مقالة منهجية

إجراء فحص كيميائي لإشارات الجلوكوكورتيكويد باستخدام نظام مراسل يرقات لوسيفيراز من يرقات الزرد

13.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50439

⸱

سبتمبر 10, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus North, 2Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology - Campus North, 3Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology - Campus South

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content"> نصف الإجراء وتحليل البيانات لنظام الفحص الكيميائي لإشارات هرمون الإجهاد السكري القشراني باستخدام يرقات الزرد: مقايسة Glucocorticoid المستجيبة في الجسم الحي لأسماك الزرد Luciferase activitY (GRIZLY). يكتشف الاختبار بحساسية وتحديدا التأثيرات على إشارات الجلوكوكورتيكويد بواسطة المركبات التي تتطلب التمثيل الغذائي أو تؤثر على إنتاج الجلوكوكورتيكويد الداخلي.

الملخص

هرمونات الإجهاد القشرانية السكرية ومشتقاتها الاصطناعية هي أدوية تستخدم على نطاق واسع لعلاج الالتهاب ، لكن العلاج طويل الأمد بالجلوكوكورتيكويد يمكن أن يؤدي إلى آثار جانبية شديدة. هناك حاجة إلى أنظمة اختبار للبحث عن مركبات جديدة تؤثر على إشارات الجلوكوكورتيكويد في الجسم الحي أو لتحديد الآثار غير المرغوب فيها للمركبات على مسار إشارات الجلوكوكورتيكويد. لقد أنشأنا مقايسة الزرد المعدلة وراثيا والتي تسمح بقياس نشاط إشارات الجلوكوكورتيكويد في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي ، اختبار GRIZLY (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). يكتشف الفحص القائم على اللوسيفيراز التأثيرات على إشارات الجلوكوكورتيكويد بحساسية وخصوصية عالية ، بما في ذلك تأثيرات المركبات التي تتطلب التمثيل الغذائي أو تؤثر على إنتاج الجلوكوكورتيكويد الداخلي. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإجراء الشاشات الكيميائية باستخدام هذا الفحص. نصف الحصول على البيانات وتطبيعها وتحليلها ، مع التركيز على مراقبة الجودة وتصور البيانات. يوفر الاختبار قراءة بسيطة ومحددة بمرور الوقت وكمية. يمكن تشغيله كمنصة قائمة بذاتها، ولكن يمكن أيضا دمجها بسهولة في تدفقات عمل الفحص عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالعديد من التطبيقات التي تتجاوز الفحص الكيميائي ، مثل المراقبة البيئية لاضطرابات الغدد الصماء أو أبحاث الإجهاد.

المقدمة

Glucocorticoids (GCs) هي هرمونات ستيرويد تنتجها الغدة الكظرية والتي تلعب أدوارا مهمة أثناء الاستجابة للإجهاد وفي تنظيم التمثيل الغذائي1. تربط GCs مستقبلات الجلوكوكورتيكويد السيتوبلازمية (GRs) من عائلة المستقبلات النووية الفائقة التي ، عند الارتباط ، تنتقل إلى النواة2. هنا ، يمكنهم على سبيل المثال قمع النسخ عن طريق التدخل في عوامل النسخ الأخرى (الإخماد) أو تنشيط النسخ الجيني عبر عناصر استجابة الجلوكوكورتيكويد (GREs ، التنشيط). نظرا لخصائصها المضادة للالتهابات ، فإن كل من GCs الطبيعية والاصطناعية هي أدوية تستخدم على نطاق واسع في علاج عدد من الأمراض ، مثل الربو أو التهاب المفاصل3. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الاستخدام طويل الأمد ل GCs بشكل خاص إلى آثار جانبية شديدة ، بما في ذلك مرض السكري والجلوكوما4. لذلك ، فإن المركبات الجديدة التي تستهدف إشارات GC ذات كفاءة العلاج الأكثر فائدة والتحمل مطلوبة بشدة. الأهم من ذلك ، يمكن أن تختلف تأثيرات الترابط التي لوحظت في الخلايا المستنبتة عن تلك التي شوهدت في الجسم الحي5. قد تؤدي هذه التأثيرات إلى تحيز النتائج التي تم الحصول عليها من خلال فحوصات الفحص الصيدلانية التقليدية القائمة على زراعة الخلايا. تم التركيز مؤخرا على الفحص الكيميائي في الجسم الحي كما تم تمكينه بواسطة نموذج أسماك الزرد ، لأنه يسمح بتحديد التأثيرات غير القابلة للاكتشاف في زراعة الخلايا6،7.

يمكن أن تتأثر مسارات الإشارات الهرمونية أيضا بالملوثات البيئية. يؤثر ما يسمى بالمواد الكيميائية المسببة لاضطراب الغدد الصماء (EDCs) على العمليات المختلفة المنظمةللهرمونات 8. وبالتالي ، يمكن تعديل التكاثر والتمايز الجنسي للكائنات المائية بواسطة مواد ذات أنشطة شبيهة بالإستروجين. في الآونة الأخيرة ، أثيرت مخاوف من أن اضطرابات التمثيل الغذائي قد تكون مرتبطة ب EDCs في البيئة9. أحد المسارات التي يستهدفها مثل هذا "الاضطراب الأيضي" هو مسار الجلوكوكورتيكويد ، والذي تورط أيضا في تأثيرات الكائنات الغريبة على النمو ووظيفة المناعة10،11. ومع ذلك, بالمقارنة مع الكم الكبير من المعلومات المتاحة عن المركبات التي تتداخل مع عمل هرمون الستيرويد الجنسي, لا يعرف سوى القليل نسبيا عن آثار اضطراب الغدد الصماء بوساطة عن طريق الموارد الوراثية. لذلك ، هناك حاجة إلى أدوات تسمح بمراقبة تأثيرات الملوثات على إشارات GC في الجسم الحي.

