في هذه الورقة، نقدم طريقة لتحليل microvessels الورم في الجسم الحي باستخدام ديناميكية محسنة النقيض مضان videomicroscopy. تم الحصول على معلمتين الكمية: الكثافة الشعرية الفنية التي تعكس الأوعية الدموية للورم، وتسرب مؤشر يعكس التسرب من الجدار البطانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الجسم الحي التصوير من ورم الأوعية الدموية باستخدام الإسفار متحد البؤر Videomicroscopy
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيبيريد متحد البؤر مضان في الجسم الحي التصوير مع حزمة من الألياف البصرية تستخدم نفس المبدأ الفلورسنت متحد البؤر المجهري. ويمكن ان تثير الفلورسنت في عناصر الموقعية من خلال الألياف البصرية، ومن ثم تسجيل بعض الفوتونات المنبعثة، عبر نفس الألياف البصرية. مصدر الضوء هو ليزر الذي يرسل الضوء من خلال إثارة عنصر ضمن حزمة من الألياف وكما يمسح على عينة، وبإعادة بكسل الصورة عن طريق بكسل. لأن هذا المسح هو سريع جدا، من خلال الجمع بين ذلك مع مكرسة برامج معالجة الصور، ويمكن الحصول على الصور في الوقت الحقيقي مع تواتر 12 لقطة / ثانية.
قمنا بتطوير تقنية لوصف كميا التشكل الشعري وظيفة، وذلك باستخدام جهاز مضان videomicroscopy متحد البؤر. كانت الخطوة الأولى في تجربتنا لتسجيل 5 أفلام ثانية في الأرباع الأربعة من الورم لتصور شبكة الشعرية. تم تجهيز جميع الأفلام باستخدام برنامج (ImageCell، ماونا كيا التكنولوجيا، فرنسا باريس) أن ينفذ تجزئة الآلي السفن في جميع أنحاء قطر المختار (10 ميكرومتر في حالتنا). وبالتالي، فإننا لا يمكن قياس "الكثافة الشعرية الفنية"، والذي هو النسبة بين منطقة السفينة ومجموع المساحة الكلية للصورة. كان هذه المعلمة علامة بديلة للكثافة الاوعية الدموية الدقيقة، وعادة ما تقاس باستخدام أدوات علم الأمراض.
كانت الخطوة الثانية لتسجيل الأفلام من الورم أكثر من 20 دقيقة لقياس التسرب من وكيل النقيض من الجزيئات من خلال جدار الشعيرات الدموية في النسيج الخلالي. عن طريق قياس نسبة كثافة إشارة في النسيج الخلالي على أنه في الأوعية، وحصلت على "تسرب مؤشر '، التي تعمل كمؤشر بديل لنفاذية الشعيرات الدموية.
المقدمة
الأوعية الدموية هي عملية معقدة 1 التي تنطوي على تشكيل أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة من قبل. التغيرات المرضية في الأنسجة دوران الأوعية الدقيقة، التي تتألف من الشرايين، الشعيرات الدموية، والأوردة، وتورط في طائفة واسعة من الأمراض مثل السرطان، والتهاب، أو مرض السكري. وبالتالي فإنه لا بد من تطوير أساليب لتقييم كمي لهيكل microvessel وظيفة. التصوير تمكن من دراسة microvessels في غير الغازية أو الجزئي الطريقة، في الوقت الحقيقي والحية، والتدابير المتكررة على مر الزمن في نفس الحيوان 2.
حاليا، ديناميكية محسنة النقيض (DCE) التصوير 3 يستخدم عادة لتقييم دوران الأوعية الدقيقة الأنسجة. التصوير محسنة تباين ديناميكية هو الأسلوب الذي يتبع مع مرور الوقت biodistribution من التتبع حقن عن طريق الوريد. من هذه الصفقة، المعلمات الكمي يمكن استخلاصها مما يعكس الأوعية الدموية الأنسجة. DCE التصويروقد غالبا ما تستخدم مع CT، MRI أو الموجات فوق الصوتية. ومع ذلك، وهذه تقنيات التصوير لا تسمح بالاطلاع المباشر على microvessels، منذ حلها، بخلاف مع استخدام أجهزة تجريبية محددة، وغالبا ما يبقى العيانية.
في هذه الورقة، فإننا نقترح لدراسة الأوعية الدموية السرطانية على المستوى المجهري والحية باستخدام التصوير الضوئي الديناميكي محسنة النقيض من ذلك، مع فيبيريد videomicroscopy متحد البؤر. استخدمنا عامل تباين الجزيئات (FITC-ديكستران) التي لا تزال حصرا داخل الأوعية أو التسريبات من خلال حاجز غشائي في النسيج الخلالي، وفقا لثقلها الجزيئي وخصائص البطانة من الأنسجة درس 4. هذا يسمح للدراسة على حد سواء هيكل microvessel، من خلال ترسيم السفن بشكل صحيح، ونفاذية الشعيرات الدموية، من خلال تسريب وتتراكم في النسيج الخلالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وكيل التباين
- لFITC-ديكستران 70 كيلو دالتون، وجرعة حقن 500 ملغم / كغم (10 ملغ من FITC-ديكستران المخفف في 0.1 مل من المياه المالحة للماوس وزنها 20 غراما).
