مقالة منهجية

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

DOI:

10.3791/50425

⸱

نوفمبر 14, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا محسنا ومفصلا للتلوين المناعي المزدوج في أقسام الجهاز العصبي المركزي للفئران (CNS) والعقدة الليمفاوية الطرفية (LN) المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المناعية (IHC) يوفر محددة للغاية، موثوقة وجذابة التصور البروتين. الأداء الصحيح والتفسير لوضع العلامات متعدد الألوان استنادا IHC-هو أمر صعب، خصوصا عندما تستخدم لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة في الأنسجة ذات المحتوى العالي من الدهون مثل الجهاز العصبي المركزي (CNS).

ويمثل بروتوكول لدينا صقل تقنية immunolabeling القياسية المعدلة وخاصة للكشف عن كل من البروتينات الهيكلية والقابلة للذوبان في الفئران الجهاز العصبي المركزي والغدد الليمفاوية الطرفية (LN) تتأثر neuroinflammation. ومع ذلك، مع أو من دون مزيد من التعديلات، يمكن أن المرجح أن تستخدم بروتوكول لدينا للكشف عن أهداف البروتين الأخرى ذات الصلة، حتى في الأجهزة والأنواع الأخرى من المقدمة هنا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى الرغم من استخدام متقدمة عالية الإنتاجية التحليلات التي أجريت على methylome، Transcriptome على أو حتى مستوى بروتيوم، لا يزال المناعية المعيار الذهبي للكشف عن البروتين مباشرة في عينات الأنسجة، زراعة الخلايا أو مسحة الخلية. من خلال الكشف عن نمط التعريب / التوزيع، المناعية (IHC) قد تقييم نسب النسبية والعلاقات المتبادلة الطبوغرافية من البروتينات المستهدفة، وحتى تشير الأنشطة البيولوجية. لذلك، ويستخدم على نطاق واسع لأغراض IHC السريرية والبحوث، على سبيل المثال، للتشخيص والتقييم العلاج، ودراسة آليات المرض، وإجراء التعديلات الفنية وphenotypical في النماذج الحيوانية، الخ

تتألف أساسا الأنسجة، علم الأمراض، والكيمياء الحيوية وعلم المناعة، وقد تقدمت IHC بشكل ملحوظ منذ عام 1941، عندما كانت تستخدم الأجسام المضادة fluorescently المسمى لأول مرة لتحديد المستضدات المكورات الرئوية في الأنسجة المصابة 1. الخامسويستند isualization من المنتجات الخلوية والمكونات التي كتبها IHC على ربط الأجسام المضادة (عبس) لمستضد معين من (حج). بالإضافة إلى استخدام fluorophore الموسومة الأجسام المضادة، ويمكن أيضا التفاعلات المناعية يمكن تصور باستخدام الإنزيمات مثل البيروكسيديز 2،3 أو الفوسفاتيز القلوية 4. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام الغروية الأجسام المضادة الموسومة الذهب 5 للكشف عن تفاعل ضد مستضد معين من قبل كل من الضوء والمجهر الإلكتروني، في حين تصور تسميات المشعة عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي.