لطالما كانت أسماك الزرد نموذجا شائعا في علم الأحياء التنموي وقد اجتذبت مؤخرا أيضا باحثين من مجالات أخرى ، بما في ذلك علم الغدد الصماء12. بالمقارنة مع أنواع الزرد الأخرى ، فإن نظام إشارات GC لأسماك الزرد يشبه إلى حد كبير نظام الثدييات ، نظرا لأن جينوم أسماك الزرد يحتوي على جين GR واحد فقط بدلا من المستقبلات المكررة في العديد من أنواع الأسماك الأخرى13-15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن محور الغدة النخامية والغدة الكظرية يعمل بالفعل في يرقات سمك الزرد البالغة من العمر 5 أيام ، مما يزيد من إنتاج GC الداخلي استجابة للضغوطات14،16-18.

لقد أنشأنا مؤخرا خط أسماك الزرد المعدلة وراثيا ، GRE: Luc ، والذي يسمح بمراقبة نشاط إشارات GC في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي18. يحمل الخط بنية جينية لمراسل لوسيفيراز تحت سيطرة الحد الأدنى من مروج صندوق TATA وأربعة GRARE متسلسلة (الشكل 1 أ). يمكن قياس التلألؤ البيولوجي المستحث عن GC من يرقات GRE: Luc مفردة في 96 لوحة ميكروتيتر بئر في الجسم الحي على مدى فترات طويلة من الزمن. يمكن استخدام هذا الاختبار GRIZLY (ل "Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY") في عدد من مجالات البحث المختلفة ، مثل أبحاث الإجهاد والمراقبة البيئية والشاشات الدوائية18. تمكنا من اكتشاف الارتفاع الداخلي في الكورتيزول بعد الإجهاد التناضحي من يرقات مفردة ويمكننا متابعة نضوج الاستجابة أثناء التطور. علاوة على ذلك ، يمكننا مراقبة التأثيرات على إشارات GC للعضويات التي تتطلب التمثيل الغذائي بواسطة اليرقة. الأهم من ذلك ، كان الخط قادرا على اكتشاف هذه التأثيرات بتركيزات ذات صلة بيئيا. أخيرا ، في شاشة تجريبية ، اكتشف الاختبار بحساسية وتحديدا مركبات ذات نشاط GC من مكتبة كيميائية ، بما في ذلك مركب واحد يحفز إنتاج الكورتيزول الداخلي في اليرقات. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للشاشات الكيميائية باستخدام مقايسة GRIZLY.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. إعداد التخفيف العامل للمكتبة الكيميائية

< p class = "jove_content" > قم بتخفيف مركبات مكتبة الأدوية المراد اختبارها (مثل الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، ENZO Life Science) إلى E3 (5 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد كلوريد ، 0.33 ملي مولار كلوريدالهواء 2) باستخدام محطة معالجة السوائل الروبوتية (على سبيل المثال Multiprobe II ، 8 إبر مع محول طرف التخلص ، PerkinElmer). التركيزات المناسبة هي على سبيل المثال 40 ميكروغرام / مل في 3٪ DMSO ، ولكن هذا سيعتمد على نوع المكتبة المستخدمة. يشار إلى إعدادات Multiprobe II المقابلة للخطوات الموضحة أدناه في الجدول 1. يسمح البروتوكول الموضح في الجدول بإعداد أربع لوحات متوازية.

  1. ماصة 10 ميكرولتر من مكتبة المخزون (2 مجم / مل في DMSO) في ألواح الآبار العميقة (على سبيل المثال ، لوحة تخزين 96 بئر ، بئر دائري ، 0.8 مل ، ABgene). يجب ترك العمودين 1 و 12 فارغين - ستتلقى هذه الركيزتين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية داخل اللوحة.
  2. استغن عن 490 ميكرولتر من E3 مع 1٪ DMSO في الحصص المعدة للمكتبة باستخدام Multiprobe II. يتم إجراء التخفيف بإبر ثابتة بدون نصائح للتخلص منها.
  3. أضف 10 ميكرولتر من DMSO إلى العمود 1 و 10 ميكرولتر من محلول ديكساميثازون 5 ملي مولار (في DMSO) إلى العمود 12 كعناصر تحكم داخل اللوحة. يبلغ تركيز DMSO في جميع الآبار الآن 3٪ ، وتركيز ديكساميثازون في آبار التحكم الإيجابي هو 100 ميكرومتر في E3 / 3٪ DMSO.
  4. أغلق اللوحة بألواح مانعة للتسرب لاصقة مقاومة ل DMSO. قم بتخزين الأطباق في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >2. تربية أسماك المراسل

جمع الأجنة من التفريخ الطبيعي للتزاوج الجماعي بين أسماك GRE: Luc المعدلة وراثيا. قم بتربية الأجنة (لا تزيد عن 60) في أطباق بتري مقاس 9 سم تحتوي على وسط E3 مكمل ب 1 مجم / مل من مبيد الفطريات الميثيلين الأزرق حتى 4 أيام بعد الإخصاب (dpf) في حاضنة عند 28 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير وسيط لوسيفيراز (E3L)

< p class = "jove_content"> قم بإعداد محلول مخزون لوسيفيرين مائي بحجم 50 ملي مولار عن طريق إضافة dH2O إلى القارورة التي تحتوي على مسحوق اللوسيفيرين. يمكن تخزين محلول المخزون هذا عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر. خفف مخزون اللوسيفيرين إلى وسط E3 إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ملي مولار للحصول على وسط E3L.

