قياس الكالسيوم داخل الخلايا 2 + التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Summary

الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} ديناميات هي مهمة جدا في علم وظائف الأعضاء الحيوانات المنوية والكالسيوم ^{2 +} حساسة الأصباغ الفلورية تشكل أداة مرنة لدراستها. وتستخدم التجارب السكان (قياس التألق وتوقف تدفق قياس التألق) والتجارب خلية واحدة (التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة) لتعقب المكانية والزمانية [كا ^{2 +}] تغيرات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.

Abstract

الحيوانات المنوية هي خلايا التناسلية للذكور صمم خصيصا للوصول والتعرف عليها وتندمج مع البيضة. لأداء هذه المهام، الخلايا المنوية يجب أن يكون مستعدا لمواجهة بيئة متغيرة باستمرار والتغلب على العديد من الحواجز المادية. يجري في جوهر transcriptionally وtranslationally صامتة، وهذه الخلايا متحركة تعتمد بشكل كبير على آليات متنوعة مما يشير إلى توجيه نفسها والسباحة بطريقة موجهة، ويتعامل مع ظروف بيئية قاسية خلال رحلتهم للبحث عن البيض. على وجه الخصوص، كا ^{2 +} إشارات بوساطة أمر حيوي لعدة وظائف الحيوانات المنوية: تفعيل الحركة، وتمكين الطاقات (عملية معقدة التي تعد الحيوانات المنوية للتفاعل الجسيم الطرفي) وردود الفعل الجسيم الطرفي (حدثا exocytotic التي تسمح الانصهار الحيوانات المنوية البيضة). استخدام الأصباغ الفلورية لتتبع تقلبات الخلايا من أيون هذا له أهمية ملحوظة نظرا لسهولة تطبيقها، والحساسية، وبراعة ديتection. باستخدام بروتوكول واحد واحد صبغ التحميل نستخدم أربع تقنيات مختلفة لمراقبة فلوروميتريك الحيوانات المنوية كا ^{2 +} ديناميات. يوفر كل تقنية المعلومات المتميزة التي تمكن القرار المكانية و / أو الزماني، وتوليد البيانات سواء في خلية واحدة ومستويات السكان الخلية.

Introduction

كا ^{2 +} هو رسول الثاني العالمي لمسارات نقل الإشارة في الخلايا حقيقية النواة. داخل الخلايا كا ^{2 +} (كا ^{2 +} _ط) يشارك في تنظيم العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية في الخلايا على حد سواء منفعل وغير منفعل. مشتق أهمية وعالمية كا ^{2 +} كرسول الثانية خلال الأحداث نقل الإشارة من تنوعها المكانية والزمانية في نقل المعلومات داخل الخلية. بينما كا ^{2 +} لا يمكن توليفها من جديد أو المتدهورة داخل الخلية، وتركيزه داخل الخلايا ([كا ^{2 +]} _ط) يتم الاحتفاظ ضمن حدود صارمة للغاية من خلال الآليات الخلوية المختلفة التي العازلة بشكل مستمر، تنحية، تجزئة، و / أو ....

Protocol

في هذه الورقة ونحن التقرير استخدام أربعة أساليب المذكورة أعلاه لقياس [كا ^{2 +]} _ط التغيرات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية. كنا البروجسترون لاشعال كا ^{2 +} ردا على ذلك، كما يتم تأسيس جيدا أن هذا الستيرويد تنتج عابر [كا ^{2 +]} _ط زيادة في الحيوانات المنوية. ولا سيما، في الحيوانات المنوية البشرية، ينشط هرمون البروجسترون مباشرة كا ^{2 +} قناة (أي CatSper) أعرب حصرا في غشاء البلازما من خلايا الحيوانات المنوية ^10،11. نحن أيضا قياس يستريح [كا ^{2 +]} _ط قبل وبعد تمكين الطاقات بالنظر إلى أن أيضا مقبولة على نطاق واسع أن أي زيادة في [كا ^{2 +]}

Results

الشكل 1. ويوضح الرسم التخطيطي للبروتوكول تجريبي لعينة الحيوانات المنوية من خلال طريقة إعداد حمام السباحة. الخطوات الرئيسية لفصل الحيوانات المنوية القادرة على الحركة والتكيف من تركيزهم. يتم تنفيذ آخر خطوة الحضانة فقط عندما مطلوب تمكين الطاقات.

Discussion

إشارات بين الخلايا هو أمر حيوي لمعظم الأنشطة الخلوية؛ كا ^{2 +} هو رسول في كل مكان التي ترافق خلايا الثدييات في جميع أنحاء كامل حياتها، من أصلهم في التسميد، إلى نهاية دورة حياتها. في استجابة للمؤثرات مختلفة، [كا ^{2 +]} ط الزيادات، يتذبذب والنقصان مع تدوين المكانية والزمانية؛ وفقا لذلك، يتم تنشيط العمليات المتنوعة، التضمين أو إنهاؤها من قبل كا ^{2 +} الرسائل المشفرة. داخل الخلايا كا ^{2 +} ديناميات هي مهمة جدا في علم وظائف الأعضاء الحيوانات المنوية،.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
هام F-10	سيجما-ألدريتش	N-6013
ألبومين مصل الأبقار	سيجما ألدريتش	A-7906
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات حوالي 99٪	سيجما-ألدريتش	C-3881
غرفة العد ماكلر	SEFI الطبية المحدودة	SEF-MAKL
فلو -3 صباحا	Invitrogen	F-1242	20 قارورة / 50 & mu ؛ ز كل
من Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S-9888	الكواشف لوسط المنوية البشرية (HSM)
كواشف كلوريد البوتاسيوم	Sigma-Aldrich	P-3911	للحيوانات المنوية البشرية (HSM)
كواشف بيكربونات الصوديوم	JT Baker	3506	لوسط المنوية البشرية (HSM)
كلوريد المغنيسيوم	سيجما ألدريتش	M-2670	الكواشف لوسط المنوية البشرية (HSM)
كلوريد الكالسيوم اللامائي	سيجما ألدريتش	C-1016	الكواشف لوسط المنوية البشرية (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	لوسط المنوية البشرية (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	الكواشف للحيوانات المنوية البشرية وسيط (HSM)
كواشف بيروفات الصوديوم	سيجما-ألدريتش	P-2256	لوسط المنوية البشرية (HSM)
للاكتات الصوديوم (حوالي 99٪)	سيجما ألدريتش	L- 7022	كواشف وسط المنوية البشرية (HSM)
بروبيديوم يوديد	فيتروجين	L-7011	المكون B
تريتون X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	محلول Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM في الماء
غطاء دائري	VWR	48380 080	25 مم
قطر محلول بولي إل ليسين	سيجما ألدريتش	P8920
كلوريد المنغنيز	سيجما ألدريتش	M-3634
أتوفلور ؛ غرفة الخلية ، للفحص المجهري	تقنيات الحياة	A-7816
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	سيجما-ألدريتش	D2650	5 × 5 مل