Method Article

تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة

DOI:

10.3791/50375

⸱

August 14th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمنا عينات من شبكية العين retinectomy لتحليل transcriptomic من انفصال الشبكية. وضعنا الداخلي الذي يسمح بحفظ RNA بين الكتل الجراحية والمختبرية. نحن موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل ميكروأري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انفصال الشبكية (RD) يصف انفصال الشبكية العصبي الحسي من الظهارة الصباغية الشبكية (RPE). قواعد الإجراءات والإثبات أمر ضروري من أجل وظيفة طبيعية من الخلايا العصبية الحساسة للضوء، ومبصرات. انفصال الشبكية من قواعد الإجراءات والإثبات يخلق فجوة المادية التي يتم تعبئة مع السائل خارج الخلية. RD يبادر الأحداث السلبية الخلوية والجزيئية التي تؤثر على كل من شبكية العين العصبي الحسي وقواعد الإجراءات والإثبات منذ تبادل الفسيولوجية للأيونات ونواتج الأيض ومنزعجة بشدة. ويرتبط العاقبة للرؤية لمدة مفرزة منذ reapposition السريع لاثنين من الأنسجة النتائج في استعادة الرؤية 1. علاج RD هو الجراحية حصرا. ويتبع إزالة هلام الجسم الزجاجي (استئصال الزجاجية) عن طريق إزالة جزء غير أساسي من شبكية العين في جميع أنحاء منطقة منفصلة لصالح انفصال الشبكية. العينات الشبكية إزالة هي بلا مالك (لا شيء) وبالتالي التخلص منها بشكل طبيعي.لاستعادة الحمض النووي الريبي من هذه العينات الجراحية، قمنا بتطوير مجلة الإجراء الذي يسمح بحفظ RNA أثناء نقل من كتلة الجراحية إلى المختبر. نحن أيضا موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل التعبير الجيني العالمي. جرى التحقق من نوعية الحمض النووي الريبي على حد سواء من قبل RT-PCR وتحليل ميكروأري. تحليل البيانات يظهر تورط في وقت واحد من الالتهابات وانحطاط مبصرة خلال RD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف العلاجي الرئيسي في انفصال الشبكية (RD) هو إيجاد وسيلة للحد من تلف الخلايا المستقبلة للضوء والتهاب شبكية العين الناتجة عن فصل مبصرات من الخلايا الظهارية المصطبغة الشبكية. خلال RD، يتم تنشيط خلايا RPE، ترحيل، dedifferentiate، وتتكاثر على سطح الشبكية منفصلة، ​​وممارسة القوات مقلص مما يؤدي إلى مضاعفات. تحليل Transcriptomics من RD هو وسيلة لتحديد الجينات المستهدفة مع التعبير بعد تعديل RD والجزيئات العلاجية بالتالي المستقبلية التي يمكن أن تحسن نتائج البصرية النهائي في تركيبة مع الجراحة. ومن المعلوم حمض النووي الريبي (RNA) ليست مستقرة كما هو حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)، وهذه الأخيرة تستخدم على نطاق واسع للدراسات الجينية واستقراره سمحت تسلسل الجينوم النياندرتال من العينات الحفرية من أكثر من 30،000 سنة 2. النسخ من الحمض النووي من الجينات من الجينوم في الحمض النووي الريبي هو رسولعملية كبيرة في التعبير الجيني، ومرنا غير قابل للتغيير من أجل يشكل إشارة. الرنا هي جدا المتدهورة بسرعة عن طريق الانزيمات التي ريبونوكلياز إنهاء إشارة. عندما يتم عزل الأنسجة من كائن حي، والرنا غالبا ما تكون متدهورة قبل أن يتم درس التعبير في مختبر الأبحاث. ليست مناسبة RNA المتدهورة للتحليل التعبير الجيني. لأن موظفي المختبرات لا يمكن أن تشارك في عملية جراحية، وضعنا الداخلي التي هي سهلة وتتطلب فقط أن الجراح لاسترداد الأنسجة إلى حل ريبونوكلياز خالية من مناسبة. الحمض النووي الريبي من الأنسجة غير مستقرة ويمكن تحليلها دون أي علامة على تدهور بعد 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة في هذا الحل. يتم تنقية الرنا من العينات بطريقة موحدة تنطوي على تنبيذ فائق على التدرج كلوريد السيزيوم بعد أن تم نقلها إلى المختبر 3. ثم، يتم تقييم جودة الرنا بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وRT-PCR. بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي لديهميزة فصل الجزيئات وفقا لكثافتها التي تختلف عن DNA و RNA ويؤكد أن الحمض النووي الريبي هو غير ملوثة من قبل جزيئات الحمض النووي من شأنها أن تولد إشارات مصطنعة في دراسات التعبير الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، يتم فصل الرنا نقل (tRNAs)، والتي هي من الناحية الكمية الحمض النووي الريبي الأكثر وفرة داخل الخلية، وفقا لنفس الممتلكات المادية من الحمض النووي الريبي الريباسي (rRNAs) والرنا المرسال (mRNAs و)، تلك الماضيين واحد يجري المنتج النهائي من عملية تنقية. إزالة الحمض الريبي النووي النقال من إعداد مفيد لأن معظم البروتوكولات التحليلية ميكروأري ينطوي على استخدام transcriptases العكسي وبلمرة RNA التي تحول دون الحمض الريبي النووي النقال 4-6. وصفت الحمض النووي الريبي تنقيته من العينات الجراحية باستخدام بروتوكول قياسي والمهجنة إلى رقاقة ميكروأري ويتم تحليل النتائج باستخدام طريقتين التكميلية، طريقة معدل اكتشاف كاذبة، وباستخدام أسلوب الرواية استنادا إلى المعلومات المتبادلة وvisualiزد على الخادم على شبكة الإنترنت Retinobase 7،8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. مجلة: إجراء لاسترداد عينات من كتلة الجراحية