فئة

4. توزيع اليرقات في 96 لوحة بئر

  1. قم بإعداد أطراف ماصة سعة 1 مل ذات تجويف عريض عن طريق قطع حوالي 5 مم من الطرف وإشعال الحواف الحادة لفترة وجيزة.
  2. يرقات المسبح من عدة صلبان عن طريق سكبها بعناية من أطباق بتري في دورق احصد حوالي 50 يرقة في المرة الواحدة عن طريق سكبها برفق على غربال (حجم المسام بقطر 0.25 مم) وضع المنخل على الفور في طبق بتري صغير (قطر 5.5 سم) مملوء بوسط E3L.
  3. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف، انقل 225 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على يرقة واحدة إلى كل من آبار صفيحة بيضاء سعة 96 بئر (OptiPlate، PerkinElmer).
  4. أغلق الألواح بألواح مانعة للتسرب لاصقة (مثل TopSeal-A و PerkinElmer) واحتضانها عند 28 درجة مئوية طوال الليل. يمنع هذا الحضانة المسبقة تسجيل التغيرات العابرة في التلألؤ البيولوجي فور إضافة اللوسيفيرين ، وهي ظاهرة تحدث أيضا في الخلايا المستنبتة19.
< ص الفئة = "jove_title" >5. العلاج من تعاطي المخدرات

  1. قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على تخفيف العمل للمكتبة من الفريزر -80 درجة مئوية قبل حوالي 4 ساعات من الاستخدام. قم بدوامة اللوحة برفق وقم بتدويرها لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي لتجميع السائل في الجزء السفلي من اللوحة.
  2. قم بإزالة صفائح الختم اللاصقة من ألواح اليرقات.
  3. باستخدام جهاز ماصة يدويا ب 96 قناة (مثل Liquidator وSteinbrenner) ، قم بعمل ماصة محلول الدواء لأعلى ولأسفل 3 مرات. ثم تناول 25 ميكرولتر من التخفيف العامل للمكتبة الكيميائية في الآبار التي تحتوي على اليرقات (مع المثال أعلاه ، ينتج عن هذا تركيز نهائي قدره 4 ميكروغرام / مل في E3 مع 0.3٪ DMSO). قم بإعداد 10 (كحد أدنى: 5) لوحات طبق الأصل مع يرقات لكل لوحة مكتبة.
  4. أغلق الألواح بألواح الختم اللاصقة وقم بتسمية كل لوحة بملصق الباركود.
فئة

6. تسجيل التلألؤ

  1. ضع الصفائح التي تحتوي على اليرقات في وحدات التكديس الخاصة بقارئ التلألؤ الحيوي EnVision مع حساسية تلألؤ محسنة (PerkinElmer). بدلا من ذلك ، استخدم نظام حاضنة آلي مثل تلك المستخدمة في أنظمة فحص زراعة خلايا الثدييات بالاشتراك مع القارئ.
  2. سجل التلألؤ البيولوجي لمدة يومين باستخدام إعدادات القارئ المماثلة لتلك الموضحة في الجدول 2 لقارئ EnVision. قم بتكييف عدد تكرارات الفحص مع عدد اللوحات في التشغيل لتتناسب مع وقت التشغيل المطلوب.
  3. بعد نهاية الجري ، تحقق من وجود اليرقات الميتة للصفائح لتقييم السمية العامة للمركبات.

7. تحليل البيانات

يتم إجراء جميع تحليلات البيانات في بيئة البرمجة الإحصائية R باستخدام البرامج النصية المخصصة.

