Method Article

تقنيات لمعالجة العيون تزرع لهم تعويضات الشبكية لتحليل المرضية المترجمة

DOI:

10.3791/50411

⸱

August 2nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bionics Institute, 2Department of Anatomical Pathology, St Vincent's Hospital Melbourne, 3Department of Pathology, University of Melbourne, 4Medical Bionics Department, University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات لتصور التهندس الخلوي الشبكية المجاورة مباشرة لأقطاب الفردية داخل مشجعا في شبكية العين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع التطورات الأخيرة في شبكية العين الاصطناعية، فمن المهم لتطوير تقنيات موثوق بها لتقييم سلامة هذه الأجهزة في الدراسات قبل السريرية. ومع ذلك، فإن تثبيت القياسية، وإعداد، والإجراءات الأنسجة الآلي ليست مثالية. نحن هنا وصف الإجراءات الجديدة لتقييم صحة شبكية العين المجاورة مباشرة إلى الزرع. الأطراف الاصطناعية الشبكية تحتوي صفائف الكهربائي في اتصال مع أنسجة العين. لم تكن الطرق السابقة قادرة على توطين مكانيا أنسجة العين المجاورة لأقطاب فرد داخل مجموعة. وبالإضافة إلى ذلك، وتجهيز النسيجية القياسية في كثير من الأحيان يؤدي إلى انفصال مصطنعة الإجمالي من طبقات شبكية العين عند تقييم عيون مزروع. وبناء على ذلك، فقد كان من الصعب تقييم الأضرار المحلية، إذا كان موجودا، والناجمة عن زرع والتحفيز من صفيف القطب المزروع. لذلك، قمنا بتطوير طريقة لتحديد وإضفاء الطابع المحلي على الأنسجة العين المجاورة له مزروعlectrodes باستخدام (مرمزة) صبغ مخطط وضع العلامات، ونحن المعدلة تقنية تثبيت العين للحد من انفصال الشبكية مصطنعة. كما أصدرت هذه الطريقة شفافة الصلبة، وتمكين التوطين من الأقطاب الكهربائية الفردية وأجزاء معينة من الزرع. أخيرا، استخدمنا عنصر تحكم مطابقة لزيادة قوة التقييمات التشريحية المرضية. في ملخص، تمكن هذه الطريقة التمييز موثوقة وفعالة وتقييم التهندس الخلوي الشبكية في العين مزروع.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد تصبح طرفا اصطناعيا الشبكية قريبا التدخلات السريرية مفيدة لعلاج مختلف أشكال فقدان البصر الشديد. ظروف معينة، مثل التهاب الشبكية الصباغي (RP)، نتيجة في انحطاط واسع النطاق للخلايا مستقبلة للضوء في العين، وهذه هي الخلايا المسؤولة عن transducing الضوء إلى إشارات العصبية. ومع ذلك، تظل بعض الخلايا في طبقات أخرى من شبكية العين وتكون أهدافا محتملة للالتحفيز الكهربائي مع الشبكية بدلة 1. النتائج في وقت مبكر من تجارب اكلينيكية على البشر واعدة للصفائف القطب مزروع في 2،3 فوق الشبكي، تحت الشبكية 4،5، وداخل الصلبة 6 مواقع. وتتكون هذه الأجهزة من مواد مختلفة ذات أشكال مختلفة، ولكن عليهم ان يستخدموا كل النبضات الكهربائية لتنشيط الخلايا العصبية قابلة للحياة المتبقية من الشبكية من أجل خلق رؤيتين البصرية.

وقد وضعت لدينا مجموعة أوسع (بيونيك الرؤية أستراليا) زرع شبكية العين التي لديها بروخرسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لدراسة تجريبية سريرية مع 3 مرضى RP مزروع مع صفائف القطب suprachoroidal (السريرية عدد المحاكمة: NCT01603576). الشكل 1A يظهر هذا النموذج suprachoroidal بدلة الشبكية.

سلامة المريض أمر بالغ الأهمية في الدراسات السريرية، وبالتالي، قبل بدء التجارب على الانسان، أجرينا اختبار الحادة والمزمنة واسعة في نماذج ما قبل السريرية (1B الشكل). تقييم التشريحية المرضية ضرورية لتحسين العمليات الجراحية، يكرر من خلال تصميم الكهربائي، ووضع في نهاية المطاف سلامة زرع. للحفاظ على سير العمل بكفاءة تتوافق مع الممارسات الباثولوجيا الإكلينيكية القياسية، كان يعمل تقنية التضمين البارافين. كان من المستحسن أيضا للاستفادة من الإجراءات تلطيخ مقارنة مع المعايير السريرية، مثل haematoxylin ويوزين (H & E)، التي يتم تفسيرها بسهولة من قبل الأطباء. أردنا أيضا تقنية التي يمكن تكييفها لتحليلات المناعى، فيبغية مواصلة تيسير تقييم الخلوي للأنسجة.

توافق مع الحياة من المواد المستخدمة في زراعة، وسلامة التحفيز الكهربائي المزمنة، والحاجة إلى إجراء تقييم دقيق. من المهم أن تكون قادرة على دراسة التشريح المرضي للأنسجة العين المجاورة لتحفيز كهربائي فرد داخل مجموعة. ومع ذلك، فإن صفائف ثمة حاجة لإزالة قبل معالجة العينات بحيث يمكن اختبارها، ولأن مكوناتها المعدنية لا يمكن أن يكون مقطوع بسهولة. ونتيجة لذلك، لم إعداد لدينا الأنسجة راسخة لا تسمح التعريب ورسم الخرائط من الأنسجة فيما يتعلق أقطاب كهربائية مزروعة 7. بالإضافة إلى عدم وجود طريقة التعريب الأنسجة، ونتج عن تثبيت المستندة إلى الفورمالديهايد القياسية وتقنيات معالجة القطع الأثرية في نطاق واسع ومفرزة من شبكية العين بسبب إلى انكماش الفرق من مختلف الطبقات من العين (الشكل 2). ونظرا لعدم تجانس رانه شبكية العين، كان من الصعب إجراء مقارنات سليمة مع الأنسجة السيطرة، ولا سيما بالنسبة للقياسات الكمية. هذه القيود مجتمعة معقدة تقييمات دقيقة للأضرار المحتملة الناجمة عن صفائف لدينا مزروع.