وتفاعل مناعي حج-أب يمكن أن يتم الكشف عن طريق وسائل مباشرة وغير مباشرة. الطريقة المباشرة هي في جوهرها أسرع وأبسط، كما أنه يستخدم المسمى مباشرة عبس الأساسي 6. ولكن نظرا لنقص كبير في الحساسية، ويفضل الطرق غير المباشرة لتلك المباشرة. خطوتين إجراءات الكشف غير المباشرة تتطلب الخالي من الملصقات عبس الأساسي، كما الأولى، وصفت عبس الثانوية موجهة ضد عبس الابتدائي، والطبقة الثانية 7.تضخيم إشارة يمكن أن يتحقق من خلال إشراك أبعد من ذلك، يقترن انزيم العالي أب (ثلاث خطوات الطريقة غير المباشرة) التي تربط لأب الثانوي. يشيع استخدامها طرق الكشف غير المباشرة أفيدين البيوتين والبيروكسيديز-antiperoxidase (PAP). بدلا من ذلك، الفوسفاتيز القلوية-antialkaline الفوسفاتيز (APAAP) مجمع يمكن أن تستخدم بدلا من أسلوب PAP. والجدير بالذكر أن تظهر الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) طرق لتكون أكثر حساسية من طرق المناعي 4. يستخدم معقدة (ABC) طريقة أفيدين البيوتين أب الثانوي المعقدة البيروكسيديز في تركيبة مع أي المسمى أفيدين البيوتين معقد (LAB)، أو المسمى streptavidin البيوتين معقد (سلاب). حساسية الكشف يمكن زيادة أخرى عن طريق إشراك أفيدين المسمى مع البيروكسيديز أو الفوسفاتيز القلوية 8. طرق الكشف أخرى في الاستخدام هي العلامات البوليمر، والتضخيم، الثيامين والمناعية المتداول دائرة 9. والجدير بالذكر أن طرق الكشف مختلفة يمكن الجمع للكشف عن حج متعددة في نفس النسيجتم إجراء العينة التي تم الإبلاغ عنها للمرة الأولى في عام 1978 (4). المناعية مزدوجة في وقت واحد المقدمة هنا في الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران الجهاز العصبي المركزي وLN أقسام الأنسجة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية محددة البيروكسيديز وAP-مترافق، على التوالي. وتصور الإشارات باستخدام 3،3'-diaminobencidine (DAB) مولد اللون والأزرق السريع (FB) APAAP المجمع، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان أخلاقي
يتم تنفيذ الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية من المجلس الوطني السويدي لحيوانات المختبر وتوجيه مجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EEC) تحت تصاريح الأخلاقية N338 / 09، N15 / 10 و N65 / 10، والتي وافق عليها ستوكهولم جنة الأخلاقيات الحيوانية الشمال.

1. نسيج التحضير

  1. نضح وتثبيت
    1. تخدير الحيوانات مع isoflurane لأداء نضح transcardial عبر البطين الأيسر. بدء الشطف من الأوعية الدموية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة مكونات الدم، تليها بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م برنامج تلفزيوني (PFA).
    2. يحملق العقول تشريح، النخاع الشوكي والأنسجة الطرفية LN عن طريق غمر في منهاج العمل. بعد 24 ساعة على 4 درجات مئوية، ونقل الأنسجة من منهاج العمل في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. بدلا من ذلك إلى برنامج تلفزيوني تجاري، ويحل 9 ز كلوريد الصوديوم في 250 مل من S &# 246؛ rensen العازلة وإضافة 750 مل من الماء منزوع الأيونات (درهم 2 O). لإعداد 0.2 عازلة M سورنسن (7.4 درجة الحموضة) بحل 13.8 غ ناه 2 ص 4 × 1H 2 O و71،2 ز نا 2 هبو 4 × 2H 2 O في 2.5 L درهم 2 O.
  2. الجفاف وتضمين
    1. قطع الأنسجة إلى ما يقرب من 5 ملم أجزاء سميكة باستخدام شفرة حلاقة.
    2. الشروع في عملية تصلب الأنسجة (الجفاف) باستخدام الأنسجة تيك VIP فراغ تسلل المعالج (الإجراء المعياري استنادا إلى الانغمار في تركيزات تصاعدي من الإيثانول، تليها زيلين وأخيرا البارافين (الجدول 1).
    3. وضع الأنسجة في قالب وتصب في البارافين السائل حول عينة لتشكيل "كتلة البارافين". تخزين على المدى الطويل يتطلب درجة حرارة الغرفة (RT). ومع ذلك، قبل باجتزاء، ومن المفضل أن يبرد الكتل، على سبيل المثال، بين عشية وضحاها (س / ن) في 4 درجات مئوية.