  1. حساب AUC
    من أجل تحديد المركبات التي تنشط إشارات GC بغض النظر عن خصائصها الحركية ، حدد المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لآثار التلألؤ المسجلة (العدد الخام للتلألؤ البيولوجي مقابل الوقت) كمعامل الفحص. يتم تقريب AUCs بالقاعدة شبه المنحرفة (انظر الشكلين 2 أ و أ).
  2. التطبيع
    سجل تحويل قيم AUC من أجل ضمان أعلى لطبيعة البيانات (الشكلان 2 ب و ب'). ثم قم بتطبيع قيم AUC المحولة للسجل لكل لوحة مكتبة باستخدام طريقة Z-score القوية (انظر 20). ينتج عن هذا التطبيع قيم تمثل عدد الانحرافات المعيارية عن متوسط جميع نقاط البيانات. بهذه الطريقة ، تتم إزالة الأخطاء المنهجية ، مثل التباين بين التشغيل ، من البيانات. يمكن الآن تصور البيانات عن طريق رسم متوسط درجة Z القوية للنسخ المتماثلة لكل بئر (الشكلان 2 ج و ج).
  3. مقاييس الجودة
    1. خريطة التمثيل اللوني
      من أجل تصور التأثيرات المتعلقة باللوحة ، ارسم البيانات لكل لوحة كخريطة حرارية باستخدام وظيفة خريطة الحرارة على سبيل المثال لحزمة gplot21. بهذه الطريقة ، يمكن اكتشاف تأثيرات الحافة أو الترحيل المركب بسهولة (على سبيل المثال ، قارن الشكل 3 أ مع 3 ب). استبعاد اللوحات دون المستوى الأمثل من مزيد من التحليل.
    2. منحنى ROC
      لتحديد حساسية وخصوصية الفحص ، احسب منحنى خاصية تشغيل جهاز الاستقبال (ROC) ، على سبيل المثال بمساعدة حزمة الموصلات الحيوية ROC22 باستخدام قيم Z-score المحددة في 7.2 (الشكل 3 ج). بعد ذلك ، حدد AUC لهذا المنحنى. تشير قيمة AUC القريبة من 1 إلى حساسية وخصوصية عالية للمقايس.
  4. ضرب تحديد الهوية
    لتحسين القيمة الفاصلة لتحديد المركبات النشطة ، حدد مؤشر Youden. لحساب المؤشر ، اطرح المعدل الإيجابي الحقيقي المقدر (TPR) من المعدل الموجب الخاطئ (FPR) لمنحنى ROC لزيادة قيم قطع Z-score القوية. خذ درجة Z القوية مع أعلى مؤشر Youden (TPR مطروحا منه FPR) كنقطة فاصلة. يمكن تقدير TPR / FPR عن طريق الكشف عن آبار التحكم الإيجابية أو المركبات النشطة المعروفة داخل المكتبة. عند استخدام آبار التحكم الإيجابية ، تأكد من أنها تتطابق مع قوة الضربة المتوقعة.
< p class = "jove_title" >8. إعادة الاختبار

  1. أعد تقييم مركبات الضربة الإيجابية عن طريق معالجة اليرقات بالتخفيفات التسلسلية للمركبات التي تم الحصول عليها من مورد مختلف ، باستخدام نفس إعداد التسجيل الموضح أعلاه. يجب أن تحفز الضربات الحقيقية اللمعان أيضا في هذا الفحص ، من الناحية المثالية بطريقة تعتمد على الجرعة.

النتائج

في منشور سابق18، قمنا بفحص مكتبة مكونة من 640 عقاراً معتمداً من إدارة الغذاء والدواء (FDA) في مسح تجريبي لتقييم أداء مقايسة GRIZLY. احتوت هذه المكتبة على 12 مركب غلوكوكورتيكويد bona fide، مما سمح لنا بتحديد مقاييس الجودة للحساسية والنوعية الخاصة بالمقايسة.

الشكل 2 يوضح أمثلة نموذجية لتحليل البيانات الخام والمعايرة المأخوذة من هذه الشاشة. يظهر في الشكل 2أ نتيجة نموذجية من بئر تحكم يحتوي على الديكساميثازون، مما يوضح المعلومات الزمنية التي توفرها البيانات. تظهر ذروة في التلألؤ البيولوجي تحدث بعد حوالي 12 hr من العلاج، ثم تنخفض ببطء على مدار الـ 36 hr التالية من القياس. يبرز الشكل 2أ' تقريب قيمة AUC باستخدام طريقة شبه المنحرف. يتم إجراء هذا الحساب لجميع الآبار وكل تكرار تقني. وتظهر نتيجة تحويل اللوغاريتم في الشكلين 2ب وب'. هنا يتم رسم متوسط الضوابط الإيجابية في مخطط Q-Q طبيعي. يؤدي تحويل اللوغاريتم إلى تقريب أكبر لنقاط البيانات من القيم الموزعة طبيعياً نظرياً والمشار إليها بالخطوط القطرية الحمراء. إن التحويل لتحقيق طبيعية البيانات يزيد من القوة الإحصائية للتحليلات اللاحقة. أخيراً، يوضح الشكلان 2ج و2ج' تأثير معايرة robust Z-score على التباين بين الأطباق: حيث تمت معايرة قيم الخط الأساسي المختلفة التي تم الحصول عليها من أطباق مختلفة (الشكل 2ج) في مخطط robust Z-score في الشكل 2ج'.

يمكن استخدام قيم Z-score القوية لتحديد الأخطاء المنهجية في البيانات من خلال تصور توزيع النتائج الإيجابية (hits) عبر الأطباق. يوضح الشكل 3a مثالاً لخريطة حرارية لطبق من المكتبة، حيث تم رسم قيم Z-score القوية مرمزاً لونياً حسب مواقع الآبار. يمكن بسهولة تحديد العمود 12 الذي يحتوي على ضوابط إيجابية داخل الطبق. وتظهر المركبات ذات النتائج الإيجابية من المكتبة في البئر F8، وبدرجة أقل في E2. أما الشكل 3b فيعرض طبقاً يوجد به خطأ منهجي؛ حيث يُلاحظ سلسلة من المركبات ذات قيم Z-score المتناقصة في الصفين A و E عبر عدة أعمدة. لم يظهر أي من المركبات في هذه الآبار نتيجة إيجابية عند إعادة الاختبار. ونظراً لأن الآبار التي تظهر هذا النشاط المتناقص في اختبار GRIZLY تقع على طول المسار الذي يسلكه روبوت الماصّة عند تقسيم أطباق المكتبة، فإن هذا النمط يشير إلى انتقال مركب إيجابي (carry-over) أثناء عملية السحب الآلي.

