مقالة منهجية

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

DOI:

10.3791/50320

⸱

أكتوبر 29, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genome Stability Laboratory, Oncology Axis, Hôtel-Dieu de Québec

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحوصات أساسية في علم الإنزيمات لتوصيف البيوكيميائية من البروتينات في المختبر يتطلب تركيزات عالية من البروتين المنقى من الفائدة. يجب بروتوكولات تنقية البروتين الجمع بين الكفاءة والبساطة والفعالية من حيث التكلفة 1. هنا، نحن تصف طريقة GST-باعتباره صاحب الصغيرة الحجم نظام لتنقية تقارب جديدة للبروتينات المؤتلف، استنادا إلى N-محطة الجلوتاثيون سيفاروز الوسم (GST) وعلامة 2،3 10xHis-C المبنى رقم 4، وكلاهما تنصهر للبروتين من الفائدة. يتم استخدام بناء الأخير لتوليد مراقبة الحشرات، لإصابة Sf9 الخلايا المصابة للتعبير البروتين 5. GST هو علامة طويلة نوعا ما (29 كيلو دالتون) والذي يعمل على ضمان كفاءة التنقية. ومع ذلك، فإنه قد تؤثر على الخصائص الفسيولوجية للبروتين. وبالتالي، يتم لاحقا المشقوق قبالة البروتين باستخدام انزيم PreScission 6. من أجل ضمان أقصى قدر من النقاء وإزالة GST المشقوق، ونحنوأضاف خطوة تنقية تقارب الثانية على أساس صغيرة نسبيا صاحب العلامة. الأهم من ذلك، ويستند أسلوبنا على اثنين من العلامات المختلفة المرافقة طرفي البروتين، والذي هو أداة فعالة لإزالة البروتينات المتدهورة، وبالتالي، يثري البروتينات كامل طول. طريقة المقدمة هنا لا يحتاج إلى الإعداد فعال مكلفة، مثل FPLC. بالإضافة إلى ذلك، ونحن دمج MgCl 2 و ATP يغسل لإزالة الشوائب الحرارة بروتين الصدمة والعلاج نوكلياز لإلغاء تلويث الأحماض النووية. وباختصار، فإن مزيج من اثنين من الكلمات المختلفة المرافقة N-و-C محطة والقدرة على تنشق مرة واحدة من العلامات، وضمانات الانتعاش من البروتين العالية النقاء وطول الكامل من الاهتمام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية البروتينات المؤتلف أمر حاسم لمعالجة المسائل الأساسية في الكيمياء الحيوية. الطرق التقليدية لتنقية البروتين مثل التبادل الأيوني اللوني وحجم الاستبعاد اللوني تعتمد على الخصائص الفيزيائية للبروتين الهدف مثل نقطة تساوي الكهربية وتهمة أو حجم، على التوالي. ويجري تقاسم خصائص البروتين الأخير من قبل مجموعة متنوعة من البروتينات، مما يزيد بشكل كبير من فرصة تلويث البروتينات في تنقية البروتين الاستراتيجيات التقليدية. يمكن الالتفاف على هذه المشكلة مع استخدام الأعمدة تنقية متعددة، والتي تستغرق وقتا طويلا. في نفس الوقت، وأساليب اللوني الأخيرة مطالبة الإعداد التجريبية مكلفة. تنقية تقارب علامة يزيد بشدة المستهدفة التحديد، كما هو الحال في معظم الحالات سوف يكون علامة فريدة من نوعها لبروتين من الفائدة. في الدراسات الحديثة، وقد استخدم على نطاق واسع تنقية العلم أو HA-تقارب.