2. باجتزاء

  1. وضع كتلة البارافين إلى حامل ثابت من مشراح زلاجة، التي يمكن ان تتحرك جيئة وذهابا عبر سكين. ضبط زاوية المثلى بين كتلة والسكين مشراح (التي تعتمد على هندسة سكين، ولكن أيضا على سرعة القطع وتقنية).
  2. قطع 3-5 ميكرون سميكة المقاطع العرضية من كتلة البارافين.
  3. نقل القسم مجرد قطع في وعاء ماء وتركيبها في وقت لاحق من الماء على شريحة زجاجية.
  4. اضغط على القسم شنت بعناية ضد منشفة ورقية لإزالة المياه المتبقية وفقاعات الهواء المحتملة. تجاريا قبل المغلفة الشرائح الزجاجية لاصقة والتوصية بها.
  5. شنت الجافة الشرائح لبضع ساعات في فرن على 50 - 60 درجة مئوية.

3. Deparaffinization (الإماهة وحجب الذاتية البيروكسيد)

  1. تزج الشرائح 2X إلى زيلين (بديل زيلين بدلا من ذلكزيروكس-200)، في كل مرة 15-20.
  2. شطف في 99٪ من الإيثانول.
  3. لمنع النشاط البيروكسيداز الذاتية، احتضان أقسام لل30 'في حل الميثانول التي تحتوي على 0.25٪ بيروكسيد الهيدروجين.
  4. مواصلة معالجة الجفاف عن طريق استخدام الإيثانول مع زيادة محتوى الماء (99٪، 70٪، وتنتهي في الماء المقطر.
  5. من هذه النقطة حتى المتصاعدة من غطاء ينزلق أقسام لها أن تبقى رطبة.

4. مستضد استرجاع

  1. استخدام باخرة الغذاء لالمغلي الشرائح في حل استرجاع مستضد (في هذه الحالة EDTA الرقم الهيدروجيني 8.5 العازلة) لمدة 60 '(EDTA حل المخزون الاحتياطي يحتوي على 1.21 غرام تريس و 0.37 غرام EDTA الذائبة في 50 مل درهم 2 O؛ لإعداد عمل محلول مخفف محلول المخزون 2.5ML EDTA في 47.5 مل درهم 2 O).
  2. تهدئة الشرائح على RT تقريبا. 1 ساعة ثم شطف 3 - 5X مع تريس مخزنة المالحة (TBS، استخدم بدلا من ذلك في برنامج تلفزيوني)، ويتألف من 0.05 M تريس و 0.15 م كلوريد الصوديوم. الرقم الهيدروجيني 7.5 تعديل وايعشر حمض الهيدروكلوريك. بدلا من ذلك استخدام TBS التجارية.

5. حجب مواقع غير محددة ملزمة

  1. لتجنب التفاعلات خلفية غير محددة، واحتضان المقاطع على RT لمدة 30 'في حل حجب تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 90٪ عازلة داكو.

6. انقر نقرا Immunolabeling: الحضانة في وقت واحد مع عبس الابتدائية

  1. تخفيف المبلغ المطلوب من الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل واحتضان س / ن في 4 درجات مئوية. لالمناعية مزدوجة تجمع بين ألفا-eotaxin (Ccl11، 1: 300) مع α-Cd68 (ED1، 1: 1000) أو α-Iba1 (Aif1، 1: 1000) أو α-Cd8α (ثور 8؛ 1: 200) .
  2. شطف الشرائح 3-5x مع العازلة TBS (استخدم بدلا من ذلك 10X عازلة داكو مخفف).
  3. تخفيف المبلغ المطلوب من الأجسام المضادة الثانوية (المعقدة البيروكسيديز مكافحة الماعز وAP-مترافق مكافحة فأر، على حد سواء 1: 200) في عرقلة الحل واحتضان 1 ساعة على RT.
  4. شطف الشرائح 3 - 5X العازلة مع TBS (لناالبريد بدلا من 10X المخفف عازلة داكو).
  5. احتضان الشرائح مع مجمع أفيدين-الفجل البيروكسيديز (HRP) المخفف في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT.
  6. شطف الشرائح 3 - 5X العازلة مع TBS (استخدم بدلا من ذلك 10X عازلة داكو مخفف).