هنا نقدم تقنيات رواية للتغلب على هذه القيود. قمنا بتعديل التثبيت وتجهيز التقنيات العين 8-10 المتخصصة للحفاظ على التوافق مع الأنسجة المحتوية على البارافين. قمنا بتعديل البقع النسيجية والمناعية موحدة لتقديم نتائج قابلة للمقارنة، على أساس التغذية المرتدة من علم الأمراض السريرية. بعد جعل شفافة الأنسجة الصلبة، كان يعمل المستندة إلى صبغ لون رمز للاحتفال الأنسجة العين المجاورة لبعضها القطب الفردية، قبل إزالة مجموعة من الفضاء suprachoroidal. عن طريق وضع علامة مجموعة القطب والقطب المواقع الفردية، والعينات ويمكن جمع بدقة من المناطق المجاورة القطب. يمكن جمع عينات مطابقة من اله العين التحكم في النظام لتسهيل المقارنات البشرى.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. قلع وبعد التثبيت

يفترض هذا البروتوكول أن الموضوع قد تم زرعها من طرف واحد مع مجموعة القطب suprachoroidal.

  1. إعداد الحلول POSTFIX في زجاج زجاجات شوت.
    1. حل ديفيدسون تثبيتي، 2X 100 مل
      • 2 مل الفورمالين (37٪ فورمالدهيد)
      • 10 مل حمض الخليك الجليدي (99.7٪)
      • 35 مل ايثانول (98٪)
      • 53 مل من الماء المقطر
    2. 50٪ من الإيثانول، 2X 100 مل
    3. 70٪ من الإيثانول، 2X 100 مل
  2. يروي Transcardially الموضوع مع دافئ (37 درجة مئوية) المالحة heparinized تليها الباردة (4 ° C) محايدة مخزنة الفورمالين (10٪).
  3. ربط الغرز في حوف متفوقة (أو موقع غير بعيد من مجموعة suprachoroidal) من كلتا العينين - تماشيا مع العضلات المستقيمة، لتكون بمثابة علامة فارقة.
  4. عيون استأصل، والحفاظ على أي خيوط الخارجية من العين مزروع.
  5. وضع مجموعة شرق افريقياح العين في 100 مل من محلول ديفيدسون تثبيتي، وترك لمرحلة ما بعد الإصلاح في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد 18 - 36 ساعة في تثبيتي ديفيدسون، ونقل إلى الإيثانول 50٪ (درجة حرارة الغرفة) ل6-8 ساعة، ثم أخيرا إلى الإيثانول 70٪ (درجة حرارة الغرفة).
  7. بردت العينات في 4 درجات مئوية وتخزينها حتى تشريح.

وقد تم تخزين الكرات العين سليمة والضغط بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون أن يؤثر ذلك سلبا على الأنسجة الناتجة.

2. تحديد ورسم الخرائط الأنسجة

بروتوكول تثبيت أعلاه (الخطوة 1) قد أصدرت شفافة الصلبة ومجموعة مرئيا الآن - بما في ذلك مواقع القطب فرد (الشكل 3).

  1. إزالة العالم مزروع من الإيثانول وتقليم بعناية بعيدا الأنسجة الزائدة، بما في ذلك الملتحمة وكبسولة تينون. تقليم العصب البصري إلى 2-3 مم طول (الشكل 3A).
  2. باستخدام النسيجي صبغ ماركينز مخطط، والتسمية الأقطاب مع رمز اللون محددة مسبقا، مع الحرص على عدم طخة الصبغة.
  • اخترنا جناح المتاحة تجاريا من صبغ النسيجية المتخصصة (يرجى الرجوع إلى التذييل). تم تطبيق كميات صغيرة من الصبغة بعناية مع غرامة الرؤوس فرشاة الطلاء (Roymac حجم 00) إلى الأنسجة ويسمح للهواء الجاف لمدة تصل إلى 5 دقائق.
  • لأغراضنا، اخترنا: الأخضر للالقطب النشط (ق) التي كان (كانت) حفز الحد الأقصى، على المستويات suprathreshold، لمدة الدراسة؛ الأحمر لأقطاب نشطة أخرى؛ الصفراء لأقطاب أكبر العودة قطر، و الأزرق للأدلة إضافية و / أو علامات مسافة التشريحية (أرقام 3B و3C).
  • بعض التجربة والخطأ قد تكون هناك حاجة لإيجاد الصبغة التي هي مستقرة في جميع أنحاء الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، في الشكل (4)، يمكن أن ينظر إليه من أن الصبغة الخضراء كان أكثر مرونة من الصبغة الحمراء. تمييع الصبغة في الايثانول 70٪ يساعد على تحسين penet الدهونالتموينية وطلاء الأنسجة.
  • ومن المفيد رسم أو صورة فوتوغرافية في العالم مصبوغ لتكون مرجعا في المستقبل.
  1. العودة إلى 70٪ من الإيثانول إلى يذوى الصبغة.
  2. كرر الخطوة 2.1 لمراقبة العالم unimplanted.
  3. باستخدام الخيوط الجراحية من الخطوة 1.3، محاذاة العين تحكم والعين مزروع كزوج لها نسخ متطابقة.
  4. وضع قالب سيليكون (مع نفس الأبعاد بوصفها مجموعة الكهربائي) في الموقع معكوسة على العين السيطرة حيث يقع على زرع العين مزروع (NB الصلبة العينية شفافة وعلامات صبغ من الخطوة 2.2 سماح التصور استعداد لموقف مجموعة مزروع ).
  5. تنفيذ الخطوات 2.2 و 2.3 للعين التحكم، بحيث يكون كل موقع القطب المزروع لديه زوج التحكم في موقع مشابه تشريحيا (أي مرآة مطابقة ما يعادلها).

3. تشريح وتضمينها

  1. إزالة مجموعة من زرع العين وإزالة الجزء الأمامي من العين(بما في ذلك القرنية، القزحية والعدسة). إزالة السائل الزجاجي من كأس العين المتبقية (الغرفة الخلفية).
  2. تشريح العين مزروع إلى شرائح متعددة ممثل (~ 2 مم سماكة) تحتوي كل منها على مجموعة فرعية من المناطق صبغ ملحوظ (الشكل 3D). لاحظ أن التوجه للشرائط يجب أن يكون محددا للمساعدة في تقييم الجوانب المختلفة للاستجابة الأنسجة لزرع 7.

