من أجل دراسة التغيرات من الألياف العصبية داخل البشرة مسبب (IENFs) في اعتلال الأعصاب المؤلم (PN)، قمنا بتطوير البروتوكولات التي يمكن أن تفحص مباشرة التغيرات المورفولوجية ثلاثي الأبعاد لوحظ في IENFs مسبب. تحليل ثلاثي الأبعاد للIENFs لديه القدرة على تقييم التغيرات المورفولوجية للIENF في PN.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
A لكمة خزعة من الجلد يستخدم عادة لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة (IENFD) لتشخيص اعتلال الأعصاب الطرفية من 1،2. في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة لجمع 3 خزعات الجلد مم من الساق البعيدة (DL) والفخذ الدانية (PT) لتقييم polyneuropathies التي تعتمد على طول 3. ومع ذلك، نظرا لطبيعة متعددة الاتجاهات من IENFs، فإنه يمثل تحديا لدراسة تداخل الهياكل العصبية من خلال تحليل ثنائي الأبعاد (2D) التصوير. بدلا من ذلك، يمكن ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير توفر حلا أفضل لهذه المعضلة.
في التقرير الحالي، فإننا نقدم طرق لتطبيق التصوير 3D لدراسة الاعتلال العصبي المؤلم (PN). من أجل تحديد IENFs، تتم معالجة عينات الجلد لتحليل مناعي للبروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD ردعتستخرجه PGP المناعية باستخدام المجهري brightfield 4. وفي الدراسة الحالية، طبقنا تحليل مناعي مزدوج لتحديد مجموع IENFD، وذلك باستخدام PGP، وIENF مسبب، من خلال استخدام الأجسام المضادة التي تعترف تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A)، ومستقبلات تقارب السامي لعامل نمو العصب 5. مزايا IENF شارك في تلطيخ مع PGP وتورك A الأجسام المضادة تفيد دراسة PN بواسطة تلطيخ بوضوح إيجابية PGP، والألياف مسبب. يمكن قياس هذه الإشارات الفلورسنت لتحديد التغيرات المورفولوجية IENFD ومسبب من IENF المرتبطة PN. يتم الحصول على الصور الفلورسنت بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر وتجهيزها للتحليل 3D. يوفر 3D التصوير قدرات التناوب إلى مزيد من تحليل التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. أخذت معا، فلوري شارك في تلطيخ، والتصوير متحد البؤر، وتحليل 3D تستفيد بوضوح دراسة PN.
المقدمة
في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة للأطباء لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة، (IENFD) من الجلد الخزعات لكمة، والتي يمكن استخدامها لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة 3، 6-8. يتم أخذ خزعات من الساق البعيدة (DL)، و 10 سم فوق الكعب الوحشي، والفخذ الدانية (PT)، و 20 سم تحت العمود الفقري الحرقفي الأمامي 9. وصفت جميع IENF باستخدام بروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم 10-12. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD يحدده تلطيخ PGP مع المجهري brightfield 6. بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات البحثية بروتوكولا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جزء A: المناعية
يتم جمع وإعداد لوحة 96 جيدا والوقاية من خلفية تلطيخ لكمة خزعات الجلد من البشر والمحتضنة لمدة 12-24 ساعة في حل تثبيتي (2٪ بارافورمالدهيد مع 0.75 M حل L-يسين (الرقم الهيدروجيني 7.4) و 0.05 ملي الصوديوم بريودات) في 4 درجات مئوية كما هو موضح سابقا 8. ثم يتم cryoprotected عينات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الجلسرين 20٪ في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع، جزءا لا يتجزأ في وسائل الإعلام تصاعد درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر)، ثم مقطوع إلى 50 ميكرون أبواب سميكة على ناظم البرد. تم تصميم البروتوكول هو موضح أدناه للحصول على 8 أقسام....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
طبقنا البروتوكول الحالي لدراسة مورفولوجية IENF في PT وDL خزعات الجلد من المرضى الذين يعانون من PN. الجلد، من ثلاث مواد، تم جمعها في جامعة ولاية يوتا لإثبات المورفولوجيا المرضية المرتبطة PN. الموضوعات ما يلي: حالة 1: الذكور 51 عاما مع تاريخ من PN من مرض السكري من النوع 2 (المدة: 14 شهرا؛ درجة الألم: 51)؛ الحالة 2: رجل يبلغ من العمر 56 سنة ولها تاريخ من PN مرض السكري من النوع 2 (المدة: 108 شهرا؛ درجة الألم: 47)، والحالة 3: رجل 66 عاما مع تاريخ من PN من مرض السكري من النوع 2 (المدة: .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قياس IENFD وقد استخدم على نطاق واسع لتحديد درجة من اعتلال الأعصاب المحيطية 13،14. في الوقت الحاضر، والبروتوكول الأكثر استخداما يقيس فقط كثافة من الألياف العصبية التي تخترق الغشاء القاعدي في البشرة، وهي لا تأخذ بعين الاعتبار المحاور المتفرعة و / أو التغيرات المورفولوجية للأعصاب. وبالإضافة إلى ذلك، لم يظهر تحليل IENFD الحالية لربط IENFD مع وجود ألم في PN 15.
نحن ذكرت سابقا أن زيادة أعداد IENFD.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أي تضارب في المصالح لتعلن.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08-01A2 NS061039، وبرنامج الأمراض العصبية بحوث واكتشاف، وألف توبمان معهد ألفريد بحوث الطبية في جامعة ميشيغان. يستخدم هذا العمل مورفولوجية وصورة التحليل الأساسي للميشيغان أبحاث السكري ومركز التدريب، بتمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5P90 DK-20572 من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. فإن الكتاب أود أن أشكر روبنسون سينغلتون وغوردون سميث (جامعة يوتا) للتبرع السخي من عينات الجلد البشري لدعم التطوير الأولي للمسبب العلامات البيولوجية تقنية المناعية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | لتكوين 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (أرنب متعدد النسيلة) AbD | Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (ماعز متعدد النسيلة) | R & D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 حمار & alpha - أرنب | Invitrogen | A21206 | AF488 حمار &alpha ؛ - الماعز |
| Alexa Fluor 647 حمار & alpha ؛ - الماعز | Invitrogen | A21447 | AF647 حمار &alpha ؛ ألفا ؛ ألبومين الماعز |
| ، من مصل الأبقار | سيجما ألدريتش | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | تكساس -100 |
| حلقة غير معايرة | LeLoop | MP 199025 | التلقيح حلقة |
| 96 بئر لوحة | فحص Corning Incorporated | 3603 | لوحة البئر |
| إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان مع DAPI | Invitrogen | P36931 | غطاء |
| مجهر DAPI زجاج 22x22 مم | فيشر Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus مجهر شرائح | فيشر علمي | 12-550-15 | شرائح مجهر |
| أوليمبوس فلوفيو المسح بالليزر مجهر متحد البؤر | أوليمبوس | FV500 | مجهر متحد البؤر |
| درجة حرارة القطع المثلى | ساكورا | 4583 | أكتوبر |
| لايكا كرايوستات | لايكا | CM1850 | Cryostat |
المراجع
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
