نقل الجينات الفيروسة الغدانية إلى الخلايا التائية CD4 السذاجة مع التعبير المعدلة وراثيا من مستقبلات اتش كوكساكي يتيح للتحليل الجزيئي للالتنظيمية تمايز الخلايا T في المختبر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ضرورية لتوفير التسامح المناعي في تقرير المصير، وكذلك لبعض المستضدات الخارجية. يمكن أن تتولد Tregs من السذاجة خلايا CD4 T في المختبر مع TCR وشارك في التحفيز في وجود TGFβ وIL-2. هذا يحمل إمكانات هائلة لعلاجات المستقبل، ومع ذلك، فإن الجزيئات ومسارات الإشارات التي تمايز التحكم غير معروفة إلى حد كبير.
يمكن التلاعب بها الخلايا التائية الأولية من خلال التعبير الجيني خارج الرحم، ولكن تفشل الطرق الشائعة لاستهداف الدولة السذاجة أهم من الخلية T قبل الاعتراف مستضد الأولية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول للتعبير عن الجينات خارج الرحم في السذاجة خلايا CD4 T في المختبر قبل إحداث تمايز Treg. وهو ينطبق تنبيغ مع اتش النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ويشرح جيل والإنتاج. واتش يمكن أن يستغرق إدراج كبيرة (تصل إلى 7 كيلو بايت) ويمكن أن تكون مجهزة مع المروجين لتحقيق overexp عالية وعابرةression في الخلايا التائية. فإنه transduces فعال السذاجة خلايا T الماوس إذا كانت تعبر عن المعدلة وراثيا كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). الأهم من ذلك، بعد الإصابة تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) ويمكن تفعيلها ومتباينة في Tregs مماثلة لخلايا غير المصابة. وبالتالي، تمكن هذه الطريقة من التلاعب CD4 T تمايز الخلايا من بدايتها. أنه يضمن التعبير الجيني خارج الرحم هو بالفعل في المكان عندما الأحداث يشير في وقت مبكر من التحفيز TCR الأولي يدفع التغيرات الخلوية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى Treg التمايز.
المقدمة
Tregs حاسمة للحفاظ على التسامح المناعي وكبح الاستجابات المناعية المبالغة. Tregs قمع المارة تنشيط الخلايا T. ونتيجة لذلك، الاجتثاث من Tregs يؤدي إلى المناعة الذاتية القاتلة والتدمير الذاتي مدفوعا تنشيط خلايا T 1. Tregs تطوير في الغدة الصعترية خلال اختيار السلبية للCD4 السلائف إيجابية واحدة، ولكنها يمكن أيضا التفريق في محيط من السذاجة الخلايا CD4 T على جرعة منخفضة من التحفيز مستضد مع الأمثل 1،2 المشترك التحفيز. الغدة الصعترية Tregs يبدو لقمع المناعة الذاتية أنسجة ضد المستضدات عن النفس، في حين قد تورطت الطرفية Tregs في توفير التسامح في القناة الهضمية أو سرطان الرئة. هذه يسببها Tregs منع أكثر قدرة تنشيط الخلاي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. استنساخ الجين من الاهتمام إلى متجه الدخول
- استنساخ الجين من الاهتمام إلى متجه دخول. PCR التضخيم من الجينات تليها ربط حادة في نهاية إلى ناقلات topoisomerase يقترن (على سبيل المثال pENTR / D-TOPO) أو تقييد انزيم بوساطة الاستنساخ يمكن استخدامها لهذا الإجراء.
2. نقل الجينات في المصالح في pCAGAdDu الوجهة المتجهات
- نقل الجينات في المصالح من ناقلات دخول ناقلات الوجهة التي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إنتاج فيروس
لجيل من التتر فيروس عالية، توقيت الحصاد خلية HEK293A في إنتاج فيروس الأولية أو التضخيم فيروس أمر بالغ الأهمية. يتم عرض ممثل الفلورسنت والمرحلة على النقيض من الصور مع علامات مرئية من إنتاج الفيروس في الشكل 3. وقد لوحظت CPE بعد 10 أيام ترنسفكأيشن من الخلايا HEK293A مع pCAGAdDu مكافحة ناقلات دون إدراج. وتتميز CPE من خلال ظهور المناطق مع الخلايا الموسع وجولة المتابعة أن تبدأ في فصل ويحمل الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجيل الفيروسات والمعايرة
من أجل تحقيق النتائج المثلى ترنسفكأيشن، ونوعية وكمية خطي ناقلات يبدو الأكثر أهمية. نحن لم تراع الآثار السلبية على الإنتاج المحللة الأولية من فرط الأولي للثقافة منذ عدوى ستمضي قدما بسرعة بمجرد أن يحدث إنتاج فيروس فعالة. ومع ذلك، إنتاج الفيروس عن طريق الخلايا HEK293A يمكن أن تتأثر إدراج طويلة التي تقلل من كفاءة. تم العثور على بعض إطارات القراءة المفتوحة في الواقع للتدخل في إنتاج الفيروس. عادة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر Lirui دو للبناء ناقلات pCAGAdDU وأوليفر جوركا لأحكام البروتوكول التثبيت.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم استنساخ pENTR / D-TOPO | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II مزيج إنزيم | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6 آبار ألواح | BD Falcon | 353046 | |
| 14 سم طبق زراعة الأنسجة | Nunc | 168381 | |
| BALB / cJ-Tg (DO11.10) 10Dlo Tg (CAR & Delta ؛ 1) 1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4 + T T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| محلول عازلة HEPES (1 م) | Invitrogen | 15630-056 | |
| & beta ؛ -Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM خليط الفيتامينات الأساسية (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3 / CD28 لتوسيع الخلايا وتنشيطها | Invitrogen | 114-56D | |
| المؤتلف البشري TGF-beta 1 | R & D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 × 106IE) | Novartis | ||
| LIVE / DEAD Fixable Blue Dead Dead Dead Spot | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse / Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
المراجع
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