أتاح لنا التطبيع القوي لـ Z-score، إلى جانب وجود مركبات GCs معروفة في المكتبة، حساب منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) لعملية الفرز18. يوضح الشكل 3c رسمًا بيانيًا لمعدل الإيجابيات الحقيقية المقدر مقابل معدل الإيجابيات الكاذبة المقدر لقيم قطع مختلفة لـ Z-score القوي. يُعرف معدل الإيجابيات الحقيقية المقدر بأنه النسبة المئوية للضربات الإيجابية الحقيقية (هنا، الجلوكوكورتيكويدات المعروفة الموجودة في المكتبة) التي يتم العثور عليها عند قيمة قطع معينة لـ Z-score القوي. ويشير معدل الإيجابيات الكاذبة المقدر المقابل إلى النسبة المئوية للمركبات غير الإيجابية التي تم اعتبارها ضربات عند قيمة القطع هذه. بلغت قيمة AUC لهذا المنحنى 0.95، مما يشير إلى حساسية ونوعية عاليتين لعملية الفرز وأداء ممتاز للمقايسة. كما استُخدم منحنى AUC لتقدير قيمة القطع المثلى لتحديد الضربات من خلال حساب مؤشر Youden لقيم Z-scores قوية مختلفة. وقد حددنا أن قيمة Z-score القوية البالغة 1.49 تمتلك أعلى مؤشر Youden. وتظهر قيمة القطع هذه في الشكل 2c' كخط أسود يفصل الضربات عن بقية المركبات.

في عملية المسح التي أجريناها18، تمكنا من تحديد جميع الـ GCs المعروفة الموجودة في المكتبة تقريباً. ولم يتم اكتشاف ثلاثة فقط من أصل 12 من الـ bona fide GCs. وفي حالة melengestrol acetate، كانت هذه نتيجة سلبية خاطئة، حيث أعطى هذا المركب نتيجة إيجابية في إعادة الاختبار بتركيز أعلى من التركيز المستخدم في المكتبة. أما الـ GCs الآخران فقد كانت نتائجهما سلبية أيضاً في إعادة الاختبار. يُعد Corticosterone هو الـ GC الرئيسي في القوارض، ولكن ليس في الأسماك أو البشر1، بينما قد لا يتم استقلاب الدواء الأولي prednisone بشكل جيد بواسطة النظام اليرقي. ومن المثير للاهتمام أنه تم تحديد عقارين غير مصنفين كـ GCs في عملية المسح، ولم يتم تأكيد أحدهما في إعادة الاختبار (spironolactone، وهو مضاد لمستقبلات المعدنية القشرية). أما المركب الآخر، pregnenolone، فهو مقدمة في التخليق الحيوي للستيرويدات، ويتم تحويله إلى cortisol بواسطة الغدة الكظرية. وبالفعل، أدت المعالجة بـ pregnenolone إلى تحفيز إنتاج cortisol في اليرقات18. وتؤكد كل هذه النتائج الأداء العالي للمقايسة: حيث وجد مركب واحد فقط بنتيجة سلبية خاطئة ومركب واحد بنتيجة إيجابية خاطئة ضمن نتائج المسح الأولي، كما تم تحديد 10 من أصل 11 مركباً مؤكداً ذات نشاط محفز لإشارات الـ GC في المسح الأولي.

عملية مقايسة اللوسيفيريز؛ معادلات ومخططات توضح فحص العقاقير، وجمع البيانات، والتحليل.
الشكل 1. المبدأ العام للمقايسة ومسار عمل إجراء الفحص. أ) مخطط لبنية المراسل في مقايسة GRIZLY. يتم التحكم في تعبير اللوسيفيريز (باللون الأصفر) بواسطة محفز أدنى (Pmin، باللون البرتقالي) وأربعة عناصر GRE متسلسلة ((GRE)4، باللون الأبيض)، والتي ترتبط بمجتمرات GR المتجانسة المنشطة بالربيطة (GR، باللون الأزرق). تشير المربعات الحمراء إلى مواقع ترانسبوزاز Tol2 التي تسهل دمج البنية في الجينوم. يمثل المربع الوردي موقع تعدد الأدينيليشن (pA). يتم وضع اليرقات المعدلة وراثياً التي تحمل هذه البنية في أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً معتمة لقياسات التلألؤ البيولوجي. ب) مخطط تفاعل اللوسيفيريز. يحفز اللوسيفيريز أكسدة اللوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين، مما يؤدي إلى انبعاث الضوء (hν). يتطلب التفاعل أيضاً ATP و Mg2+، واللذين توفرهما اليرقة. PPi، بيروفوسفات. ج) مسار عمل الفحص. يتم تحضير تخفيفات المخزون العامل من مكتبة عقاقير معتمدة من FDA في أطباق ذات 96 بئراً، حيث يحتوي عمود واحد على ضابط سلبي داخل الطبق (DMSO فقط، باللون الأخضر) وعمود واحد يحتوي على ضابط إيجابي (Dexamethasone، باللون الأحمر) (تصميم المكتبة). يتم توزيع يرقات GRE:Luc في أطباق ذات 96 بئراً (5-11 مكرراً) ومعالجتها بمركبات المكتبة (تطبيق العقاقير). يتم تسجيل تتبعات التلألؤ البيولوجي باستخدام قارئ التلألؤ البيولوجي لمدة يومين (جمع البيانات). يتم تكامل تتبعات التلألؤ البيولوجي (حسابات AUC)، وتحويلها لوغاريتمياً، ومعايرتها باستخدام robust Z-score (المعايرة). تُستخدم البيانات المعايرة لتحديد مقاييس الجودة ولتحديد النتائج الإيجابية (تحليل البيانات). يتم إعادة اختبار النتائج الإيجابية المختارة لتحديد النشاط المعتمد على الجرعة في المقايسة (إعادة الاختبار). انقر هنا لعرض شكل أكبر.