7. التصور

  1. التصور من الأجسام المضادة الثانوية ملزمة المسمى AP-
    1. إعداد 0.1 عازلة M تريس، حمض الهيدروكلوريك عن طريق إذابة 12.1 غرام تريس في 1 لتر درهم 2 O وضبط درجة الحموضة إلى باستخدام حمض الهيدروكلوريك. استخدام نفس عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك لإعداد 1 M حل الليفاميزول. إعداد الطازجة 4٪ نانو 2 الحل في DH 2 O.
    2. للحصول على 50 مل من الأزرق (FB) الركيزة سريع (حجم اللازمة لكوفيت الزجاج القياسية واحد) بحل 6.25 ملغ نفتول-AS-MX-الفوسفات في 312.5 DMF ميكرولتر في أنبوب زجاجي ويقلب في 50 مل من قبل حرارة (37 ° C) عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك. حل 12.5 ملغ FB RR الملح في 312.5 ميكرولتر 2 N حمض الهيدروكلوريك إضافة 312.5 ميكرولتر من قبل استعداداتأحمر 4٪ نانو 2 حل ويحرك الخليط في نفس 50 مل من العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك قبل تحسنت. هزة خفيفة حتى يصبح سائل أصفر واضح وأخيرا إضافة 77 ميكرولتر من معدة مسبقا محلول 1 M الليفاميزول. الترشيح الحصول على الخليط ويصب على الشرائح وضعها في كوفيت الزجاج.
    3. الشروع في الحضانة عند 37 درجة مئوية، والسيطرة على عملية وضع تحت مجهر الضوء تقريبا. كل 15-30 دقيقة. إذا تحول غامض، يحل محل الحل FB مع الخليط الطازج.
    4. شطف الشرائح 3 - 5X مع العازلة TBS ونقل لاحقا إلى العازلة في برنامج تلفزيوني.
  2. التصور من الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز المربوطة
    1. إعداد DAB / H 2 O 2 وضع حل عن طريق تمييع 1 مل من محلول الأسهم DAB (25 ملغ DAB لكل 1 مل PBS) في 49 مل برنامج تلفزيوني. إضافة 16.5 ميكرولتر H 2 O 2 و الترشيح قبل صب على أقسام.
    2. تحويل DAB مولد اللون في عجل جبينن الصباغ يمكن أن يكون فوريا. السيطرة على عملية وضع تحت المجهر الضوئي (حتى بضع ثوان حضانة أطول قد يثير خلفية عالية وتحجب إشارة محددة).
    3. شدة راسب الصباغ البني يمكن أن تتعزز بدلا من الحضانة في حل يتكون من 2٪ كبريتات النحاس و 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمدة 5 ".
    4. شطف الشرائح 3 - 5X مع برنامج تلفزيوني، وأخيرا مع DH 2 O، واستخدام الاستفادة بدلا من الماء.
    5. جبل الشرائح مع زلات تغطية مباشرة من الماء باستخدام مائي GelTol المتوسطة المتزايدة. تجنب خلق فقاعات الهواء.
    6. تسمح التجفيف الكامل للتصاعد المتوسط، على سبيل المثال، س / ن في 4 درجات مئوية. متجر جفت الشرائح على RT.
1. ٪ إيثانول 20 ' 40 ° C
2. ٪ إيثانول 60 &# 39؛ 40 ° C
3. ٪ إيثانول 90 ' 40 ° C
4. ٪ إيثانول 60 ' 40 ° C
5. ٪ إيثانول 90 ' 40 ° C
6. ٪ إيثانول 60 ' 40 ° C
7. ٪ إيثانول 90 ' 40 ° C
8. ٪ إيثانول 120 ' 40 ° C
9. زايلول 30 ' 40 ° C
10. زايلول 60 ' 40 ° C
11. البارافين 60 ' 60 ° C
12. البارافين 60 ' 60 ° C
13. البارافين 60 ' 60 ° C
14. البارافين 120 ' 60 ° C