- لا ينبغي أن يتعرض وكيل وقتا طويلا للضوء. لتجنب التبييض، فمن المستحسن لتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
2. خدر
- تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط 1:4 من زيلازين (Rompun 2٪، وباير، بوتو، فرنسا) والكيتامين (500 الكيتامين، Virbac، كارو، فرنسا)، على التوالي 66 ملغ / كغ و 264 ملغ / كغ ل20 ز الماوس.
3. إعداد الجهاز من الفائدة
- نحن حليق الفئران في الموقع من الفائدة (على سبيل المثال، أكثر من ورم تحت الجلد). وبر هو في كثير من الأحيان لصناعة السيارات في فلوري عندما الأبيض. عندما الأسود، فإنه يمتص الضوء.
- كان قطعي الجلد التي تواجه الجهاز ليتم تصويرها. من المهم الانتظار حتى تنزفز قد توقف قبل حقن عامل تباين، وإلا فإنه سوف يتسرب في الدم وتلوث الصورة.
4. اكتساب
- تم حقن عامل تباين إما عن طريق الوريد الوداجي أو الوريد الذيلية. ليس هناك القليل أو إشارة الخلفية في الجهاز لوحظت في حالة عدم وجود وكيل النقيض الفلورسنت.
- وضعت لجنة التحقيق أمام الجهاز ليتم تصويرها. في دراستنا، وكان هذا الورم.
- تم تحويل الليزر لإلقاء الضوء على الورم ومعرفة مضان في الشعيرات الدموية.
- وكان استطلاع الورم يدويا عن طريق تحريك التحقيق في حركة بطيئة جدا في حين تم تسجيل لتصور شبكة الشعرية. فمن المهم للحفاظ على مطرد من ناحية، وهذه التقنية تتطلب خبرة قليلة. في دراستنا، هذه الخطوة الأولى يسمح الكمي لكثافة الشعيرات الدموية وظيفية.
- كانت الخطوة الثانية اكتساب ديناميكية مع مرور الوقت. لهذه الدراسة، استخدمنا 70 كيلو دالتون FITC-ديكستران. لا يوجد أي تسرب الخلالي في معظم الأجهزة العادية ولكن هناك في الأورام. للحصول على الصور من نفس الموقع أكثر من مرة (كما في حالتنا)، فمن المهم لاقامة نظام للحفاظ على التحقيق في مجال الاهتمام. وقد تم ذلك باستخدام الدعم اليدوية لعقد لجنة التحقيق، ووضع قليلا من الجل الموجات فوق الصوتية على غيض من التحقيق. قبل التسجيل، وأمضى بعض الوقت لتحقيق الاستقرار في لجنة التحقيق وضعت في اتصال مع الورم. مرة واحدة تم تأمين الموقف، لم يكن هناك سوى الحد الأدنى من الحركة بسبب التنفس الفأر. تم تحويل الليزر على تسجيل 3 صور كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة للكشف عن وجود تسرب الشعرية. تم إيقاف تشغيله بين كل تسجيل للحد من التباين وكيل التبييض.
- في تجربتنا، تم التضحية الفئران في نهاية الإجراء للتحليل النسيجي للأورام.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام البيانات التي تم جمعها، ونحن يمكن تحليل كمي معلمات مختلفة تعكس دوران الأوعية الدقيقة.
درسنا في الجسم الحي على شبكة الأوعية الدموية الطرفية وجود ورم القولون زرعها في الفئران BALB ج باستخدام نظام متحد البؤر مضان videomicroscopy فيبيريد (Cellvizio، Maunakea التكنولوجيا، باريس، فرنسا 2)، بعد حقن عامل تباين الفلورسنت الجزيئات فلوريسئين ثيوسيانات-ديكستران ( FITC-ديكستران) مع الوزن الجزيئي 7...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أصبحت دراسة الورم دوران الأوعية الدقيقة الأساسية في فهم الفيزيولوجيا المرضية لنمو الورم ونشرها وردا على العلاج 1. التصوير الضوئي هو واحد من التقنيات التي يمكن استخدامها لمراقبة الشعيرات الدموية باستخدام عامل تباين الفلورسنت والمورفولوجية لقياس (الكثافة الشعرية وظيفية) والوظيفية (التسرب مؤشر) معلمات.
التصوير المجهري مضان استخدمنا في هذه الدراسة على حد سواء مزايا وحدود. ميزة واحدة هي أن تكون قادرة على اخ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأنسولين serynge Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| فلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران 70 كيلو دالتون | سيجما ألدريتش | 01619HH | 100 مجم / مل مخفف في محلول ملحي |
| فحص مجهري بالفيديو متحد البؤر | Cellvizio - طقم معايرة وتنظيف MaunaKea Technologies | ||
| ل LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | مخزن LSU-488 | في 4 درجات ؛ C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| برنامج الفسيفساء | MaunaKea Technologies | ||
| برنامج الكشف عن السفن | MaunaKea Technologies |
المراجع
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