تحليل التلألؤ البيولوجي؛ مخطط Q-Q، تحويل لوغاريتمي، تطبيع درجة z؛ تصور البيانات.
الشكل 2. توضيح لتحليل البيانات باستخدام بيانات من مسح لمكتبة عقاقير معتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA). أ) منحنى ممثل من بئر ضابط إيجابي. أ') يتم تقريب المساحة تحت المنحنى (AUC) باستخدام قاعدة شبه المنحرف. تظهر أشباه المنحرفات المستخدمة في الحساب بظلال مختلفة من اللون الأحمر. ب) مخطط Q-Q طبيعي لقيم AUC الخام لآبار الضابط الإيجابي (المحور y) مقابل مجتمع طبيعي معياري (المحور x) قبل التحويل اللوغاريتمي. ب') مخطط Q-Q طبيعي لقيم AUC بعد التحويل اللوغاريتمي. يشير التوزيع الطبيعي إلى خطية نقاط البيانات المحولة لوغاريتميًا. ج) مخطط للبيانات الخام المحولة لوغاريتميًا لجميع المركبات التي تم اختبارها في المسح. اللون الأزرق يمثل الجلوكوكورتيكويدات bona fide؛ واللون الرمادي يمثل جميع المركبات الأخرى. ج') مخطط لبيانات المسح بعد تطبيع درجة Z القوي (robust Z-score normalization). تمت إزالة الأخطاء المنهجية مثل الاختلافات بين الأطباق من البيانات. تشير الخطوط الحمراء إلى المتوسط ± s.e.m. للضوابط الإيجابية داخل الطبق. الخط الأسود: قيمة الحد الفاصل لتحديد الإصابات (hit identification) كما تم تحديدها بواسطة تحسين مؤشر يودن (الشكل 3). أعيد إنتاجه بإذن من14، 2012 ACS. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

مسح الجلوكوكورتيكويدات؛ خريطة حرارية، ومنحنى ROC يوضح التحليل التنبؤي؛ ونتائج مقايسة الفلورة.
الشكل 3. نتائج المسح. أ) خريطة حرارية لنتائج المسح. تم رسم قيم Z-score القوية لمركبات المكتبة في مواقع الآبار المقابلة. تظهر الضوابط الإيجابية في العمود 12 بالإضافة إلى مركبين إيجابيين في البئرين F8 و E2. ب) خريطة حرارية للوح تظهر انتقال مركب إيجابي أثناء تحضير المكتبة باستخدام روبوت السحب. يظهر تدرج في النشاط على طول مسار السحب الذي سلكه الروبوت. ج) منحنى خصائص التشغيل للمستقبل (ROC) للمسح. تم رسم معدلات الإيجابية الحقيقية المقدرة (محور y الأيسر) ومعدلات الإيجابية الكاذبة (محور x) لقيم القطع لـ Z-score القوية المتزايدة (مكودة بالألوان، محور y الأيمن). قيمة AUC للمنحنى الناتج قريبة من 1، مما يشير إلى أداء جيد للمقايسة. أُعيد إنتاجها بإذن من 14، 2012 ACS. د) جدول يوضح المركبات النشطة (باللون الأصفر) أو غير النشطة (باللون الأزرق) في المسح الأولي (prim.) أو في إعادة الاختبار. لم يتم دائمًا إعادة اختبار الجلوكوكورتيكويدات الأصلية Bona fide (باللون الأبيض). أُعيد رسمه بإذن من 14، 2012 ACS. انقر هنا لعرض شكل أكبر.

الإعدادات العامة:
الخطوة 1.1
الإجراء النوع:سائل واحد
الوضع:إفراغ (blow out)
عمليات التوزيع لكل سحب:1
تحسين السرعة:نعم
نظام الفجوات الهوائية:10 μl
النقل:0
الشطف/الغسل لا
السحب نوع الإعداد القيمة ملاحظات
الموضعB7, B10, B13, B16
حجم السحب10 μl
السرعة200 μl/sec
تتبع السائل60%
ارتفاع السحبالافتراضي للأدوات المخبرية22.28
التوزيع نوع الإعداد القيمة ملاحظات
المواضعD7, D10, D13, D16
حجم التوزيع10 μl
السرعة200 μl/sec
تتبع السائل100 μl
ارتفاع التوزيعالافتراضي للأدوات المخبرية17.01
الخطوة 1.2
الإجراء النوع: كاشف
الوضع:نفايات
عمليات التوزيع لكل سحب:3
تحسين السرعة:نعم
نظام الفجوات الهوائية:15 μl
النقل:0
الشطف/الغسل لا
السحب نوع الإعداد القيمة ملاحظات
الموضعA4
حجم السحب3 x 490 μl
الفجوات الهوائية15 و 0
السرعة200 μl/sec
تتبع السائل400%
ارتفاع السحبسطح السائل
التوزيع نوع الإعداد القيمة ملاحظات
الموضعD7, D10, D13, D16
حجم التوزيع490 μl
الفجوات الهوائية15 و 0
السرعة200 μl/sec
تتبع السائل100%
ارتفاع التوزيعالافتراضي للأدوات المخبرية17.01