الجدول 1. معالجة الأنسجة بواسطة الأنسجة تيك VIP فراغ تسلل المعالج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت immunostainings مزدوجة (شارك في stainings) في الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران الجهاز العصبي المركزي وLN أقسام. قطعت 3-5 ميكرون شرائح الأنسجة السميكة باستخدام مشراح زلاجة، التي شنت في وقت لاحق على الشرائح الزجاجية لاصق قبل المغلفة وتعامل كما هو موضح سابقا 10،11،12. لفترة وجيزة، بعد deparaffinizing، الإماهة الأنسجة والذاتية تثبيط البيروكسيديز، تعرضوا المقاطع لعملية استرجاع مستضد، تليها خطوة حجب للقضاء على مواقع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وغالبا ما تتطلب إجراءات IHC القياسية تعديلات محددة للحصول على نتيجة أفضل، وهو ما يعني عادة خبرة واسعة ولكن أيضا "التجربة والخطأ" النهج. من إعداد الأنسجة حتى التصور الهدف، لا يجوز إخضاع تقريبا كل خطوة في بروتوكول لمصممة بشكل فردي التعديلات من أجل تحسين النتيجة النهائية. بروتوكول تلطيخ مزدوج المعروضة هنا مثالا البروتين على أساس IHC استهداف تعديل ولا سيما لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة من اهتمامنا الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر هانز لاسمان وجان باور على توجيههما ودعمهما. كما نشكر كاتالين بينيديك على المساعدة الفنية الممتازة وكارولين ويسترلوند على التقييم النقدي واللغوي.

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من Biogen Idec ، ومؤسسة Wenner-Gren ، ومجلس البحوث السويدي ، والرابطة السويدية للأشخاص ذوي الإعاقات العصبية ، ومؤسسة الدماغ السويدية ، وإطار الاتحاد الأوروبي السادس EURATools (LSHG-CT-2005-019015) و Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ثنائي القراصنة