ومن المفيد، لتكون مرجعا في المستقبل، لجعل رقما قياسيا من المناطق التي صبغ موجودة على كل قطاع ومواقعها النسبية (والألوان).

  1. وضع الشريط على جانبها في بركة ضحلة من أجار المسال (4٪؛ 80-90 ° C) مع الجانب لا بد من تخفيض نزولا تواجه أول (الشكل 3E).
  2. مرة واحدة وقد وضعت آغار، قطع حول العينة ومكان في شريط الأنسجة التي تدعمها إدراج رغوة (الشكل 3F).
  3. كرر الخطوات من 3،1-3،3 للعين التحكم - تاكالرعاية جي لتشريح مرآة مطابقة شرائط.
  4. معالجة كافة أشرطة عبر البارافين تقنية قياسية (الآلي بين عشية وضحاها) وتجهيز.
  5. تضمين الأنسجة المصنعة في البارافين مع الجانب لا بد من تخفيض نزولا تواجه أول.

4. قطع وتلطيخ

  1. قطع كتل البارافين إلى 5 أقسام ميكرون اشارة منتظمة إلى الملاحظات من الخطوات 2 و 3.
  2. جمع المقاطع من كل منطقة من المناطق المصبوغة وجبل على الشرائح.

المنطقة المتاخمة فورا إلى كل بقعة من مصبوغ الصلبة ويمكن الآن أن تقيم مع الثقة أنه كان في القرب الاقرب الى القطب المقابل في مجموعة (الشكل 4).

  1. وصمة عار أو أداء المناعي كما تريد. البقع سبيل المثال والمناعية هو مبين في الشكل (5) هي: H والتقييم؛ Luxol سريع الأزرق (LFB)؛ البنفسجي الكريزيل؛ ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء؛ الدوري حمض شيف (PAS)؛ بيرلز زرقة بروسيا ستافي؛ مخلقة مكافحة الجلوتامين (GS)؛ بروتين مضاد للخيط عصبي (NF)؛ المضادة للالدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) و 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي).
  2. أجريت البقع القياسية والخاصة على النحو المفصل:
    1. تم إجراء H & E تلطيخ وفقا لبروتوكول تقدمها لايكا multistainer حمام مجموعة ST5020 (لايكا النظم البيولوجية).
    2. البنفسجي LFB والكريزيل (معدلة من 11):
      1. Dewax في 3 تغييرات الزيلين (3X 2 دقيقة) و 2 تغييرات من الإيثانول (100٪، 100٪) (2X 1 دقيقة)، وشطف في ماء الصنبور (45 ثانية).
      2. أقسام هيدرات إلى 95٪ من الإيثانول.
      3. المكان في حل LFB 11 في 37-42 درجة مئوية (بين عشية وضحاها).
      4. شطف الزائدة وصمة عار مع الايثانول 70٪.
      5. شطف في الماء المقطر.
      6. مكان في كربونات الليثيوم المخففة (8٪) (بضع ثوان).
      7. التفريق في الايثانول 70٪ (بضع ثوان).
      8. شطف في الماء المقطر.
      9. كرر الخطوات من 4.4.2.6 إلى 4.4.2.8، إذا لزم الأمر، حتى بackground هو عديم اللون.
      10. مكان في الكريزيل البنفسجي خلات حل العاملة عند 37 ° C (10 دقيقة).
      11. لا يغسل في الماء.
      12. يذوى في 3 تغييرات من الكحول المطلق (1X 30 ثانية، 20 ثانية 2X) و 3 تغييرات الزيلين (1X 1 دقيقة و 30 ثانية، 2X 1 دقيقة).
      13. جبل وساترة مع DPX.
    3. ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء (معدلة من 11):
      1. Dewax حسب 4.4.2.1.
      2. جلب المقاطع على المياه (2 دقيقة).
      3. وصمة عار على النوى باستخدام الحديد haematoxylin بحسب فايغرت (2 دقيقة).
      4. تغسل في ماء الصنبور، وشطف في الماء المقطر.
      5. وصمة عار في Biebrich القرمزي الحمضية حل فوكسين (5 دقائق).
      6. شطف في الماء المقطر.
      7. التفريق في حمض الفسفومولبديك-الفسفوتنغستيك حتى الكولاجين وردي شاحب (6 دقائق).
      8. شطف في الماء المقطر.
      9. مباين في زرقة الأنيلين (1 دقيقة).
      10. يغسل جيدا في حامض الخليك 1٪ (1 دقيقة).
      11. يذوى، وجبل ساترة كما عإيه 4.4.2.12 4.4.2.13 و.
    4. PAS (معدلة من 11):
      1. Dewax حسب 4.4.2.1.
      2. أكسدة حامض في الدوري 1٪ (15 دقيقة).
      3. يغسل في المياه الجارية الماء ثم المقطر.
      4. وصمة عار في كاشف شيف (15 دقيقة).
      5. يغسل في الماء (5 دقائق).
      6. مباين مع هاريس haematoxylin (1 دقيقة).
      7. غسل لفترة وجيزة في مياه الحنفية.
      8. التفريق في 0.5٪ كحول حامض (1 مجمع دبي للاستثمار).
      9. يغسل جيدا في ماء الصنبور.
      10. الأزرق في مياه الحنفية سكوت (1 دقيقة).
      11. يغسل جيدا في الماء.
      12. يذوى، وجبل ساترة وفقا 4.4.2.12 4.4.2.13 و.
    5. بيرلز البروسي الأزرق وصمة عار كما هو موضح في 11.
  3. تم تنفيذ تلطيخ المناعي كما هو مفصل:
    1. Dewax حسب 4.4.2.1.
    2. شطف في الماء المقطر (2X 5 دقائق).
    3. أداء استرجاع مستضد باستخدام 0.01٪ العازلة سيترات، ودرجة الحموضة 6 في 75 - 80 درجة مئوية (20 دقيقة) علىد السماح لتبرد في 0.01٪ سيترات حل العازلة (20 دقيقة).
    4. غسل المقاطع في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (2X 5 دقائق).
    5. Permeabilize غشاء الخلية في غسل حل العازلة (10 دقيقة).
    6. احتضان في حل كتلة المصل (2 ساعة).
    7. احتضان المقاطع في الأجسام المضادة الأولية مخففة في واحد مخفف الأضداد (10٪ عادي الماعز serum/0.1٪ تريتون X-100/PBS) (بين عشية وضحاها في الثلاجة). يظهر عيار من كل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الجدول 1.
    8. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، ويغسل المقاطع في غسل حل العازلة (5X 3 دقيقة). من هذه النقطة، والحفاظ على المقاطع في الظلام.
    9. احتضان المقاطع في الضد الثانوية المقابلة في عيار 1:500 لمدة محددة (انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل).
    10. غسل المقاطع في غسل حل العازلة (3X 5 دقائق).
    11. احتضان المقاطع في دابي (1:25،000 / PBS) (30 دقيقة).
    12. غسل المقاطع في غسل حل العازلة (3X 5 دقائق).
    13. جبل وساترة باستخدام فلورةوسائل الاعلام تركيب NT.

عينات الاختبار وعينات مراقبة مستعدون للمقارنة البشرى.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 4 مقطع ممثل الحصول عليها من قطع العينة هو مبين في الشكل (3). تم قطع الجزء في سمك 5 ميكرون والملون مع H & E وفقا للبروتوكولات الموصوفة أعلاه. هو الحفاظ على الشكل الإجمالي للقطاع عينة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية الأنسجة الفرق (الشكل 4A). كانت كل علامات مرئية على صبغ الصلبة، على الرغم من أن الصبغة الخضراء كان أكثر مرونة من الأحمر (الشكل 4B). وكانت طبقات الشبكية لا فصل artifactually ويتم الاحتفاظ مورفولوجيا الشبكية (4C الشكل). الأنسجة الشبكية المجاورة للعلامات صبغ، والتي تتطابق مع الموقع من الأقطاب الكهربائية في الصفيف، يمكن التعرف بسهولة.

ويبين الشكل 5 تلطيخ الممثل الخاص والمناعية من أقسام الأنسجة أعدت وفقا للبروتوكول الحالي. الرجوع إلى الشكل 5 captioن والتكميلية مواد لمزيد من التفاصيل على بقع محددة والتعديلات التي أدخلت على استخدامها. كانت مرحلة ما بعد التعديل، وهذه البقع والمناعية يعادل المعايير الموضوعة - كما تم التحقق منها من قبل الأطباء.

نوع من الأجسام المضادة الأولية وعيار (بين قوسين) GFAP (1:1500) NF200 (1:100) GS (1:100)
نوع من الأجسام المضادة الثانوية وعيار (بين قوسين) فلور اليكسا 594 فلور اليكسا 488 فلور اليكسا 488
مدة الحضانة من الأجسام المضادة الثانوية 1 ساعة 2 ساعة 45 دقيقة

الجدول 1. نوع الأجسام المضادة، وعيار المدة من وصفها.

figure-results-1
الشكل 1. Suprachoroايدال النموذج الكهربائي صفيف. A) صورة ماكرو من الصف مجموعة مصبوب السريرية. B) صورة مجهرية من مجموعة قبل السريرية اليدوية.

figure-results-2
الشكل 2. واستخدمت الأنسجة الشبكية السابق. الطرق القياسية النسيجي لإعداد هذه، H & E الملون، أقسام العين مزروع مع مجموعة القطب suprachoroidal. أ) قسم متعامد من خلال تجويف مجموعة الكهربائي (يصور نجم). يتم فصل الشبكية من نسيج العين الخارجي. هذا واضح بشكل خاص تحت منطقة مزروع (السهم). فمن المستحيل لتحديد أي جزء من شبكية العين والمجاورة لبعضها القطب الفردية للمجموعة. Scalebar = 1 مم. ب) التكبير أعلى من المنطقة محاصر في لوحة A. هناك عدة، متباعدة بصورة منتظمة، والتحف في لاي الشبكيةRS (السهام)، وكذلك مفرزة كبيرة من الطبقة بساطي (طبقة عاكسة في عيون القطط). Scalebar = 100 ميكرون. C) التكبير أعلى من المنطقة محاصر في لوحة B. وأشارت سهم القطاعات الخارجية للخلايا مستقبلة للضوء، وكذلك ظهارة مخضب، والتي لا تزال سليمة، مما يدل على أن مفرزة كان من الآثار الجانبية مصطنعة للتجهيز، بدلا من ان يكون سببها في الجسم الحي صدمة أو أمراض. Scalebar = 20 ميكرون.

figure-results-3
الشكل (3). توطين وتشريح الكهربائي متجاورة الأنسجة. م) مجموعة ديناميكية عالية والصور، الماكرو من العين منزوعة النواة، مع مجموعة والقطب suprachoroidal في الموقع. أ) وظيفة ثابتة مع تثبيتي ديفيدسون، وقبل إزالة مجموعة، والصلبة شفافة تمكن من التصوريتم استخدام أقطاب الفردية في مجموعة (يشار مثال واحد مع السهم). B) يتم وضع علامة على الأقطاب مع لون صبغة محددة مسبقا. C) علامات صبغ في تباعد العادية من المعالم التشريحية للحفاظ على التناسق عبر التجارب. د) لدى وإزالة صفيف، يتم تشريح العين باليد إلى شرائح العينة. السهام الملونة تشير إلى اثنين من المواقع المتاخمة القطب على الصلبة. أصفر خط متقطع يدل طائرة من باجتزاء. E) الكلي صورة من قطاع عينة جزءا لا يتجزأ من داخل كتلة آغار. F) صورة ماكرو من قطاع عينة أجار محتوى غير مناسب من لوحة E، قطع ووضعها في كاسيت التضمين بدعم من رغوة منصات خزعة لتقليل حركة المقطع أثناء معالجة.

figure-results-4
الشكل 4. علم الأنسجة الشبكية الجديدة. ترونج> الشريط العينة أعلاه (من الشكل 3D)، الذي يحتوي على جيب القطب، وكان البارافين جزءا لا يتجزأ، مقطوع في 5 ميكرومتر والملون مع H & E. A) الخضراء والمناطق مصبوغ الأحمر (المشار إليها السهام، نفس الشكل 3D) واضحة في قسم المتخذة على مستوى خط أصفر متقطع في 3D الشكل. شريط مقياس = 1،000 ميكرومتر. لا يتم فصل شبكية العين، لا تحت جيب مجموعة ولا عن بعد. B) منطقة محاصر من لوحة A مع مرئية صبغ أحمر وأخضر يتبين من السهام، وشبكية العين سليمة في جميع أنحاء. شريط النطاق = 500 ميكرومتر. C) منطقة محاصر من لوحة B، والتي تبين سليمة، المرفقة، شبكية العين المتاخمة للالصبغة الخضراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. مع العلم أن موقع الصبغة يشير إلى موقف من إلكترود، يمكننا تقييم بثقة أنسجة الشبكية المجاورة عن الأضرار، إن وجدت، والناجمة عن التحفيز الكهربائي.

ve_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما "> figure-results-5
الشكل 5. أمثلة من cytohistochemistry الشبكية تعديلها باستخدام البقع الخاصة والمناعي. استخدام مثبت ديفيدسون، بدلا من التقنيات القياسية الفورمالين التثبيت، والتعديلات المطلوبة لالبروتوكولات تلطيخ المعتادة، على النحو المبين في نص البروتوكول الرئيسي. وقد أكد الطب الشرعى أن هذه التعديلات أدت إلى تلطيخ ما يعادلها. A) H والتقييم؛ haematoxylin البقع الخلية نواة باللون الأرجواني بينما يوزين البقع السيتوبلازم الخلية، والكولاجين والأنسجة الداعمة ظلال مختلفة من اللون الوردي. B) LFB البقع الزرقاء المايلين في حين أن مباين البنفسجي الكريزيل يمكن استخدامها ل . تحديد الخلايا العقدية التي كتبها تلطيخ أجسام نيسل في الزرقاء حوائط النواة وتسليط الضوء على الخلايا الأقمار الصناعية المحيطة خلايا C) ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء، وBiebrich القرمزي الحمضية فوكسين حل البقع العضلات فايBERS الأحمر، في حين أن البقع الزرقاء الأنيلين الكولاجين، في هذه الحالة الصلبة، الأزرق D) PAS؛. مكونات بروتين سكري من الغشاء القاعدي ومكونات النسيج الضام هي ملطخة الأرجواني، في حين أن haematoxylin counterstains الخلية نواة الأرجواني E) بيرلز زرقة بروسيا.؛ في موقع النزف، وتشكيل haemosiderin من تدهور خلايا الدم الحمراء وإطلاق مجمعات الحديد ينتج اللون الأرجواني بينما إضافة محايدة الألوان وصمة عار أحمر أحمر الجسيمات الحالة F) GS؛. هذا الناقل العصبي انزيم المهينة وجدت في خلايا مولر 13 (الأخضر )، يمكن أن ينظر تمتد في كلا الاتجاهين مع أجسام الخلايا مولر في الطبقة النووية الداخلية ومولر endfeet الخلية تشكيل تحد من الغشاء الداخلي G) NF-200؛. هذه السلسلة الثقيلة البروتين هيكل الخلية (الخضراء) وجدت في سوما الخلية والعمليات ، crosslinks مع neurofilaments أخرى للحفاظ على بنية الخلايا العصبية 14،15. عقدةويمكن رؤية الخلايا والمحاور العصبية في طبقة الخلايا العقدية وطبقة من الألياف العصبية، في حين يتم تسليط الضوء أيضا محاور عصبية من الخلايا الأفقية الموجودة في الحدود الخارجية للطبقة النووية الداخلية في شبكية العين القطط،. Counterstaining مع دابي (الأزرق) يسمح التصور من طبقات الشبكية H) GFAP؛. هذا البروتين هيكل الخلية (الحمراء) انتشرت في خلايا مولر والخلايا النجمية خلال دباق 16، ويمكن رؤية بطانة طبقة الألياف العصبية مع الخلايا مولر تشكيل ملحقات رقيقة من خلال الداخلية ل طبقات الشبكية الخارجي. Counterstaining مع دابي (الأزرق) يسمح لتصور من طبقات الشبكية. شريط النطاق = 50 ميكرومتر في كل اللوحات. يظهر الشبكية الداخلية في أعلى كل صورة؛ يظهر شبكية العين الخارجي في أسفل كل صورة، باستثناء لوحة E، مما يدل على تفاعل subscleral.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم سلامة زرع هو الاعتبار الأول للدراسات ما قبل السريرية. قبل بدلة الشبكية يمكن زرعها في البشر فمن الضروري للتحقق من أنه لن يسبب أي ضرر. هذا يتطلب تقييما من كل من توافق مع الحياة زرع 17-23 وكذلك أي ضرر المحتملة التي يمكن أن تسببها التحفيز الكهربائي المزمنة 24-26. تجربة مع الأطراف الاصطناعية العصبية مماثلة، مثل زرع قوقعة الأذن، يوفر نظرة ثاقبة على مجموعة واسعة من التحفيز، والمادية، والمعلمات التي لا تتسبب في تلف الأنسجة 27. ومع ذلك، فإن شبكية العين لديه خصائص مختلفة إلى مواقع أخرى، وغرس حدود السلامة بالتالي دقيقة (مثل كثافة الشحنة الأقصى) لا يمكن افتراض من الدراسات السابقة في أنظمة أخرى. الكثافات التهمة هي أعلى في مواقع القطب بالموقع وهذا يتوافق مع أعظم احتمال حدوث ضرر. ولذلك وسيلة لإضفاء الطابع المحلي على الأنسجة المجاورة مباشرةإلى الأقطاب النشطة الفردية من شأنه أن يزيد كثيرا من فائدة هذه الدراسات. النسيج المجاور لمناطق معينة من زرع ويمكن أيضا أن أبرز لتوثيق التفتيش. يسمح هذا النهج استهدفت أقسام أقل ليتم تحليلها، مع الإبقاء ثقته بأن "السيناريو الأسوأ" تم فحص.

طريقة التعريب صبغ الصلبة وصفها هنا وقد تم اختبار على نطاق واسع مع ناحية الشكل ومصبوب سيليكون / صفائف الكهربائي حزب العمال 28-30. وقد تم استخدامه مع الأغشية الرقيقة صفائف مادة البولي أميد 7،31 وأيضا الأغشية الرقيقة سيليكون / حزب العمال صفائف 32. بعض الدراسات بدلة الشبكية المستخدمة "رصاصة على شكل" الأقطاب الكهربائية مع زرع داخل الصلبة 33. وينبغي أن تكون هذه التقنية موجودة فعالة لتقييم هذا النوع من المصفوفات القطب. عيون القطط مع الصلبة رقيقة (سمك في القطب الخلفي 90-200 ميكرون) يسمح التصور من الأقطاب الكهربائية الفردية في صفيف. ومع ذلك، حتى لو الكهربائية الفرديةدي كانت غير مرئية، مواقفها يمكن الاستدلال بسهولة باستخدام قالب سيليكون عندما الخطوط العريضة للمجموعة ويمكن رؤية (مماثلة لتلك المستخدمة في الخطوة 2.6).

يحد من رسم الخرائط صبغ الحاجة إلى الحصول على أقسام الأنسجة غير ذات الصلة كما يتم الحصول على المقاطع فقط مع الحاضر صبغ. القدرة على الاستدلال بدقة موقف القطب يسمح ليس فقط تحليل الأنسجة ذات الصلة وزيادة القوة الإحصائية، ولكن لديه تأثير كبير على الوقت وإدارة التكاليف من خلال تقليل كمية من الشرائح وريش المستخدمة فضلا عن تكلفة اليد العاملة. استخدام الصبغة التي هي ملتصقة ويمكن أن تحمل معالجة الأنسجة في حين يجري أيضا واضحة في أقسام الأنسجة غير ملوثين من الاعتبارات الأولية الهامة. معرفة مكان وجود صبغة واتجاه النسيج في تشريح وخلال تضمين يساعد عملية التقطيع. وهذا يشمل orientating كتلة لتحقيق المقطع الذي لم يتم قطع بشكل غير مباشر بشكل صحيح ويعطي representati كاملعلى من الأنسجة. ولذا فمن المهم أن الشخص الذي يؤدي القطع موجودا في ذلك الوقت من تطبيق صبغ، تشريح والتضمين.

بروتوكول العام هو قوية لتعديلات طفيفة، خاصة مع توقيت التثبيت. ومع ذلك، فإن تشريح العين وخطوات وضع العلامات صبغة والإجراءات الدقيقة التي تستفيد من البراعة اليدوية جيدة لتجنب إتلاف العينة. في حين أثبت تثبيتي ديفيدسون فعالة للحد من مفرزة مصطنعة من شبكية العين بالقرب من زرع، فإنه لا يمنع التلف الميكانيكي المباشر أثناء تشريح. وكان تثبيتي ديفيدسون غير متوافق بسهولة مع بعض الإجراءات النسيجية والمناعية الخاصة. ولذلك كانت هناك حاجة لتعديل / تحسين هذه الخطوات على النحو المفصل أعلاه. تم إجراء تغييرات تدريجية في أوقات تلطيخ وتركيزات حتى تم تحقيق النتيجة المثلى - لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى المواد التكميلية.

الكمي لشبكية العينعلم الأنسجة ما زالت تشكل معضلة. شبكية العين هي غير متجانسة وكلا من سماكة وتغير كثافة الخلية مع زيادة المسافة من الباحة المركزية 34،35. ولذلك، الأنسجة المجاورة داخل العين مزروع لا يمكن استخدامها لإجراء مقارنات ويعمل على العين السيطرة بدلا من ذلك. البشرى مطابقة من كل قسم مع العين سيطرة يعطينا المقارنة الإحصائية أكثر قوة من التغيرات المرضية، ويتم تقييم النتائج فعالية وسلامة مع الأطراف الاصطناعية الشبكية أفضل عند مقارنة عيون الزميل في 36 موضوع. يجب إيلاء عناية خاصة لتقليل القطع المائل وهذا من شأنه أن يؤثر على التقدير الكمي.

وباختصار، فإن الأساليب المذكورة أعلاه قد تحسنت بشكل ملحوظ تحليلنا التشريحية المرضية، والذي بدوره أدى إلى سير العمل قبل السريرية أكثر كفاءة. أدت نتائج الدراسات قبل السريرية باستخدام هذه الطرق مباشرة لتجربة سريرية في المرضى RP 3 التي تم زرعها بأمان مع suprachoroiالدال الأطراف الاصطناعية في شبكية العين. هذه الأساليب هي ذات الصلة على حد سواء إلى التحفيز والتشجيع الشبكية ويزرع العينية الأخرى حيث يحتاج استجابة مرضية لزرع المدى الطويل التي سيتم تقييمها. قدمت هذا الأسلوب مزايا جديرة بالاهتمام للمحافظة على التهندس الخلوي وتسجيل علم الأمراض إلى مناطق الفائدة على الزرع. على الرغم من عدم اختباره بوجه خاص، على تعديل هذه الإجراءات يمكن أن تستخدم في الأنواع الأخرى والمواقع التشريحية الأخرى، ولا سيما حيث يتم زرع مجموعة بشكل سطحي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أشكر: السيدة أليكسيا سوندرز والسيدة ميشيل McPhedran للمساعدة التجريبية، والسيدة هيلين فنغ لتصنيع الكهربائي، والدكتور بيني ألين والدكتور جوناثان يوه للحصول على المساعدة الجراحية؛ أركان العين الفيكتوري الملكي ومستشفى الأذن والبيولوجي مركز البحوث للرعاية الحيوان؛ البروفيسور روب الراعي لتوجيهات عامة في جميع أنحاء، والدكتور بريوني Nayagam والسيد رونالد ليونج للتعليق الحرجة على شكل مسودة للمخطوطة.

تم تنفيذ هذا العمل في معهد الإلكترونيات الحيوية ومستشفى سانت فنسنت في ملبورن. تم توفير التمويل من قبل مؤسسة إيان بوتر، جون ريد T الجمعيات الخيرية، ومجلس البحوث الأسترالي من خلال مبادرة خاصة للبحوث في بيونيك الرؤية العلوم والتكنولوجيا منحة لبيونيك الرؤية أستراليا (BVA). يعترف معهد الإلكترونيات الحيوية الدعم الذي تتلقاه من حكومة فيكتوريا من خلال برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام الوسم ديفيدسونمنتجات برادلي1163-4 - أحمر 1163-5 - أزرق 1163-2 - أصفر 1163-1- أخضر 
الأرانب متعدد النسيلة المضادة للبروتين الليفي الحمضي الأجسام المضادةMilliporeAB58041: 1500 ، حضانة بين عشية وضحاها
الفأر أحادي النسيلة المضاد للجلوتامين سينثيتاز الأجسام المضادةMilliporeMAB3021:100 بين عشية وضحاها حضانة
الفأر أحادي النسيلة المضاد للخيوط العصبية 200 الأجسام المضادةسيجما-ألدريتشN01421:100 حضانة بين عشية وضحاها
4 '، 6-دياميندينو-2-فينيليندول ، ثنائي اللاكتات (ثنائي اللاكتات)Life TechnologiesD35711:25,000 30 دقيقة حضانة
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgGLife TechnologiesA110291:500
Superfrost 90° الأصفرGrale ScientificSF41299 
فليكس IHC مجهر الشرائحDAKOK802021-2 
Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للأرانب IgGLife TechnologiesA110371:500
مصل الماعزالعادي Life TechnologiesPCN500010٪ مصل / 0.1٪ Triton X-100 / PBS

<قوي > غير قياسي تحضير الحل للبقع الخاصة < / قوي >< / p >

1٪ محلول مخزون كريسيل البنفسجي المائي < م>< / p>

  • Cresyl البنفسجي 1 g< / li>
  • الماء المقطر 100 مل < / li> < / ul>

    Cresyl Violet Acetate Working Solution< / em>< / p>

    • 1٪ محلول مخزون بنفسجي كريسيل مائي 9 مل < / li>
    • الماء المقطر 51 ml< / li>
    • 10٪ حمض الأسيتيك 0.5 مل < / li> < / ul>

      Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution< / em>< / p>

      • 1٪ بيريش القرمزي 90 مل < / li>
      • 1٪ حمض فوشسين 10 مل < / li>
      • حمض الخليك الجليدي 1 مل < / li> < / ul>

        محلول حمض الفوسفوموليبديك-الفوسفاتتونغستيك< م >< / ف >

        • حمض الفوسفوموليبديك 2.5 جم < / li>
        • حمض الفوسفوتونغستيك 2.5 جم < / li>
        • الماء المقطر 100 مل < / li> < / ul>

          محلول الأنيلين الأزرق < / em>< / p>

          • أنيلين أزرق 2.5 جم < / li>
          • حمض الخليك الجليدي 2 جم < / li>
          • الماء المقطر 100 مل < / li> < / ul>

            <قوي>حلول للكيمياء المناعية< / strong>< / p>

            محلول عازلة الغسيل< / em>< / p>

            • 0.1٪ Triton X-100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) < / li> < / ul>

              مصل كتلة المصل < / em>< / p>

              • 10٪ مصل الماعز العادي / 0.1٪ تريتون X-100 في فئة PBS< / li> < / ul>

                <مادة قوية > تكميلية < / قوية >< / ص > < ص فئة = "jove_content" ><م >Luxol Fast Blue < / em >< / p > < p class = "jove_content" > كان الغرض من أداء صبغة Luxol Fast Blue (LFB) هو تحديد الخلايا العقدية في طبقة الخلية العقدية من خلال بقعة الكريسيل البنفسجي. بينما يلطخ LFB المايلين ، ترتبط صبغة كريسيل البنفسجي بمواد Nissl في الخلايا العصبية ، والتي تتكون من شبكة إندوبلازمية خشنة والريبوسومات. تحتوي العديد من الخلايا في شبكية العين على مادة نيسل بما في ذلك خلايا أماكرين. عادة ما توجد هذه الخلايا في الطبقة الحدودية الداخلية للطبقة النووية الداخلية ، ولكن يمكن العثور على خلايا amacrine النازحة في طبقة الخلية العقدية. يساعد تلطيخ مادة Nissl في التمييز بين الخلايا العقدية الكبيرة الملطخة بشدة وخلايا amacrine النازحة الأصغر. للمساعدة في تصور هذه الخلايا ، قمنا بتعديل بروتوكول محلول العمل البنفسجي cresyl عن طريق زيادة حجم محلول مخزون كريسيل البنفسجي في محلول العمل. قمنا بزيادة الحجم بزيادات 1.0 مل من 6.0 مل إلى 9.0 مل ، مما أدى بدوره إلى تقليل حجم الماء المقطر. من خلال تقييم سهولة تصور الخلايا العقدية وتحديدها ، تم تحقيق التلوين الأمثل باستخدام 9 مل من محلول مخزون كريسيل البنفسجي الإضافي و 51 مل من الماء المقطر. كريسيل البنفسجي هو صبغة أساسية ، على الرغم من أنه لصبغ مادة Nissl ، يجب استخدامه في محلول حمضي ، وبالتالي ظل حجم حمض الأسيتيك دون تغيير عند 0.5 مل < / p>

                Periodic Acid Schiff < / em >< / p>

                تم إجراء بقعة Schiff الحمضية الدورية (PAS) لتسليط الضوء عليها السكريات وخاصة الجليكوجين ، الموجودة في الأغشية القاعدية وجدران الخلايا الفطرية ، مما يشير إلى عدوى فطرية. تتمثل عملية صبغة PAS في أكسدة مجموعات الهيدروكسيل في السكريات باستخدام حمض دوري ، مما ينتج عنه مجموعات الألدهيد. يرتبط تطبيق كاشف شيف بمجموعات الألدهيد التي تنتج لونا أرجوانيا مع تلطيخ الهيماتوكسيلين الذي ينتج نواة خلية أرجوانية. أظهرت شرائحنا تلطيخا ضعيفا في الغشاء المحدد الداخلي. قد يكون هذا بسبب السكريات الموجودة ، حيث لا يمكن أكسدة جميع السكريات بإطار زمني قياسي ، خاصة تلك التي تحتوي على السكريات الأنيونية. لذلك قمنا بزيادة مدة خطوة الأكسدة من 10 دقائق إلى 12 و 15 و 20 دقيقة. وجدنا أن خطوة الأكسدة لمدة 15 دقيقة كانت أكثر فاعلية في تلطيخ PASS.< / p>

