 0) مع معدلات اطلاق نموذجية من 0،5-6 هرتز. هذا النمط من العمل اطلاق النار المحتملة هو عادة نمط منشط أو الضرب، مع فاصل زمني interspike منتظم إلى حد ما. وتظهر آثار عينة في الشكل 2

المناقشة

هرمون GnRH 3: GFP الأسماك المعدلة وراثيا تقدم نماذج فريدة لدراسة الآليات العصبية الكامنة وراء التكامل العصبية والتنظيم في السيطرة المركزية من السلوكيات التي هي على حد سواء يشارك بصورة مباشرة وغير مباشرة في الإنجاب ^{3، 8-10.} واحدة من مزايا كبيرة من هذا النظام النموذجي هو أن العديد من الخلايا العصبية GnRH3 معربا عن GFP هي قريبة من السطح البطني من الدماغ، مما يسمح لسهولة نسبيا الوصول إلى الخلايا العصبية لتسجيل الكهربية دون تعطيل الدوائر العصبية ^{6، 9، 11، 12}

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجهر	أوليمبوس		BX50W (تستقيم)
مكبر للصوت	Axon Instruments		Axoclamp 200B
محول A-D	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
كاميرا CCD مبردة	PCO بصريات		Sensicam
مصباح زينون	Sutter Instruments Co.
مجموعة مرشحات GFP	Chroma Technologies
برامج التصوير	ابتكارات التصوير		برامج Slidebook الفيزيولوجيا
الكهربية برامج الحصول على البيانات	Axon Instruments		برنامج Axograph
الفيزيولوجيا الكهربية برامج الحصول على البيانات	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage لعلم الفيزيولوجيا الكهربية	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-285
منصة غرفة التسجيل	Warner Instrument Corp.		P1
غرفة التسجيل	شركة وارنر للأدوات		RC-26G
مجتذب القطب	الكهربائي أدوات		Sutter P87
خيوط لمجتذب القطب الكهربائي	Sutter Instruments	FB330B	خيوط صغيرة بعرض 3.0 مم
1.5 مم شعيرات دموية زجاجية	أدوات الدقة العالمية	1B150-4	Micr &# 8211 ؛ lectrode لتسجيل
حقنة	Becton Dickinson	309586	3 مل
MS-222	Sigma	E10521-10G	ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات
ملح السمك			مليمتر: 134 كلوريد الصوديوم ؛ 2.9 كيلو كلوريد ؛ 2.1 كالوريد < >2 < / فرعي > ؛ 1.2 ملغ كلوريد < فرعي >2 < / فرعي > ؛ 10 محلول قطب كهربائي HEPES
(رقعة فضفاضة)			مل: 150 كلوريد الصوديوم ؛ 3.5 كيلو كلور؛ 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 هيبس. 10 محلول قطب كهربائي للجلوكوز
(رقعة خلية كاملة)			ملليمتر: 112.5 كلورين غلوكونات ؛ كلوريد الصوديوم ؛ 17.5 كيلو كلور؛ 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 ملغ أتب; 1 EGTA; 10 هيبس. 1 GTP; 0.1 ليوببتين. 10 فوسفو كرياتين