<قوي >كاشف < / قوي >
إيزوفلوران (إيزوفلوران): 1-كلور -2،2،2-ثلاثي فلور إيثيل (ثنائي فلور ميثيل الأثير) 2-كلور -2- (ثنائي فلور ميثوكسي) -1،1،1-ثلاثي فلوريثان (C3< / sub>H2< / sub>ClF5< / sub>O)باكستر1001936060تشعيع العين. ربما يؤثر على الخصوبة ويضر بالطفل في الرحم. يجب تطبيق الدواء فقط في بيئة تخدير مجهزة بشكل كاف.
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)ميرك1.0604
محلول ملحي للفوسفات (PBS) ، قرصسيجما ألدريتشP4417
بارافورمالدهيد (OH (CH2< / sub>O) n< / sub>H (ن = 8 - 100)) ، 4٪ في 1x PBSApl pharma34 24 28المخاطر الصحية. تاكل. قابل للاشتعال. سمية حادة.
الإيثانول &# 8805; 99.5٪ ، مطلق (CH3< / sub>CH2< / sub>OH)Sigma-Aldrich459844-1Lقابل للاشتعال.
الزيلين (الزيلين ، الدرجة النسيجية. C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Flamable. سمية حادة.
Histo-Comp Paraffin WaxTissue-TekV0-5-1001
شرائح مجهر لاصقStarfrostMIC-1040-W
بديل Xylol XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200حساسية الجهاز التنفسي. السرطنه.
&alpha ؛ -CD8 (Ox-8) الفأر المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسيAbD SerotecMCA48G
& alpha ؛ -Iba1 (AIF1) الفأر المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسيMilliporeMABN92
& alpha ؛ -CD68 (ED1) الفأر المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسيAbD SerotecMCA341R
& alpha ؛ -eotaxin C-19 (CCL11) الماعز المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسيسانتا كروز BTSC-6181
الفوسفاتيز القلوي (AP) - الأجسام المضادة الثانوية المترافقةDakopatts ، الدنماركD0314
الجسم المضاد الثانوي البيوتينيلAmersham BiotechRPN1025
مركب أفيدين- بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) سيجما ألدريتشA3151
نفثول AS-MX الفوسفات (C19< / sub>H18< / sub>NO5< / sub>P)سيجما ألدريتشN4875-1Gسمية حادة.
ملح سريع أزرق RR ، Azoic Diazo رقم 24 (C15H14ClN3O3 × 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S< / sub>)سيجما ألدريتش31742السمية الحادة.
3،3'-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB Chromogen)DAKOS3000شديد الاشتعال. سام.
كبريتات النحاس (CuSO4) Merck1.02791السمية الحادة. الضباب البيئي.
شركة GelTol المائية المتصاعدة المتوسطةالحرارية Thermo Electron Corporation230100
بيروكسيد الهيدروجين ، 30٪ (H2< / sub>O2< / sub>)Merck107210السمية الحادة.
الميثانول (CH3< / sub>OH)Fluka65543سمية حادة. التحسس التنفسي. السرطنه. الاشتعال.
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان ، قاعدة TRIS (C4< / sub>H11< / sub>NO3< / sub>)AppliChemA1379تهيج الجلد والعين.
تريس محلول ملحي مخزن (TBS) ، قرصسيجما-ألدريتشT5030
ثنائي فوسفات الهيدروجين الصوديوم ثنائي هيدرات (Na 2< / sub>HPO4< / sub> × 2H 2< / sub>O)Merck1.0658
هيدروجين فوسفات الصوديوم أحادي هيدرات (NaH 2< / sub>PO4< / sub> × 1H2< / sub>O) Merck1.06346
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
يجب تخزين عازلة غسيل الخلايا DAKO 10x DAKOS3006عند 2-8 درجة ؛ C لمنع نمو البكتيريا. تجنب الرغوة.
<م > ن ، ن < م > - ثنائي ميثيل فورماميد. DMF (C3H7NO)Fluka40250قابل للاشتعال. سمية حادة.
أغطية Glas 24 × 36 مم Menzel-Gl &# 228 ؛ serBB024036A1
حمض الهيدروكلوريك ، conc. (HCl)Sigma-Aldrich30721تآكل ، مهيج ، مخترق. محسس الرئة (كضباب حمضي). سام.
محلول حمض الهيدروكلوريك الحجمي ، 2 M HCl (2 N)Fluka71826تآكل ، مهيج ، مخترق. محسس الرئة (كضباب حمضي). سام.
نتريت الصوديوم ، ReagentPlus ، &# 8805 ؛ 99.0٪ (NaNO2< / sub>) مؤكسدSigma-AldrichS2252. سام. خطير على البيئة.
حمض إيثيلينيدينيتريلوتيترا أسيتيك ثنائي الصوديوم ملح ثنائي هيدرات (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454قد يسبب التعرض عن طريق الفم آثارا إنجابية وتنموية.
<قوية> المعدات < / strong>
Tissue-Tek < sup> V.I.P < / sup> معالج تسلل الفراغساكورا5902 VIP Jr. 115 فولت ، 60 هرتز
هاكر برايت 8000 سلسلة قاعدة زلاجة Microtome أدوات
باخرة الطعام المنزلية براونMultiGourmet FS 20
مجهر خفيف لايكا بوليفار 2

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794(2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة