مقالة منهجية

واسعة المجال المجهري نيون نيون قياس التدفق الخلوي والتصوير على الهاتف الخلوي

DOI:

10.3791/50451

⸱

أبريل 11, 2013

 , 
1Electrical Engineering Department, University of California, Los Angeles , 2Bioengineering Department, University of California, Los Angeles , 3California NanoSystems Institute (CNSI), University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نستعرض نتائجنا الأخيرة على إدماج المجهر الفلورسنت وأدوات التصوير التدفق الخلوي على الهاتف الخلوي باستخدام المدمجة وفعالة من حيث التكلفة البصريات fluidic المرفقات. ويمكن لهذه الخلايا يعتمد الهاتف التحليل الجزئي الأجهزة تكون مفيدة لتحليل cytometric، مثل أداء المهام المختلفة عد الخلايا وكذلك لالفرز الفائق الإنتاجية من عينات المياه على سبيل المثال، في الأماكن ذات الموارد المحدودة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم على نطاق واسع المجهر الفلورسنت والتدفق الخلوي الأدوات في البحوث الطبية الحيوية والتشخيص السريري. ولكن هذه الأجهزة هي في عامة ضخمة ومكلفة نسبيا، مما يجعلها أقل فعالية في إعدادات الموارد محدودة. يحتمل أن تكون لمعالجة هذه القيود، وقد أثبتنا في الآونة الأخيرة دمج واسعة المجال المجهري الفلورسنت وأدوات التصوير التدفق الخلوي على الهواتف المحمولة باستخدام، والتعاقد خفيفة الوزن، وفعالة من حيث التكلفة مرفقات البصريات fluidic. لدينا في تدفق تصميم الخلوي، يتم مسح الخلايا fluorescently المسمى من خلال قناة ميكروفلويديك أن يتم وضع فوق وحدة الكاميرا الموجودة على الهاتف الخلوي. بطارية تعمل بالطاقة الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح) هي بعقب جانب إلى جانب هذه الشريحة ميكروفلويديك، والذي يعمل بشكل فعال والدليل الموجي متعدد الأوضاع بلاطة، حيث يتم توجيه ضوء الإثارة لتثير موحدة الأهداف الفلورسنت. الكاميرا الهاتف الخلوي يسجل فيلم الفاصل الزمني للخلايا التي تتدفق من خلال الفلورسنتقناة ميكروفلويديك، حيث تتم معالجة الإطارات الرقمية من هذا الفيلم لحساب عدد الخلايا المسماة في حل الهدف من الفائدة. باستخدام مماثلة البصريات fluidic تصميم، يمكننا أيضا صورة هذه الخلايا fluorescently المسمى في وضع ثابت من الجزيئات مثل يقحم الفلورسنت بين الشرائح الزجاجية اثنين والتقاط الصور الخاصة بهم الفلورسنت باستخدام الكاميرا الهاتف الخلوي، والتي يمكن تحقيق حل المكاني للمثال ~ 10 ميكرومتر على مدى كبير جدا في الميدان نظرا ل-من عيار 81 ~ 2. هذا الهاتف الخلوي يقوم الفلورسنت التدفق الخلوي التصوير المجهري ومنهاج قد تكون مفيدة بشكل خاص في الأماكن ذات الموارد المحدودة، مثل العد من لCD4 + الخلايا التائية نحو رصد المرضى بفيروس نقص المناعة البشرية أو + للكشف عن الطفيليات المنقولة عن طريق المياه في مياه الشرب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم على نطاق واسع وتدفق الخلوي المجهر تقنيات 1-12 في البحوث الطبية الحيوية والعلمية وكذلك التشخيص السريري لفرز وتوصيف أنواع الخلايا المختلفة. ومع ذلك، المجاهر التقليدية والصكوك التدفق الخلوي معقدة نسبيا وباهظة الثمن، مما يحد من استخدامها للمختبرات راسخة أساسا المركزية. مؤخرا قمنا بتطوير مدمجة وخفيفة الوزن الخلوي التصوير المجهري الفلورسنت وجهاز متكامل على الهاتف الجوال، مما يدل على 13،14 وعد فعالية من حيث التكلفة ترجمة المجهر الفلورسنت، وتدفق الخلوي، وما يتصل بها من تقنيات التحليل الجزئي إلى البيئات ذات الموارد المحدودة لل تطبيقات الطب عن بعد المختلفة التي تؤثر الصحة العالمية.

في تكوين تدفق الخلوي optofluidic (انظر على سبيل المثال الشكل 1C و 1D)، وهو مصمم خصيصا polydimethysiloxane (PDMS) قناة ميكروفلويديك مقرها positioneد أمام الكاميرا وحدة الهاتف الخلوي، حيث الباعثة للضوء الثنائيات، (المصابيح) هي بعقب بالإضافة إلى حواف القناة. هذه الشريحة ميكروفلويديك، جنبا إلى جنب مع عينة السائل داخل، يشكل الدليل الموجي مستو البصريات fluidic (التي تتألف من PDMS على سبيل المثال، السائل PDMS) بحيث يتم توجيه الضوء بشكل موحد الإثارة على ضخ العينات الفلورسنت المسماة داخل القناة الصغيرة. وكذلك تصوير الانبعاثات مضان من هذه الكائنات المسماة، مثل الخلايا، من خلال عدسة إضافية وضعت مباشرة بعد وحدة الكاميرا الهاتف الخلوي ويتم تعيين على الهاتف الخلوي التكميلية المعدنية أكسيد أشباه الموصلات صورة الاستشعار (CMOS). منذ يتم جمع الانبعاثات الفلورسنت عمودي على مسار الضوء الإثارة، غير مكلفة مرشح امتصاص البلاستيك يكفي لإزالة ضوء متناثرة الإثارة ويمكن أن توفر لائق داكنة مجال التصوير الخلفية اللازمة لالفلورسنت. باستخدام مماثلة البصريات fluidic تصميم، يمكننا أيضا صورة الكائنات الفلورية في القانون الأساسيجيم وضع (انظر الشكل 1A و 1B)، التي تقع في الجسيمات الفلورية بين اثنين من الزجاج بدلا من الشرائح التي تتدفق من خلال قناة ميكروفلويديك والانبعاثات من هذه الجسيمات الفلورسنت الفلورسنت يتم التقاطها بواسطة أجهزة الاستشعار الهاتف الخلوي الصورة CMOS لعد الجسيمات و التوصيف. يمكن بناء على متطلبات التطبيق المختلفة، أو التدفق الخلوي واسعة المجال المجهري الفلورسنت يتم اختياره. على سبيل المثال، يمكن الهاتف الخلوي جهاز التدفق الخلوي تكون مفيدة بشكل خاص لفحص كميات كبيرة من عينات السائل (مثل مل الحصر) للكشف عن خلايا نادرة أو مسببات الأمراض.

في هذا المخطوط نستعرض بعض نتائجنا الأخيرة على إدماج المجهر الفلورسنت وأدوات التصوير التدفق الخلوي على الهاتف الخلوي باستخدام المدمجة وفعالة من حيث التكلفة البصريات fluidic المرفقات. يمكن لهذه الهاتف الخلوي على أساس التحليل الجزئي، ومنصات التصوير الخلوي الاستشعار عن بعد توفر فرصا مختلفةلتشخيص والتطبيب عن بعد نقطة من الرعاية، مما يؤثر خصوصا حربنا ضد التحديات الصحية العالمية في مناطق محدودة الموارد في العالم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا القسم، ونحن نقدم البروتوكولات التجريبية لدينا الهاتف الخلوي المجهر واسعة المجال استنادا مضان 13 و البصريات fluidic منصة الخلوي التصوير 14. سوف نستخدم حبات الفلورسنت وfluorescently المسمى خلايا الدم البيضاء لاختبار هذه المنصات التصوير.

A. إعداد الهاتف الجوال استنادا اسعة المجال مجهر نيون وعلم البصريات fluidic قياس التدفق الخلوي التصوير

الهاتف الخلوي يقوم اسعة المجال المجهر الفلورسنت أو قياس التدفق الخلوي يتكون من جزأين أساسيين: كاميرا الهاتف المدمجة والبصريات fluidic إضافة على المرفقات.

1. كاميرا الهاتف

في حين أن التقنيات المعروضة قابلة للتطبيق على الهاتف تقريبا أي كاميرا، اخترنا سوني إريكسون أينو كقاعدة لهذه الأجهزة. هذا الهاتف الخلوي يحتوي على 8 ميجابيكسل الاستشعار ~ CMOS RGB مثبتة عليه وعدسة مدمجة في أن لديه البعد البؤري (F 1) من 4،65 ملم ~.

2. البصريات fluidic مرفق لواسعة المجال المجهري الفلورسنت

تم تصميم المرفق البصرية من قبل أوتوديسك، وطباعتها من قبل نخبة البعد 3-D الطابعة باستخدام المواد بالحرارة ABSplus. في هذه العملية الطباعة، يتم تسخين المواد النموذج والدعم في رأس البثق داخل الطابعة وتترسب طبقة بعد طبقة على قاعدة النمذجة. عند اكتمال هذه الخطوة، يمكن حل المواد الداعمة، وترك نموذج 3D قوية من النموذج المطلوب لدينا تصميم مرفق بصري يتكون من المصابيح (الطول الموجي مركز نانومتر في 470 ~، Digikey)، مرشح البلاستيك (# NT54-46، إدموند البصريات)، علبة العينة، وعدسة محدبة بلانو-F 2 = 15 مم (# NT45-302، ادموند البصريات). يمكن جميع المصابيح والفلاتر البلاستيك تغييرها بسهولة يعتمد على أطياف من fluorophores. الخطوات لتجميع هذا المرفق البصريات fluidic ما يلي:

  1. ضع العدسة في داخل المرفق المحدد عدسة موقف حامل.
  2. وضع فلتر على علبة بلاستيكية تصفية وأدخلها في المرفقات، أو تصفية الشريط البلاستيك أمام عدسة الكاميرا الهاتف الخلوي.
  3. أدخل الدرج LED في المرفق.
  4. وضع الشرائح الزجاجية عينة في علبة العينة. حرك علبة العينة إلى المرفق. مواجهة المصابيح نحو العينة.
  5. مقطع المرفق على الهاتف الخلوي، مثل أن العدسة الإضافية مباشرة في اتصال مع عدسة الكاميرا الهاتف الخلوي.
  6. استخدام رمز التبديل على المرفق لتشغيل المصابيح.
  7. صورة العينة في المصالح مع وحدة الكاميرا الهاتف الخلوي باستخدام "الوضع الليلي" لها.

3. البصريات fluidic مرفق للالخلوي التصوير نيون

عندما يكون هناك حاجة لفحص كميات كبيرة من عينات السائل للكشف عن أحداث نادرة، يمكن أن يفضل optofluidic جهاز التدفق الخلوي. يمكننا تعديل واسع لدينا مجال التصميم المجهر الفلورسنت وتحويله إلى تدفق عداد الكريات، ثهنا يتم استخدام قناة ميكروفلويديك PDMS القائمة باستمرار لتقديم العينة السائلة من خلال حجم التصوير. كما تم تصميم المرفق البصرية من قبل أوتوديسك وطباعتها من قبل النخبة البعد طابعة 3-D. وتتكون أيضا من المصابيح (الطول الموجي مركز نانومتر في 470 ~، Digikey)، مرشح البلاستيك (# NT54-46، ادموند البصريات)، علبة العينة، وaspherical عدسة (F = 4.5 مم) (المنتج # C230TME-A؛ Thorlab). الخطوات لتجميع هذا المرفق البصريات fluidic ما يلي:

  1. وضع aspherical عدسة في المرفق.
  2. وضع فلتر على علبة بلاستيكية تصفية وأدخلها في المرفقات، أو تصفية الشريط البلاستيك أمام عدسة الكاميرا الهواتف المحمولة.
  3. حرك قناة ميكروفلويديك في المرفق البصريات fluidic نفسه.
  4. مقطع المرفق على الهاتف الخلوي بحيث عدسة إضافية غير مباشرة في اتصال مع عدسة الكاميرا الهاتف الخلوي.
  5. استخدام رمز التبديل على المرفق لتشغيل المصابيح.
  6. توصيل microfluidIC قناة لمضخة محقنة وتسليم عينة السائل في الجهاز ميكروفلويديك بمعدل تدفق مستمر.
  7. القبض على الفيلم من الخلايا نيون / الجسيمات التي تتدفق من خلال قناة ميكروفلويديك باستخدام وضع الفيديو من الكاميرا الهاتف الخلوي.

تحضير العينة B.

4. إعداد عينات الجسيمات الصغرية نيون

  1. يتم شراؤها من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا)؛: الخرز الفلورسنت مع قطر ميكرون 10 (الإثارة / 505nm/515nm الانبعاثات: المنتج # F8836 حبات الخرز الأحمر الأخضر المنتج # F8834 الإثارة / 580nm/605nm الانبعاثات).
  2. خلط 10 ميكرولتر من الخرز الفلورسنت الأخضر، 10 ميكرولتر من الخرز الفلورسنت الأحمر مع 40 ميكرولتر من المياه DI.
  3. Place10 ميكرولتر من هذا الخليط حبة على شريحة زجاجية باستخدام micropipette ووضع شريحة زجاجية أخرى على أعلى من ذلك لجعل هيكل ساندويتش.
  4. إدراج هذه البنية ساندويتش في علبة العينة وأدخلها في المرفقات الهاتف الخلوي.

5. إعداد fluorescently المسمى خلايا الدم البيضاء

  1. اتخاذ SYTO16 حمض النووي الفلورسنت عدة وضع العلامات (# S7578 والتكنولوجيا الحياة) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الخروج من الثلاجة وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. نقل 200 ميكرولتر عينة من الدم الكامل من الدم EDTA أنبوب 1.5 مل لجمع أنبوب البوليسترين (# 05-408-129، فيشر العلمية).
  3. إضافة 1 مل خلايا الدم الحمراء العازلة lysing (# R7757، سيغما الدريخ) لال 200 ميكرولتر عينة الدم الكامل ومزيج دقيق.
  4. بعد 5 دقائق، أجهزة الطرد المركزي لعينة من الدم هي lysed وإزالة طاف حل.
  5. إعادة تعليق لخلايا الدم البيضاء بيليه إلى 200 ميكرولتر العازلة PBS وتخلط بلطف لهم.
  6. إضافة 5 ميكرولتر 1 ملم SYTO16 حل للعينة خلايا الدم البيضاء. التفاف العينة مع رقائق الألومنيوم واحتضان في بيئة مظلمة ل30 دقيقة ~.
  7. أجهزة الطرد المركزي لعينة مرة أخرى. تتم إزالة طاف وإعادة تسمية خلايا الدم البيضاء بيليهعلقت في المخزن المؤقت-PBS.
  8. وضع ميكرولتر 5-10 المسمى الأبيض السائل خلية عينة من الدم لزلة غطاء، ووضع غطاء زلة الثاني على الجزء العلوي من العينة.
  9. إدراج الشريحة عينة تقع في علبة عينة وصورة ذلك باستخدام المجهر الفلورسنت الهاتف الخلوي.

بدلا من ذلك

  1. تسليم باستمرار fluorescently المسمى خلايا الدم البيضاء من خلال قناة ميكروفلويديك باستخدام مضخة محقنة الآلي، وأيضا أثناء التقاط فيلم الفلورسنت مجهرية من الخلايا التي تتدفق عبر استخدام كاميرا الهاتف الخلوي في وضع الفيديو. يجب أن نؤكد أيضا التي يمكن استخدامها لمضخة محمولة تعمل بالطاقة بطارية حقنة أو قوة الجاذبية حتى لدفع تدفق من خلال قناة ميكروفلويديك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع fluidic-البصريات دينا ضخ / الإثارة مخطط (أرقام 1C و 1D)، يمكن خلايا fluorescently المسمى تسليمها باستمرار في قناة ميكروفلويديك باستخدام مضخة محقنة في حين أن الكاميرا الهاتف الخلوي يسجل الوقت الفاصل بين المجهري الفلورسنت الفيلم من الخلايا المتدفقة. ويمكن بعد هذه الأفلام يتم تحليلها بسرعة الفلورسنت باستخدام كفاف الكشف عن الخوارزميات وتتبع لتحديد تلقائيا 14،15 العدد المطلق وكثافة الخلايا التي تتدفق من خلال القنوات ميكروفلويديك، مع وظيفة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قدمنا ​​نتائجنا الأخيرة على الهاتف الجوال يعتمد اسعة المجال المجهري الفلورسنت والبصريات fluidic التدفق الخلوي باستخدام التصوير خفيفة الوزن وصغيرة الحجم مرفقات البصريات fluidic لكاميرات الهاتف الخلوي. باستخدام هذه التكنولوجيا منصة تصوير الكائنات نحن الفلورسنت بما في ذلك الجزيئات المتناهية الصغر والمسماة خلايا الدم البيضاء في عينات الدم كله. ولذلك، وهذا قد الهاتف الخلوي على أساس التعاقد وفعالة من حيث التكلفة مجموعة أدوات التصوير الفلورسنت تكون مفيدة لنقطة من الرعاية والتشخيص، وخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور أوزكان هو مؤسس شركة البدء التي تهدف إلى تسويق التصوير المجهري وأدوات حسابية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. أوزكان بامتنان بدعم من جائزة رئاسية مبكرة شهادة للعلماء والمهندسين (PECASE)، الجيش بحوث مكتبية (ARO) جائزة الباحث الشاب، المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) جائزة الوظيفي، ومكتب البحوث البحرية (ONR) جائزة الباحث الشاب والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) جائزة المدير الجديد المبتكر DP2OD006427 من مكتب المدير، المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الهاتف الخليويسونيسوني إريكسون Aino
عدسة بلانو محدبةإدموند للبصريات# NT45-302
عدسة شبه كرويةThorlab# مرشح C230TME-A
Edmund Optics#NT54-46
Blue LEDDigikey# 365-1201-ND
BatteryDigikey#P032-ND
أنبوب البوليسترينفيشر العلمي# 05-408-129
عازلة تحلل خلايا الدم الحمراءSigma AldrichR7757
SYLGARD 184 مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكونداو كورنينج
حبات الفلورسنت الحمراء (10 & mu ؛ م)تقنياتالحياة#F8834
حبات الفلورسنت الخضراء (10 مو ؛ م)تقنيات الحياة#F8836
SYTO16 وضع العلامات الفلورية على الحمضLife Technologies# S7578
النووي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
  2. Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
  3. Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
  6. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
  7. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801(2006).
  11. Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
  12. Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
  13. Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
  14. Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
  15. Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
  16. Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
  17. Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
  18. Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LED

مقالات ذات صلة