                Masson ' s ثلاثي اللون الأزرق < / em >< / p >

                مبدأ وصمة عار ماسون الزرقاء ثلاثية الألوان هو تلطيخ الكولاجين والعضلات ، والتي يمكن استخدامها في شرائح الشبكية للإشارة إلى زيادة في أنسجة الكولاجين التي قد تشير إلى التليف بسبب الإصابة. هذه البقعة حساسة لتقنيات التثبيت ، لذلك كانت هناك حاجة إلى تعديلات للحصول على تلطيخ مثالي. تتمثل عملية هذه البقعة في تلطيخ السيتوبلازم وألياف العضلات باللون الأحمر في البداية باستخدام صبغة الفوشين الحمراء الحمضية Biebrich القرمزية. يتنافس التمايز مع حمض الفوسفوموليبديك / الفوسفوتونغستيك مع الصبغة الحمراء في ألياف الكولاجين. في الصلبة ، تكون جزيئات حمض الفوسفوموليبديك / الفوسفوتونغستيك الكبيرة قادرة على اختراق النسيج الضام الرخو ، على عكس ألياف العضلات الكثيفة التي يمكن اختراقها للجزيئات الصغيرة فقط. ثم يتم تطبيق صبغة الأنيلين الزرقاء لتحل محل الحمض الموجود في ألياف الكولاجين التي تنتج الصلبة المصبوغة باللون الأزرق. لتحسين هذه البقعة في أقسام الشبكية ، تم تقليل مدة التلوين بصبغة فوكسين حمض بيبريتش القرمزي لخلق توازن بين الصبغة الزرقاء والحمراء. يتطلب استخدام مثبت ديفيدسون أيضا وقتا ممتدا للتمايز لإزالة الصبغة الحمراء من الكولاجين. قمنا بتجربة التمايز في 5 و 6 و 8 و 10 دقائق ، مع ظهور أفضل النتائج في 6 دقائق. يختلف التمايز أيضا حسب سمك وقطع المقاطع الملساء ، مع احتمال أن يكون التمايز أكثر من 6 دقائق مطلوبا.< / p>

                الأجسام المضادة للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) < / em >< / p >

                متعدد النسيلة ، الأنواع المضيفة هي الأرانب ، يبلغ وزنها الجزيئي 50 كيلو دالتون. مستضد GFAP هو خيوط وسيطة موجودة في السيتوبلازم (سيتوبلازم الخلايا النجمية و M & uuml ؛ خلايا ller في شبكية العين) ، يتكون المستضد من 428 من الأحماض الأمينية وله وزن جزيئي يبلغ 49512 Da.< / p>

                Neurofilament-200 الجسم المضاد < / em>< / p>

                أحادي النسيلة ، النوع المضيف هو الفأر ، استنساخ N52 ، النمط المتماثل IgG1 ، يتعرف على الأشكال الفسفرية وغير الفسفرية للخيوط العصبية الثقيلة التي يبلغ وزنها الجزيئي 200 كيلو دالتون. سوف يرتبط الجسم المضاد بحاتمة في مجال ذيل الخيوط العصبية. سوف يلطخ الجسم المضاد الخيوط العصبية في البريكاريا العصبية والتشعبات والمحاور.< / p>

                الجلوتامين سينثيتاز (GS) الجسم المضاد< / em>< / p>

                أحادي النسيلة ، استنساخ GS-6 ، الأنواع المضيفة هي الفأر ، وله وزن جزيئي يبلغ 45 كيلو دالتون والنمط الإسوي للجسم المضاد IgG2a. تم العثور على مستضد GS في سيتوبلازم الخلية (سيتوبلازم M & uuml; خلايا ller في شبكية العين) ، يحتوي المستضد على 373 من الأحماض الأمينية ووزنه الجزيئي 42،064 Da.< / p>

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santos, A., Humayun, M. S., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
  2. Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
  3. Roessler, G., Laube, T., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
  4. Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
  5. Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).
  6. Fujikado, T., Kamei, M., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).
  7. Villalobos, J., Allen, P. J., et al. Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).
  8. Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).
  9. Agrawal, R. N., He, S., et al. In vivo models of proliferative vitreoretinopathy. Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).
  10. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).
  11. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , 6, Churchill Livingstone. (2008).
  12. Horobin, R. W., Bancroft, J. D. Troubleshooting histology stains. , Churchill Livingstone. (1998).
  13. Pow, D. V., Robinson, S. R. Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia. Neuroscience. 60, 355-366 (1994).
  14. Lewis, S. E., Nixon, R. A. Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments. J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).
  15. Ruiz-Ederra, J., García, M., Hicks, D., Vecino, E. Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells. Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).
  16. Bringmann, A., Pannicke, T., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Seo, J. M., Kim, S. J., et al. Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation. Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).
  18. Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit. J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).
  19. Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).
  20. Walter, P., Szurman, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
  21. Pardue, M. T., Stubbs, E. B. Jr, et al. Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays. Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).
  22. Gekeler, F., Szurman, P., et al. Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).
  23. Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  24. Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  25. Ray, A., Colodetti, L., et al. Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation. Brain Res. 1255, 89-97 (2009).
  26. Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits. J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).
  27. Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes. Biomaterials. 6, 237-242 (1985).
  28. Villalobos Villa, J. Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , The University of Melbourne. (2012).
  29. Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2012).
  30. Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model. in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2011).
  31. Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration. J. Neural Eng. 9, 036009(2012).
  32. Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil. J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).
  33. Morimoto, T., Kamei, M., et al. Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).
  34. Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. Wolff's anatomy of the eye and orbit. , Arnold. (2001).
  35. Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. Distribution and coverage of beta cells in the cat retina. J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).
  36. Dagnelie, G. Psychophysical evaluation for visual prosthesis. Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal ProsthesisHistopathological AnalysisTissue Dye MarkingEye Fixation TechniqueAgar StabilizationParaffin EmbeddingBrightfield MicroscopyImmunofluorescence MicroscopySclera TranslucencyMatched Control

Related Articles