في المختبر

  1. الحصول على عقد من استيراد شركة الشحن السريع.
  2. ملء 10 (أو 25) أشكال الشحن مع العنوان البريدي للمختبر مما يدل على الشخص المسؤول عن الاتصال في المختبر (رقم الهاتف وعنوان البريد الإلكتروني).
  3. إعداد 10 (أو 25) أشكال عينات مرقمة من 1 إلى 10 (أو 25). وتشمل هذه الأشكال مساحات مخصصة للإبلاغ عن أ) تحديد المجهول للمريض، ب) من تاريخ الجراحة وج) أي ملاحظات إضافية فإن الجراح ترغب في إضافته. إعداد 10 (أو 25) أظرف (150 × 210 ملم).
  4. أعدت باستخدام ريبونوكلياز خالية من الكواشف 25 (أو 65) مل من 6 M غوانيدين كلوريد في diethylpyrocarbonate (DEPC) المعاملة H 2 O (GHCl).
  5. ملء 10 أو 25 مرقمة 5 مل العقيمة البولي ايثيلين جولة أنابيب أسفل مع 2.4 مل من محلول GHCl.
  6. يستخدم غاز الأرجون لملء الجزء العلوي من هذه الأنابيب، من الصحافة TIghtly على الغطاء لمنع الأكسدة من الحل GHCl على مدى عدة سنوات من التخزين في مجلس الوزراء الجراحية.
  7. أعرض كل 5 أنابيب مل في 50 مل العقيمة أنبوب البولي بروبلين أسفل المخروطية مع غطاء المسمار. استخدام قطعة من المناديل الورقية النظيفة لعقد أنبوب 5 مل في أنبوب مل 50، إغلاق الأنبوب.
  8. وضع أنابيب مل 50 على رف البوليسترين ورف في صندوق من الورق المقوى مع أظرف، وأشكال الشحن، وأشكال العينات.
  9. لصق تعليمات (انظر: 1،12-1،19) داخل غطاء صندوق من الورق المقوى لتسهيل القراءة.
  10. إرسال صندوق من الورق المقوى عن طريق البريد إلى الشخص المسؤول عن الاتصال في المستشفى.

في المستشفى

  1. إحضار صندوق من الورق المقوى من مجلس الوزراء الجراحية إلى غرفة العمليات الجراحية. ملاحظة تنبيه: إذا ينطوي الإجراء على المريض للخطر المناعي، لا ينبغي أن أحضر من الورق المقوى إلى غرفة العمليات الجراحية.
  2. أثناء الجراحة، ضع specim الشبكيةEN في مرقمة 5 مل البولي بروبلين عقيمة مليئة حل GHCl. إغلاق بإحكام الأنبوب.
  3. عودة الأنبوب لفترة وجيزة.
  4. وضع أنبوب على الروك أنبوب الدم لمدة 10 دقيقة.
  5. ملء استمارة مرقمة عينة المرافق له.
  6. تقرير رقم الهوية على المقابلة مرقمة 50 مل أنبوب.
  7. إدخال أنبوب مل 5 مع عينة جراحية في أنبوب مل 50، استبدال المناديل الورقية والمسمار الأنبوب.
  8. إدخال الأنبوب وشكل عينة ملأت في ذلك في واحدة من أظرف المرافق له. إغلاقه.
  9. استدعاء شركة الشحن السريع لالتقاط.