الجدول 1. إعدادات جهاز Multiprobe II. يصف البروتوكول الوارد في الجدول 1 تحضير 4 أطباق (كل منها يحتوي على 96 بئراً). توضع الأطباق على محولات الأطباق في منطقة العمل في المواقع التي يحددها الروبوت (على سبيل المثال B7, B10, B13, B16).

الإعدادات العامة:
عدد تكرارات المقايسة يعتمد على طول فترة التشغيل
عدد الأطباقغير محدود
التحكم في درجة الحرارة28 °C
البروتوكول الحسابات
قراءة US Lum 96 (cps)
وقت القياس2.5 secتصحيح التداخل (Crosstalk correction)
المسافة بين الطبق والكاشف0 mm
عامل تصحيح التوهج (Glow CT2)0 %

الجدول 2. إعدادات EnVision المستخدمة في عملية الفحص.

المناقشة

نقدم هنا سير العمل وتحليل البيانات لشاشة كيميائية تقيس نشاط GC في الجسم الحي باستخدام مقايسة GRIZLY18. يتميز الاختبار بخصائص مراقبة الجودة ومقاييس الأداء التي يمكن مقارنتها بالشاشات التقليدية القائمة على الخلايا ، وهي ميزة مهمة لاستخدامه في الإعدادات عالية الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك ، يكتشف الفحص في الجسم الحي أيضا المركبات التي لا يمكن الوصول إليها من خلال الشاشات في المختبر . ويتضح ذلك من خلال وجود بريجنينولوني طليعة الهرمون بين الزيارات. وبالتالي ، فإن اختبار GRIZLY يوسع نطاق الشاشات التي تستهدف نشاط إشارات GC.

كما يتضح أهمية الكشف عن التأثيرات في الجسم الحي من خلال فحصنا من خلال النتائج التي حصلنا عليها مع الملوثات العضوية DBT و TBT18. ثبت أن DBT ، ولكن ليس TBT ، يثبط إشارات GC في زراعة خلايا الثدييات ، ولاحظنا الشيء نفسه في مزارع خلايا الزرد التي تعبر عن مراسل GRE: Luc. ومع ذلك ، الأهم من ذلك ، في مقايسة GRIZLY ، أظهر TBT نشاطا مثبطا على مسار GC ، حيث يمكن تحويله إلى DBT عن طريق استقلاب اليرقات. وقد لوحظ هذا التثبيط بالفعل بتركيزات ذات صلة بيئيا من الحواجز التقنية الTBT. توضح هذه النتائج بشكل أكبر إمكانات مقايسة GRIZLY في الكشف عن التأثيرات المركبة بناء على الحديث المتبادل بين الأعضاء والتعديلات الأيضية للمركبات في الحي. كما أنها تسلط الضوء على إمكانات تطبيق مقايسة GRIZLY للمراقبة البيئية. وبالتالي ، يمكن دراسة تأثيرات اضطراب الغدد الصماء على مستوى إشارات المستقبلات ، حيث يتداخل المعطل مع نشاط إشارات GC الناجم عن ناهض GR مثل ديكساميثازون. وهناك احتمال آخر لدراسة الآثار المركبة على توليف GC تحفز بريجنينولوني. يجب أن تسمح جودة الإنتاجية العالية للمقايسة بالفحص السريع لمكتبات العينات البيئية.

يسمح استخدام لوسيفيراز كجين مراسل بنطاق ديناميكي عال للكشف عن نشاط الإشارات23. في الواقع ، فإن حساسية الفحص تجعل من الممكن اكتشاف إنتاج GC الناجم عن الإجهاد التناضحي من اليرقات المفردة18. تسمح لنا الدقة الزمنية العالية التي تم تحقيقها باستخدام مراسل luciferase بمتابعة أنشطة الإشارات بمرور الوقت ، مما يجعل من الممكن تحليل حركية البيانات أيضا.

العيب المحتمل لبعض التطبيقات هو الملاءمة المحدودة للمراقبة المكانية لنظام المراسل هذا. قد تكون أنظمة المراسل الفلوري أكثر ملاءمة للمقايسات التي تتطلب مراقبة مناطق معينة من اليرقات. ومع ذلك ، قد تعاني هذه المقايسات من حساسية أقل بسبب تأثيرات الخلفية الناجمة عن ضوء الإثارة ، مما يفرض أيضا قيودا على اكتشاف مركبات الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، قد توفر دقة حركية أقل بسبب الاستقرار العالي بشكل عام لبروتينات الفلورسنت23. علاوة على ذلك ، فإنها تمثل تحديات من حيث معدات التصوير وتحليل البيانات وتخزين البيانات التي قد تحد من استخدامها لمختبرات الأبحاث الأصغر.

يسمح إعداد مقايسة GRIZLY كمقايسة قائمة على لوحة microtiter بالتكامل السهل في سير عمل الفحص النموذجي. يمكن تطبيق الفحص بسهولة أيضا في مختبرات الأبحاث الأصغر نظرا لمعالجته البسيطة وتحليل البيانات. في الوقت نفسه ، يسمح بدرجة كبيرة من الأتمتة ، على سبيل المثال التطبيق الآلي للأدوية عن طريق سحب الروبوتات أو التوزيع الآلي للأجنة بواسطة أجهزة فرز الأجنة24،25. لا تتطلب القراءة البسيطة مجاهر فحص آلية أو برامج تحليل صور متطورة ، ولكنها توفر مجموعة غنية من البيانات حول الجوانب الزمنية والكمية لمسار الإشارات المدروس.

باختصار ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لمقايسة فحص كيميائي غير مكلفة نسبيا وقوية وسهلة التعامل معها لنشاط إشارات GC في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي. يسمح الفحص بتحديد التأثيرات في الجسم الحي للمركبات على إشارات GC التي لا يمكن اكتشافها في المقايسات القائمة على زراعة الخلايا. من بين التطبيقات العديدة للمقايسة ، على سبيل المثال تحديد التأثيرات الجينية على إشارات الجلوكوكورتيكويد ، والمراقبة البيئية لتأثيرات اضطراب الغدد الصماء على تخليق الجلوكوكورتيكويد ونشاط الإشارات ، وفحص المركبات بحثا عن التأثيرات غير المرغوب فيها على إشارات GC أو لمعدلات جديدة في الجسم الحي لمسار الإشارات المهم هذا.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

نشكر S. Burkhart و C. Hofmann و Simone Gräßle على المساعدة الفنية الممتازة ونشعر بالامتنان ل M. Ferg للمساعدة في تحليل البيانات. كما نشكر S. Rastegar على التعليقات النقدية على المخطوطة. نحن نقر بالتمويل من قبل Studienstiftung des deutschen Volkes (إلى MW) و DFG (DI913 / 4-1) و Helmholtz Program BioInterfaces في KIT.

المواد

Instruments < / strong > < td colspan = "4" >< قوي > أواني بلاستيكية + مستهلكات < / قوي > 96 بئر لوحة تخزين ABgene AB-0765 بئر دائري ، 0.8 مل أغشية الغطاء ، 6018412 ماتيبلاب ذاتية اللصق ، مقاومة DMSO
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>تكوين عازلة + كواشف < / قوي >
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) CarlRoth GmbH Co KGA994.2
مكتبة الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواءEnzo Life SciencesBML-2841-0100
LuciferinBiosynthL-8220
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4902
الميثيلين أزرقسيجما-ألدريتشM9140
E3N / AN / A5 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.33 ملي كاسترول الكالسيوم < الفرعي >2< / sub >
Multiprobe IIPerkinElmer8 قناة ، مجهزة بمحول طرف يمكن التخلص
منه Liquidator 96Steinbrenner Laborsystemeماصة تعمل يدويا 96 قناة
قارئ الألواح متعدد التسميات EnVision XCitePerkinElmerمزود بأتمتة المعبئ ، والتحكم في درجة الحرارة ، وقارئ الباركود ، وكاشف اللمعان المحسن
نصائح الماصةSteinbrenner LaborsystemeLRF-200Lللمصفي 96 ، 200 & ل ، احتفاظ منخفض
TopSeal-APerkinElmer6005185
OptiPlate-96PerkinElmer6005299أبيض غير شفاف 96 بئر
ملصقات الباركودPerkinElmer1608182
أطراف ماصة البولي بروبيلين IsoTip المفلترةCorningS058.4809
Animals< / strong>
GRE: أسماك لوكN / AZDB-TGCONSTRCT-120920-1متوفرة في المركز الأوروبي لموارد أسماك الزرد EZRC ، كارلسروه
الأمريكية < td colspan = "4" >

المراجع

  1. Norris, D. O. Vertebrate Endocrinology. , 4, Elsevier Academic Press. (2007).
  2. Kassel, O., Herrlich, P. Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects. Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).
  3. Baschant, U., Tuckermann, J. The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).
  4. Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).
  5. De Bosscher, K. Selective Glucocorticoid Receptor modulators. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).
  6. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).
  7. Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).
  8. Casals-Casas, C., Desvergne, B. Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption. Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).
  9. Grun, F., Blumberg, B. Minireview: the case for obesogens. Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).
  10. Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance. J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).
  11. Odermatt, A., Gumy, C. Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals. Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).
  12. Lohr, H., Hammerschmidt, M. Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease. Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).
  13. Schaaf, M. J. Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish. Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).
  14. Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).
  15. Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).
  16. Alsop, D., Vijayan, M. M. Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).
  17. Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance. Steroids. 75, 918-925 (2010).
  18. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate. ACS Chem Biol. 7, (2012).
  19. Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).
  20. Birmingham, A. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
  21. Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).
  22. Carey, V., Redestig, H. ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , Boston, MA, USA. (2013).
  23. Fan, F., Wood, K. V. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).
  24. Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates. J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).
  25. Letamendia, A. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS ONE. 7, e36690(2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقايسة GRIZLYأسماك الزيبرا المعدلة وراثياًالتصوير الحيتسوية البياناتمراقبة الجودةالإنتاجية العالية
إجراء فحص كيميائي لإشارات الجلوكوكورتيكويد باستخدام نظام مراسل يرقات لوسيفيراز من يرقات الزرد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.