نقدم هنا بروتوكولا محسنا ومفصلا للتلوين المناعي المزدوج في أقسام الجهاز العصبي المركزي للفئران (CNS) والعقدة الليمفاوية الطرفية (LN) المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المناعية (IHC) يوفر محددة للغاية، موثوقة وجذابة التصور البروتين. الأداء الصحيح والتفسير لوضع العلامات متعدد الألوان استنادا IHC-هو أمر صعب، خصوصا عندما تستخدم لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة في الأنسجة ذات المحتوى العالي من الدهون مثل الجهاز العصبي المركزي (CNS).
ويمثل بروتوكول لدينا صقل تقنية immunolabeling القياسية المعدلة وخاصة للكشف عن كل من البروتينات الهيكلية والقابلة للذوبان في الفئران الجهاز العصبي المركزي والغدد الليمفاوية الطرفية (LN) تتأثر neuroinflammation. ومع ذلك، مع أو من دون مزيد من التعديلات، يمكن أن المرجح أن تستخدم بروتوكول لدينا للكشف عن أهداف البروتين الأخرى ذات الصلة، حتى في الأجهزة والأنواع الأخرى من المقدمة هنا.
المقدمة
وعلى الرغم من استخدام متقدمة عالية الإنتاجية التحليلات التي أجريت على methylome، Transcriptome على أو حتى مستوى بروتيوم، لا يزال المناعية المعيار الذهبي للكشف عن البروتين مباشرة في عينات الأنسجة، زراعة الخلايا أو مسحة الخلية. من خلال الكشف عن نمط التعريب / التوزيع، المناعية (IHC) قد تقييم نسب النسبية والعلاقات المتبادلة الطبوغرافية من البروتينات المستهدفة، وحتى تشير الأنشطة البيولوجية. لذلك، ويستخدم على نطاق واسع لأغراض IHC السريرية والبحوث، على سبيل المثال، للتشخيص والتقييم العلاج، ودراسة آليات المرض، وإجراء التعديلات الفنية وphenotypical في النماذج الحيوانية، الخ
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان أخلاقي
يتم تنفيذ الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية من المجلس الوطني السويدي لحيوانات المختبر وتوجيه مجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EEC) تحت تصاريح الأخلاقية N338 / 09، N15 / 10 و N65 / 10، والتي وافق عليها ستوكهولم جنة الأخلاقيات الحيوانية الشمال.
1. نسيج التحضير
- نضح وتثبيت
- تخدير الحيوانات مع isoflurane لأداء نضح transcardial عبر البطين الأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أجريت immunostainings مزدوجة (شارك في stainings) في الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران الجهاز العصبي المركزي وLN أقسام. قطعت 3-5 ميكرون شرائح الأنسجة السميكة باستخدام مشراح زلاجة، التي شنت في وقت لاحق على الشرائح الزجاجية لاصق قبل المغلفة وتعامل كما هو موضح سابقا 10،11،12. لفترة وجيزة، بعد deparaffinizing، الإماهة الأنسجة والذاتية تثبيط البيروكسيديز، تعرضوا المقاطع لعملية استرجاع مستضد، تليها خطوة حجب للقضاء على.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وغالبا ما تتطلب إجراءات IHC القياسية تعديلات محددة للحصول على نتيجة أفضل، وهو ما يعني عادة خبرة واسعة ولكن أيضا "التجربة والخطأ" النهج. من إعداد الأنسجة حتى التصور الهدف، لا يجوز إخضاع تقريبا كل خطوة في بروتوكول لمصممة بشكل فردي التعديلات من أجل تحسين النتيجة النهائية. بروتوكول تلطيخ مزدوج المعروضة هنا مثالا البروتين على أساس IHC استهداف تعديل ولا سيما لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة من اهتمامنا الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر هانز لاسمان وجان باور على توجيههما ودعمهما. كما نشكر كاتالين بينيديك على المساعدة الفنية الممتازة وكارولين ويسترلوند على التقييم النقدي واللغوي.
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من Biogen Idec ، ومؤسسة Wenner-Gren ، ومجلس البحوث السويدي ، والرابطة السويدية للأشخاص ذوي الإعاقات العصبية ، ومؤسسة الدماغ السويدية ، وإطار الاتحاد الأوروبي السادس EURATools (LSHG-CT-2005-019015) و Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
ثنائي القراصنة
| <قوي >كاشف < / قوي > | |||
|---|---|---|---|
| إيزوفلوران (إيزوفلوران): 1-كلور -2،2،2-ثلاثي فلور إيثيل (ثنائي فلور ميثيل الأثير) 2-كلور -2- (ثنائي فلور ميثوكسي) -1،1،1-ثلاثي فلوريثان (C3< / sub>H2< / sub>ClF5< / sub>O) | باكستر | 1001936060 | تشعيع العين. ربما يؤثر على الخصوبة ويضر بالطفل في الرحم. يجب تطبيق الدواء فقط في بيئة تخدير مجهزة بشكل كاف. |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | ميرك | 1.0604 | |
| محلول ملحي للفوسفات (PBS) ، قرص | سيجما ألدريتش | P4417 | |
| بارافورمالدهيد (OH (CH2< / sub>O) n< / sub>H (ن = 8 - 100)) ، 4٪ في 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | المخاطر الصحية. تاكل. قابل للاشتعال. سمية حادة. |
| الإيثانول &# 8805; 99.5٪ ، مطلق (CH3< / sub>CH2< / sub>OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | قابل للاشتعال. |
| الزيلين (الزيلين ، الدرجة النسيجية. C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. سمية حادة. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| شرائح مجهر لاصق | Starfrost | MIC-1040-W | |
| بديل Xylol XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | حساسية الجهاز التنفسي. السرطنه. |
| &alpha ؛ -CD8 (Ox-8) الفأر المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسي | AbD Serotec | MCA48G | |
| & alpha ؛ -Iba1 (AIF1) الفأر المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسي | Millipore | MABN92 | |
| & alpha ؛ -CD68 (ED1) الفأر المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسي | AbD Serotec | MCA341R | |
| & alpha ؛ -eotaxin C-19 (CCL11) الماعز المضاد للفئران ، الجسم المضاد الأساسي | سانتا كروز BT | SC-6181 | |
| الفوسفاتيز القلوي (AP) - الأجسام المضادة الثانوية المترافقة | Dakopatts ، الدنمارك | D0314 | |
| الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| مركب أفيدين- بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) | سيجما ألدريتش | A3151 | |
| نفثول AS-MX الفوسفات (C19< / sub>H18< / sub>NO5< / sub>P) | سيجما ألدريتش | N4875-1G | سمية حادة. |
| ملح سريع أزرق RR ، Azoic Diazo رقم 24 (C15H14ClN3O3 × 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S< / sub>) | سيجما ألدريتش | 31742 | السمية الحادة. |
| 3،3'-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | شديد الاشتعال. سام. |
| كبريتات النحاس (CuSO4) Merck | 1.02791 | السمية الحادة. الضباب البيئي. | |
| شركة GelTol المائية المتصاعدة المتوسطة | الحرارية Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| بيروكسيد الهيدروجين ، 30٪ (H2< / sub>O2< / sub>) | Merck | 107210 | السمية الحادة. |
| الميثانول (CH3< / sub>OH) | Fluka | 65543 | سمية حادة. التحسس التنفسي. السرطنه. الاشتعال. |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان ، قاعدة TRIS (C4< / sub>H11< / sub>NO3< / sub>) | AppliChem | A1379 | تهيج الجلد والعين. |
| تريس محلول ملحي مخزن (TBS) ، قرص | سيجما-ألدريتش | T5030 | |
| ثنائي فوسفات الهيدروجين الصوديوم ثنائي هيدرات (Na 2< / sub>HPO4< / sub> × 2H 2< / sub>O) | Merck | 1.0658 | |
| هيدروجين فوسفات الصوديوم أحادي هيدرات (NaH 2< / sub>PO4< / sub> × 1H2< / sub>O) | Merck | 1.06346 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| يجب تخزين عازلة غسيل الخلايا DAKO 10x | DAKO | S3006 | عند 2-8 درجة ؛ C لمنع نمو البكتيريا. تجنب الرغوة. |
| <م > ن ، ن < م > - ثنائي ميثيل فورماميد. DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | قابل للاشتعال. سمية حادة. |
| أغطية Glas 24 × 36 مم | Menzel-Gl &# 228 ؛ ser | BB024036A1 | |
| حمض الهيدروكلوريك ، conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | تآكل ، مهيج ، مخترق. محسس الرئة (كضباب حمضي). سام. |
| محلول حمض الهيدروكلوريك الحجمي ، 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | تآكل ، مهيج ، مخترق. محسس الرئة (كضباب حمضي). سام. |
| نتريت الصوديوم ، ReagentPlus ، &# 8805 ؛ 99.0٪ (NaNO2< / sub>) مؤكسد | Sigma-Aldrich | S2252 | . سام. خطير على البيئة. |
| حمض إيثيلينيدينيتريلوتيترا أسيتيك ثنائي الصوديوم ملح ثنائي هيدرات (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | قد يسبب التعرض عن طريق الفم آثارا إنجابية وتنموية. |
| <قوية> المعدات < / strong> | |||
| Tissue-Tek < sup> V.I.P < / sup> معالج تسلل الفراغ | ساكورا | 5902 VIP Jr. 115 فولت ، 60 هرتز | |
| هاكر برايت 8000 سلسلة قاعدة زلاجة Microtome | أدوات | ||
| باخرة الطعام المنزلية | براون | MultiGourmet FS 20 | |
| مجهر خفيف | لايكا بوليفار 2 |
المراجع
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