2. تنقية الحمض النووي الريبي

في المختبر

  1. تجانس العينة في أنبوب البولي بروبلين في 5 مل مع حل GHCl مع الخالط لمدة 1 دقيقة في حين تحريك أنبوب صعودا وهبوطا.
  2. إضافة 270 ميكرولتر من 2 M البوتاسيوم خلات 5.0 درجة الحموضة. هزة بقوة لمدة 10 دقيقة عن طريق وضع أنبوب على شاكر في تقريرهاالوضع الأفقي (420 دقيقة -1).
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة (6،500 x ج) في 20 درجة مئوية.
  4. نضح بسلاسة الكسر للذوبان دون الإخلال بيليه.
  5. نقل إلى 14 مل أنبوب العقيمة.
  6. إضافة 5.3 مل من 100 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، N-Lauroylsarcosine 1٪.
  7. إضافة 3.2 غرام من كلوريد السيزيوم (CSCL) وتخلط الأنبوب قبل vortexing.
  8. إضافة 1.8 مل من CSCL / ethylenediaminetetraacetic حامض (EDTA) في العقيمة 11 مل أنبوب الطرد المركزي polyallomer.
  9. مع 10 مل العقيمة باستور ماصة، ونقل الحل RNA على 1.8 مل CSCL / EDTA من الانزلاق ببطء على حافة الأنبوب لتجنب إزعاج سادة كثافة.
  10. وضع أنابيب (أنبوب الثاني يحتوي على مخازن بدون شبكية العين إذا لزم الأمر) في الدوار.
  11. أجهزة الطرد المركزي 24 ساعة عند 32،000 دورة في الدقيقة (225،000 x ج) في 20 درجة مئوية.
  12. إزالة الجزء العلوي من الحل مع ماصة باستير العقيمة، وتجاهل ذلك.
  13. إزالة تدريجيا أثناء التحقق منلحظة عندما يستنشق الحمض النووي (لزج) مع الثاني معقمة باستور ماصة، وتخلص منه.
  14. إزالة الحل المتبقية مع الحرص على عدم الإفراج عن بيليه RNA مع ثلث العقيمة باستور ماصة.
  15. القسم السفلي من أنبوب مع مشرط لهب تعقيمها، ثم وضع الجزء المتبقي من الأنبوب ذلك رأسا على عقب على النظرة العقيمة.
  16. عكس أنبوب وشطف بدقة مع 160 ميكرولتر من GHCl.
  17. السماح للبيليه جافة لمدة 10 دقيقة.
  18. Resuspend وبيليه في 150 ميكرولتر من (10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،5-1 ملي EDTA - 0.1٪ SDS).
  19. نقل الحل إلى 2 مل العقيمة أنبوب microcentrifuge، ثم حصاد بيليه المتبقية مع 30 ميكرولتر من (10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،5-1 ملي EDTA - 0.1٪ SDS).
  20. إضافة 150 ميكرولتر من (10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7،5-1 ملي EDTA).
  21. إضافة 30 ميكرولتر من 3 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.0، دوامة الأنبوب.
  22. إضافة 900 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ (-20 ° C)، دوامة الأنبوب.
  23. وضع أنبوب 30 دقيقة في ذوبان الجليد.
  24. CENtrifuge الأنبوب 30 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
  25. نضح بدقة الكسر القابلة للذوبان، وتخلص منه.
  26. إضافة 500 ميكرولتر الإيثانول 70٪ (RT)، دوامة الأنبوب.
  27. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 20 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة (18،000 XG) في 4 درجات مئوية.
  28. كرر الخطوة الشطف (70٪ من الإيثانول).
  29. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة، والقضاء على الإيثانول المتبقية مع ماصة P200.
  30. السماح الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة.
  31. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر DEPC المعاملة H 2 O.
  32. مزج بقوة قبل vortexing.
  33. احتضان 15 دقيقة عند 45 درجة مئوية في حمام مائي.

3. تحليل الحمض النووي الريبي من قبل الكهربائي جل

  1. صب agarose هلام داخل غطاء الكيميائية.
  2. في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ليتم تحليلها و 6.4 ميكرولتر من العازلة الإعدادية عينة.
  3. في الثانية 1.5 مل أنبوب، إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المعايير و 9.6 ميكرولتر من العازلة الإعدادية عينة.
  4. تسخين أنابيب 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية، ووضعها على الجليد.
  5. إضافة 1 ميكرولتر إيثيديوم بروميد (EB) العازلة تحميل دون صبغ في عينة الحمض النووي الريبي أنبوب و 1 ميكرولتر EB تحميل العازلة مع الصبغة في أنبوب المعايير الحمض النووي الريبي.
  6. تشغيل هلام تحت 80-100 V داخل غطاء الكيميائية في تشغيل المخزن المؤقت، حتى واحد من الأصباغ (برموفينول الأزرق) تصل إلى 2/3 من الجزء السفلي من هلام.
  7. شطف الجل مرتين 15 دقيقة مع 250 مل دي المعالجة DEPC 2X SSC.
  8. التقاط صورة رقمية تحت إضاءة فوق البنفسجية.
  9. حساب النسبة بين الشريط العلوي (23S الرنا الريباسي) وانخفاض الفرقة (16S الرنا الريباسي).

4. تنقية النهائي من الحمض النووي الريبي

  1. ضبط مستوى الصوت من عينة الحمض النووي الريبي إلى 100 ​​ميكرولتر مع DEPC المعاملة H 2 O (إذا لزم الأمر).
  2. إضافة 100 ميكرولتر من حمض الفينول (1 مل ​​الفينول المشبعة في DEPC المعاملة H 2 O + 130 ميكرولتر من 50 ملم من خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2)، دوامة بقوة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة (15،000 XG) في درجة حرارة الغرفة.
  4. يتعافىR بعناية ونقل المرحلة المائية (المرحلة العليا) في رواية العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2 و 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ (-20 ° C).
  6. احتضان الأنبوب 30 دقيقة إلى ذوبان الجليد.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 30 دقيقة في 14،000 دورة في الدقيقة (18،000 XG) في 4 درجات مئوية.
  8. نضح بعناية الكسر القابلة للذوبان، وتخلص منه.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪ (درجة حرارة الغرفة)، ودوامة الأنبوب.
  10. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 20 دقيقة في 14،000 دورة في الدقيقة (18،000 XG) في 4 درجات مئوية.
  11. كرر الخطوة الشطف (70٪ من الإيثانول).
  12. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة، والقضاء على الإيثانول المتبقية مع ماصة P200.
  13. السماح الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة.
  14. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من DEPC المعاملة H 2 O.
  15. احتضان أنبوب ثم 15 دقيقة في 45 درجة مئوية.
  16. قياس الامتصاصية (عبس) في 260 نانومتر و 280 نانومتر في 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي. احتساب نسبة Abs260/Abs280.
    17. <لى> المتجر عينة الحمض النووي الريبي في -80 ° C (مستقر لعدة سنوات).

5. حلول وإجراءات التنظيف

  1. خلات البوتاسيوم 2 M، ودرجة الحموضة 5.0: ذوب 19.6 غرام خلات البوتاسيوم في 70 مل من DEPC المعاملة H 2 O. التنظيف التحقيق متر الرقم الهيدروجيني عن طريق نقع عليه في مع هيدروكسيد الصوديوم 1M لمدة 15 دقيقة، تليها 5 يشطف مع DEPC المعاملة H 2 O. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.0 مع حمض الخليك ثم ضبط مستوى الصوت إلى 100 ​​مل مع DEPC المعاملة H 2 O.
  2. تريس، حمض الهيدروكلوريك 100 ملم، ودرجة الحموضة 8.0، N-Lauroylsarcosine 1٪: ذوب 2 غرام من N-Lauroylsarcosine (تحت غطاء محرك السيارة) في 40 مل من 0.5 M تريس، ودرجة الحموضة 8.0 قاعدة. ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DEPC المعاملة H 2 O.) CSCL / EDTA: 96 غرام من CSCL في 50 مل 10 ملي EDTA 7.5 درجة الحموضة أعدت مع DEPC المعاملة H 2 O. الأوتوكلاف وضبط مستوى الصوت إلى 100 ​​مل مع DEPC المعاملة H 2 O. تحقق من درجة الحموضة <7.5.
  3. agarose هلام 1٪: ضع 1 غرام من الاغاروز في 62 مل DEPC المعاملة H 2 O. تغلي في فرن الميكروويف. إضافة 18 مل من 12.3 Mالفورمالديهايد، 20 مل من اجتماعات الأطراف 5X. صب داخل غطاء الكيميائية.
  4. العازلة عينة الإعدادية: أن تكون على استعداد مرتجل. مزج مادة كيميائية داخل غطاء محرك السيارة 8 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف 5X، 16 ميكرولتر من 12.3 M الفورمالديهايد و 40 ميكرولتر من الفورماميد.
  5. EB تحميل العازلة (بدون صبغ): أن تكون على استعداد مرتجل. إضافة 4 ميكرولتر 10 ملغ / مل بروميد إيثيديوم إلى 20 ميكرولتر من 80٪ الجلسرين أعدت مع DEPC المعاملة H 2 O.
  6. EB تحميل العازلة (مع صبغ): أن تكون على استعداد مرتجل. إضافة 2 ميكرولتر 10 ملغ / مل بروميد إيثيديوم إلى 10 ميكرولتر من 80٪ الجلسرين تحتوي على 0.25٪ xylen cyanol، 0.25٪ الزرقاء برموفينول مع المعاملة DEPC H 2 O.
  7. تشغيل المخزن المؤقت: إلى 60 مل MOPS 5X، إضافة 54 مل من 12.3 M الفورمالديهايد و 186 مل من DEPC المعاملة H 2 O.
  8. DEPC المعاملة H 2 O: الماء المقطر احتضان مع 0.1٪ V / V diethylpyrocarbonate لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع التحريك. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف.
  9. تنظيف الخالط: إضافة 25 مل من محلول التنظيف (RBS) إلى 1 L من DEPC-تعامل H 2 O، وimmerge محور 1 دقيقة مع التحريك. احتضان 2 ساعة على 60 درجة مئوية. شطف جيدا مع DEPC المعاملة H 2 O التفاف الصك إلى الألمنيوم ووضعها في مربع الصك. التفاف مربع. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف.
  10. تنظيف الجهاز الكهربائي: اغسل الجهاز، الدرج والمشط 15 بئرا. احتضان 15 دقيقة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين. شطف مرة واحدة مع الإيثانول بنسبة 100٪. الهواء الجاف.
  11. تنظيف الأطباق الزجاجية: تنظيف الأطباق الزجاجية RBS 2٪ كل ليلة، ثم يشطف بالماء المقطر قبل التعقيم عند 200 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء مجلة (الشكل 1) يسمح لنا استعادة عينات من شبكية العين من كتلة جراحية لتنقية الحمض النووي الريبي، وتحليل Transcriptome على انفصال الشبكية. نتائج انفصال الشبكية في upregulation من الانجذاب الكيميائي الوحيدات MCP1 الجين CCL2، وانخفاض في التعبير عن قضيب مبصرة transducing الجين GNAT1، مخروط موجة قصيرة أوبسين OPN1SW، وhomeogene CRX (الشكل 2). تحريض CCL2 والناتجة عن التهاب 9، في حين أن الحد ي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم وضع إجراءات لاستعادة الأنسجة من كتلة الجراحية الأساسية لتحليل Transcriptome على انفصال الشبكية. ينبغي للمرء أن تلاحظ أن هذا النوع من الجراحة يمارس في حالات الطوارئ وأن أطباء العيون التشغيل لديك القليل من الوقت للمشاركة في برنامج الأبحاث البيولوجية عندما تعمل. يتم تنفيذ هذا retinectomy أيضا عشوائيا في كل خدمة، بحيث أسهل طريقة للوصول إلى أرقام إحصائية هو العمل مع شبكة. في مثل هذه الشبكة، وتوحيد جمع الأنسجة أمر ضروري لنجاح التحليل البيولوجي. من خلال توفير المواد، من السهل جدا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ساشا رايخمان ودومينيك Santiard-البارون لمساعدتهم في تحرير بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
جهاز طرد مركزيبيكمان كولترأفينتي J-E
دواربيكمان كولترJS-5.3
طرد مركزي فائقبيكمان كولترLE 80K
دواربيكمان كولترSW41
مزود الطاقةBioradPac 3000
PolytronTMKinematicaPT 2100الموردة مع PT-DA 2105: 2
جهاز الرحلان الكهربائي لجل الاغاروزالتصوير BioradMiniGel Cell GT
BioradGelDoc-It Imager
5 مل أنبوب البولي إيثيلين المعقمGreiner115261
أنبوب الطرد المركزي المعقم Beckman Coulter331372
الكواشف الكيميائيةSigmaدرجة البيولوجيا الجزيئية (منتجات خالية من RNase و DNase)
محلول التنظيف VWRRBS
رقاقة MicroarrayAffymetrixHuman U133 plus 2 مصفوفة
جهاز نظام

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710(2010).
  3. Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633(1974).
  4. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663(1990).
  5. Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315(1975).
  6. Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261(1981).
  7. Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791(2011).
  8. Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208(2008).
  9. Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425(2007).
  10. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16(2010).
  11. Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74(2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal DetachmentRNA PurificationCesium Chloride UltracentrifugationTranscriptomic AnalysisJouRNAl ProcedureHuman Retinal SpecimensInflammation MarkersPhotoreceptor DegenerationGene Expression AnalysisGel Electrophoresis

Related Articles