وعلى النقيض من تفصيل القائمةombinant بروتوكولات تنقية البروتين التي تستخدم به واحد، أنشأنا مزيج فريد من اثنين من العلامات. ينطوي أسلوبنا الانصهار من علامة GST في N-محطة وصاحب العلامة في محطة سي من البروتين من الفائدة، لالنسبة المثلى بين كمية ونقاء البروتين المطلوب. ضريبة السلع والخدمات هو علامة طويلة (29 كيلو دالتون)، والتي هي ذات كفاءة عالية لتنقية على الجلوتاثيون الخرز سيفاروز. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام GST يضمن فعاليتها من حيث التكلفة لدينا أسلوب 1. إمكانية يلتصق قبالة GST مع انزيم PreScission (مع تسلسل الاعتراف LeuGluValLeuPheGln / GlyPro، مما أدى إلى إضافة اثنين فقط من الأحماض الأمينية) والعديد من المزايا، على سبيل المثال، فإن هذه الاستراتيجية يتجنب التعديلات وظائف البروتين الفسيولوجية بسبب عائق تفارغي. الصغير صاحب العلامة تنصهر مع غيرها من أقصى البروتين يخدم في خطوة تنقية الثانية لزيادة البروتين النقاء بغسل قبالة GST المشقوق، وكذلك البروتينات وغيرها من تدهور الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتوكول خطوة لغسيل الكلى عند التبديل من ضريبة السلع والخدمات إلى صاحب تنقية خطوة العمود (راتنج تالون). الملوثات شيوعا في مثل هذه العمليات هي تنقية الحرارة صدمة البروتينات (HSP). إضافة خطوة الحضانة مع MgCl 2 و ATP يسمح إزالة هذه الملوثات (الشكل 1).

البروتين سريع اللوني السائل (FPLC) وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) هي التقنيات الشائعة التي تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن لتوليد عالية الغلة من البروتين المنقى من الفائدة. بروتوكول تنقية دفعة نقدم هنا، في المقابل، هو دليل ولا يتطلب الإعداد فعال مكلفة. يمكن التوصل إلى ارتفاع العائد من البروتين عن طريق التوسع في البروتوكول. في نفس الوقت، مع بروتوكول تنقية دفعة، ويمكن تعديل حجم شطف من أجل تعزيز تركيز البروتين، والتي لا تعطى مع FPLC أو HPLC.

ntent "> أيضا، مع دفعة GST-صاحب بروتوكول تنقية والبروتينات مع حجم المدى من 10-300 كيلو دالتون ~ يمكن تنقيته. واحدة من أكبر مزايا تعطى من حقيقة أن واحدا يمكن تنقية العديد من البروتينات في نفس الوقت ، على سبيل المثال، على حد سواء من النوع البري والبروتين متحولة. إن نجاح بروتوكول المعروضة تعتمد فقط على مستوى التعبير والذوبان من البروتين من الفائدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج المؤتلف الفيروسة العصوية

يتم إنشاؤها لمراقبة الحشرات باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية باك إلى باك من إينفيتروجن أساسا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة فقط:

  1. تم إنشاء تعديل pFastBac1 ناقلات (GIBCO، والحياة) الذي يحتوي على GST-وصاحب العلامات (الشكل 2). الموقع MultiCloning (MCS) من PET-52B (+) ناقلات (Novagen)، تحتوي على 10xHis علامة، تم إدراجها في MCS من ناقلات pFastBac1 لتوليد pFastBac1-بكتيريا-10xHis. وكان تسلسل MCS-52B الحيوانات الأليفة (+) PCR تضخيم بين المواقع تقييد XbaI وBlpI، إضافة موقع تقييد BglII في 5 'أقصى وموقع تقييد HindIII في 3' أقصى. ثم تم استنساخ المنتج PCR بين BamHI وHindIII موقع تقييد pFastBac1، وذلك باستخدام توافق BamHI وBglII تسلسل قيود. منذ كان الهدف هو توليد pFastBac1 السماح للتعبير عنالبروتين المؤتلف مع streptavidin و10xHis-العلامات، وكان موقع تقييد BamHI من PET-52B (+) لا تستخدم تسلسل MCS. أيضا، لم يستخدم موقع تقييد XbaI لتجنب التكرار من المواقع قيود التي تحدث بين المواقع بالفعل في MCS من pFastBac1 وهذه إدراجها مع MCS من PET-52B (+). ثم تم إدراج تسلسل الترميز GST مع موقع PreScission البروتياز الاعتراف (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) في pFastBac1-بكتيريا-10xHis. تسلسل GST كدنا] من pGEX-6P-2 (GE للرعاية الصحية) تم تضخيم PCR مع الاشعال تحتوي على راسي وKpnI مواقع التقييد في 5 'و 3' الأطراف، على التوالي. موقع روسي يسمح بإضافة كودون البداية ولكن أيضا ألانين إلى GST. ثم تم استنساخ المنتج PCR في pFastBac1-بكتيريا-10xHis بين المواقع تقييد راسي وKpnI، مما أدى إلى حذف Streptavidin البطاقات. كان اسمه الانصهار ناقلات جديدة وبالتالي الحصول على pFastBac1-GST-10xHis.
  2. استنساخ [كدنا] الترميز للعلاقات العامةotein من الفائدة في ناقلات pFastBac-GST-10xHis بين ضريبة السلع والخدمات (N-محطة) وصاحب العلامة (C-محطة). كن حذرا لإزالة كودون وقف كدنا] للسماح للاندماج مع محطة C صاحب العلامة.
  3. تحويل E. القولونية DH10Bac مع pFastBac المؤتلف (حصلت عليه في الخطوة 1.2) لتوليد bacmid. السماح لتنمو المستعمرات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وعدة ساعات في 30 درجة مئوية على لوحات تحتوي على اختيار Bluo غال وIPTG (10 ميكروغرام / مل تتراسايكلين، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين، 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 100 ميكروغرام / مل Bluo- غال، 40 ميكروغرام / مل IPTG).
  4. انتقاء وrestreak 2 مستعمرات بيضاء (من الخطوة 1.3) على لوحات مختارة لتأكيد النمط الظاهري الأبيض.
  5. تطعيم 2 مل من LB تحتوي على 10 ميكروغرام / مل تتراسايكلين، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين مع اثنين من المستعمرات بيضاء من الخطوة 1.4 والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في إطار التحريض (250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
  6. من أجل تنقية الحمض النووي bacmid، تكوير البكتيريا من الخطوة 1.5،resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر من الحل الأول وإضافة 300 ميكرولتر من الحل الثاني (Maxiprep عدة من في Qiagen). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 300 ميكرولتر من 3 M KOAc درجة الحموضة 5.5 واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي العينات في 4 درجات مئوية، وأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى supernatants واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، ويغسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪. السماح بيليه الجافة و resuspend تحت ظروف معقمة في 40 ميكرولتر من EDTA تريس، ودرجة الحموضة 8.0. يجب أن يتم تخزين الحمض النووي bacmid في 4 درجات مئوية.
  7. تولد لمراقبة الحشرات كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. يمكن تخزينها لمراقبة الحشرات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

2. المؤتلف التعبير البروتين

  1. من أجل اختيار الأكثر كفاءة الفيروسة العصوية لتنقية ورصد أي وقت يتم الوصول إلى الذروة من البروتين التعبير، إجراء فحص الإصابة مصغرة لق يلي: تصيب 2 × 10 7 من المصابين Sf9 الخلايا المستزرعة في 27 درجة مئوية في وسائل الإعلام غريس (تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ P / S) مع 133 ميكرولتر (1/150) من الفيروسة العصوية. جمع aliquots من 1.5 مل في 0، 24، 48، و 72 ساعة بعد العدوى. بيليه الخلايا وتحليل مستوى التعبير عن بروتين من الفائدة عن طريق النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة للعلامة.
  2. استخدام الفيروسة العصوية الأكثر كفاءة من الخطوة 2.1 لتصيب الدوار تحتوي على 1.0 × 10 6 خلايا Sf9 لكل مل في 500 مل من وسائل الإعلام مع نسبة 1/150 بين الفيروس وسائل الإعلام. السماح للخلايا المصابة تنمو في التعليق حتى 27 درجة مئوية وحصاد الخلايا عند بلوغ الحد الأقصى للتعبير البروتين (كما هو محدد في الخطوة 2.1 أعلاه). الخلايا مكعبات يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

3. إعداد المحللة للذوبان الخليوي

يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية من الحضانة في 4 درجات مئوية تحت دوران خفيفة.

  1. ليز Sالخلايا F9 التعبير عن بروتين اهتمامك في ~ 20 مل من العازلة ملزمة GST (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.05٪ تريتون-X-100، 1 ملم DTT في PBS1X لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 250 ملم، ومثبط البروتياز كوكتيل (روش). في حمام الماء المثلج، dounce الحل 20x ومع الخالط dounce، يصوتن كل 3X 30 ثانية (إخراج 70٪)، ومرة ​​أخرى dounce 20x و.
  2. (اختياري). احتضان مجموع المحللة الخلية مع 1 ملي MgCl 2 و 7 benzonase نوكلياز (2.5 U / مل) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحمض النووي RNA أو التلوث.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 18،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إبقاء طاف.
  4. (اختياري). الطرد المركزي طاف مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في 18،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية للحصول على المحللة للذوبان واضحة. تمرير طاف من خلال مرشح 0.2 ميكرون أو 0.45 لتجنب انسداد.

4. ملزمة البروتين على GST الخرز

  1. احتضان الخلايا المحللة للذوبان مع 1 مل من الخرز GST (prewashed مرتين مع10 مل من العازلة GST) ملزمة لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية تحت التناوب لطيف.

التعليق: الساعة الحضانة يحتاج إلى أن يكون الأمثل وفقا لاستقرار وكفاءة البروتين ملزمة.

  1. تدور سريعة على 700 دورة في الدقيقة وإزالة طاف تحتوي على بروتينات غير منضم (وهذا يمكن أن تبقى لمزيد من التحليل). غسل البروتينات ملزمة GST (الشكل 3B، حارة 1) مع GST غسل العازلة (GST العازلة ملزمة مع 350 ملي مول كلوريد الصوديوم النهائية).
  2. كرر الخطوة 4.2 2X. في غسل الماضي، وإزالة طاف قدر ممكن.
  3. احتضان حبات مع 5 ملي ATP و 15 ملي MgCl 2 (في 10 مل العازلة ملزمة GST) لمدة 1 ساعة عند 4 درجة مئوية لتجنب الربط غير محدد من البروتينات حرارة صدمة 8. تغسل حبات ثلاث مرات مع GST غسل العازلة.

5. PreScission الشق من ضريبة السلع والخدمات

  1. أجهزة الطرد المركزي حبات GST، وإزالة طاف وتغسل حبات GST مع P5 BUFفر (50 ملي NaHPO 4 درجة الحموضة 7.0، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين، 0.05٪ تريتون-X-100، 5 ملي إيميدازول).
  2. احتضان GST-الخرز مع PreScission الانزيم في المنطقة العازلة من 3 P5 ساعة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. (اقسم حبات GST في كسور 100 ميكرولتر وإضافة وحدات 4-8 (2-4 ميكرولتر) من انزيم مخففة في 100 ميكرولتر من العازلة P5).

التعليق: فترة حضانة من خطوة PreScission يحتاج إلى أن يكون الأمثل وفقا للوزن الجزيئي فضلا عن الاستقرار من البروتين. إذا لوحظ تدهور، يمكن تخفيض هذا الوقت الحضانة لمدة لا تقل عن 2 ساعة بدلا من ليلة وضحاها.

  1. تدور السريع وجمع طاف. كرر هذه الخطوة مرتين بعد إضافة 100 ميكرولتر من P5 العازلة إلى الخرز وتجميع جميع أجزاء (الشكل 3B، 2 لين).

التعليق: حبات المتبقية يمكن استخدامها لتحليل كفاءة الانقسام (الشكل 3B ، حارة 3). عادة، يتم المشقوق 70-80٪ من البروتين.

6. لTALON المعادن تقارب الراتنج ملزمة البروتين

  1. تقسيم شطف من فوق إلى 3 أجزاء من 1 مل واحتضان كل مع 100 ميكرولتر الخرز الراتنج تالون تقارب المعدن الجافة (prewashed مرتين مع العازلة P5) لمدة 1 ساعة تحت التناوب.

التعليق: تقسيم شطف في عدة كسور يزيد من كفاءة ملزمة / يغسل.

  1. غسل الراتنج 5 دقائق مع العازلة P30 (P5 عازلة مع تركيز النهائي من 30 ملي إيميدازول).
  2. كرر الخطوة 6.2 2X وتجميع الخرز في أنبوب واحد. قبل غسل الماضي، وإزالة طاف قدر ممكن.

التعليق: هذا يتوافق مع TALON ملزمة العينة (الشكل 3B، حارة 4).

7. شطف من البروتين النقي

  1. احتضان البروتين ملزمة الراتنج تالون لمدة 5 دقائق تحت تناوب مع P500 العازلة (P5 عازلة مع تركيز النهائي من 500 ملي إيميدازول). استخدام النسبة بين العازلة والخرز 1:1 ت / ضد (على سبيل المثال، إذا كنت قد اتخذت 200 ميكرولتر من الخرز جافة، سيكون لديك لإضافة 200 ميكرولتر من P500). كرر هذه الخطوة مرتين والحفاظ على كل جزء على حدة مزال (اسمه شطف 1 (E1)، شطف 2 (E2) وشطف 3 (E3)؛ الشكل 3B، الممرات 5-7).

التعليق: حبات المتبقية يمكن استخدامها لتحليل فعالية شطف (الشكل 3B، حارة 8). عادة، يتم مزال 60-80٪ من البروتين في المجموع.

  1. تحليل كمية ونوعية البروتين النقي الخاص بك عن طريق تحميل ما يقرب من 20-40 ميكرولتر من كل جزء مع تركيز BSA القياسية على SDS-PAGE وصمة عار مع Coomassie الأزرق (الشكل 3B) أو SYPRO البروتين وصمة عار لتصور.

التعليق: البروتين من الفائدة يمكن أيضا الكشف عن تروughout الإجراء تنقية استخدام الألغام المضادة للضريبة السلع والخدمات ومكافحة صاحب الأضداد (الشكل 3C).

8. تخزين البروتين النقي

  1. Dialyze البروتين النقي ضد وجود مخزن مؤقت التخزين المناسبة (على سبيل المثال 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 خلات، 200 ملي شركة الخطوط الجوية الكويتية، 10٪ الجلسرين، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي DTT) في 4 درجات مئوية. فمن المهم للتحقق من هطول الأمطار من البروتين النقي أثناء غسيل الكلى. نحن عادة dialyze 2X لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية تحت التحريض التناوب.
  2. جعل مأخوذة صغيرة من البروتين النقي (10-20 ميكرولتر) وتجميد الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة. تخزين aliquots في -80 درجة مئوية، وتجنب العديد من ذوبان الجليد / دورات التجمد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل توضيح الكفاءة للله GST بروتوكول تنقية، ونحن تنقيته Rec14، وهو S. البروتين pombe من 32.9 كيلو دالتون. تم استنساخ [كدنا] Rec14 في منطقتنا تعديل ناقلات pFastBac1 السماح اضافات من ضريبة السلع والخدمات وصاحب-به في وN-C-تيرميني، على التوالي (الشكل 1A). تم الفيروسة العصوية المؤتلف ثم أعدت واستخدامها لتصيب الخلايا المصابة SF9 للتعبير البروتين. حضنت لست] خلية قابلة للذوبان مع حبات GST وكان مزال بروتينات ملزمة الشق ضريبة السلع والخدمات مع PreScissio...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إلى صاحب GST بروتوكول تنقية المعروضة هنا هي مناسبة لتنقية مجموعة واسعة من الأحجام من البروتينات المؤتلف: نحن تنقيته بنجاح لى RAD51 (41kDa)، piBRCA2 (120kDa)، PALB2 (130kDa)، ونسبة عالية من البروتين الوزن الجزيئي غير المستقرة الليشمانيا الطفلية: لي BRCA2 (125kDa) 6،9. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات المنقى مع هذا البروتوكول النشطة كيميائيا 6. نجاح هذه الطريقة يعتمد فقط على التعبير، القابلية للذوبان والاستقرار من البروتين المطلوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر آن ماري ديون-كوت للمناقشات التي تؤدي إلى تطوير الأسلوب. JK وRB هي FQNRT العلماء الدكتوراه، M.-MG هو باحث فانييه CIHR، وJ.-YM هو أحد كبار الباحثين FRSQ. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث لJY. M.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
REAGENTS< / strong>
E.Coli < / em>DH10Bac (مختص)Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression SystemInvitrogen
Maxi Prep KitQiagen12163Solution I and II
Ultra Pure Bluo-GalGibco (Life)15519028
IPTGGibco (الحياة)15529019
الخلايا المصابة Sf9ATCCCRL-1711
إنزيم PreScissionGE Healthcare27084301
جريس المصاب المكملGibco (الحياة)11605-094
يتميز مصل الأبقار الجنينيHycloneSH30396.03
P / S (البنسلين الستربتومايسين)جيبكو (الحياة)15070-063
راتنج الجلوتاثيون سيفاروزGE العلوم الحيوية17075605
كوكتيل مثبط البروتيازRoche11873580001
راتنج TalonClontech635504
ImidazoleBioShop288324
GentamicinGibco (Life)15710064
إنتاج الأجسام المضادة لضريبة السلع والخدمات متعددة النسيلةفي المنزل
أحادي النسيلة 6X-His-AntibodyClontech631212<
الخالط (ضيق)Wheaton357546
Sonicator (Fisher dismembrator)فيشرموديل 150
كيس غسيل الكلى (50 مم)فيشر ساينتيك2115217
وسط td colspan = "4" ><قوي>المعدات< / قوي >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
  4. Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
  6. Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GST His purificationTwo step affinityProtein purificationRecombinant proteinBaculovirus expressionSf9 cellsGlutathione SepharoseHis tag affinityPreScission cleavageSDS PAGE analysis

مقالات ذات صلة