مقالة منهجية

حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

DOI:

10.3791/50485

⸱

نوفمبر 5, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Centre for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University Rostock, 2Institute for Experimental Surgery, University of Rostock

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

intravital المجهري للالمشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس M. عروض فريدة وموحدة جيدا في نموذج الجسم الحي لتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عصر داخل الأوعية تطبيق البروتوكولات خلية في سياق العلاج بالخلايا التجدد، الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا الجذعية إلى أنسجة nonmarrow لم تتوضح تماما. نحن هنا وصف تقنية intravital المجهري تطبيقها على المشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس لتحليل نخاع العظام الطرفية هجرة الخلايا الجذعية في الجسم الحي. intravital المجهري للM. المشمرة وقد أدخلت سابقا في مجال البحوث لالتهابات الملاحظة المباشرة للتفاعل الكرية البيضاء مع بطانة الأوعية الدموية. منذ الجذعية الطرفية كافية والسلف الخلية الهجرة يتضمن خطوات أولية مماثلة من المتداول على طول التصاق وطيد في البطانية المبطنة فمن المتصور لتطبيق نموذج المشمرة M. لرصد وتقدير حجم التفاعل بين الخلايا الجذعية تدار intravasculary مع البطانة. كما المكونات الكيميائية المختلفة يمكن تطبيقها بشكل انتقائي لر الهدفالمشكلة عن طريق تقنيات superfusion بسيطة، فمن الممكن لإنشاء شروط مسبقة microenvironmental الأساسية، للتجنيد الخلايا الجذعية الأولية لتجري في الكائن الحي خارج نخاع العظام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغرض من هذه المادة هو لوصف أسلوب intravital المجهري (IVM) تطبق على المشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس للمراقبة المباشرة وتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة.

المفهوم الحالي من الخلايا الجذعية استنادا الأنسجة والأعضاء التجديد ينطوي على صاروخ موجه من نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة من الأنسجة المصابة 1. خطوة حاسمة لنجاح الهجرة الخلايا الجذعية يشمل وقف تفاعل الخلايا مع البطانة المحلية داخل الجهاز المصاب تليها الهجرة transendothelial وفي النهاية الجهاز engraftment 2. تحليل حيوي داخلي من هذه الخلايا الجذعية - التفاعلات الخلية البطانية يشكل معلمة مثالية لتقدير حجم استجابة التجدد الخلايا الجذعية ومقرها في إعدادات الفيزيولوجية المرضية المختلفة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يبدو تصور، أنه في المستقبل، وتحليل حيوي داخلي قدرة هجرة محددة ع الخلايا الجذعيةopulations ضمن بيئات الأوعية الدقيقة موحدة، يمكن تطبيقها قبل دفع هؤلاء السكان إلى مزيد من التجارب السريرية.

وقد intravital المجهري وضعت في البداية لرصد وتقدير حجم الكرية البيضاء-البطانية تفاعل الخلايا في الجسم الحي في مجال البحوث التهابات 3. ولم يبلغ عن والتسجيلات الناجحة الأولى من دراسات intravital المجهري بواسطة كونهايم بالفعل في القرن 19، ودراسة ألسنة الضفادع 'والمساريقا تحت المجهر الضوء 4. منذ أول استخدام لها IVM شهد التطور التقني الهائل واليوم بعض مكونات أساسية تشكل الشروط الأساسية من أجل أداء IVM الكمية: (ط) الاستعدادات الأنسجة التي تسمح بالوصول البصرية، (ب) تحقيقات الجزيئية التي يمكن الكشف عنها بواسطة المجهر، (ج ) المجهر متصلا نظام الكشف و (iv) تحليل النظم كمبيوتر يستند التي يمكن استخراج المعلمات من الاهتمام من بيانات الصورةضبط 4.

وقد تم عرض مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية للدراسات الأنسجة بما في ذلك الإدارة المتكاملة للنواقل المساريقا وكبد الفأر والجرذ 5، غرف الظهرية ثنية الجلد من الماوس 6 والهامستر، والأذن الأرنب والقداد الخد الحقيبة على سبيل المثال لا الحصر.

ومع ذلك، في ما يلي سوف نركز على عضلة المشمرة الماوس، وهو ما يمثل الأنسجة مثالية للملاحظات حيوي داخلي، وإعداد والتصور ممكنة من خلال إجراء العمليات الجراحية موحدة بشكل جيد، وبصفة عامة أي مشاكل من التحف حركة تحدث. وقد أجريت إعداد العضلات المشمرة مفتوحة للمرة الأولى في 1970s من قبل بايز وزملاؤه 7. ووصف في الأصل للفئران، وقد تم اعتماده بنجاح أيضا في الماوس 8. بعد أن تركز أساسا على الدراسات السابقة التفاعلات الكرية البيضاء مع جدار الوعاء الدموي، وعرض مجموعتنا مؤخرا الماوس إعداد العضلات المشمرة باعتبارها valuaأداة بلي لرؤية مباشرة والتحليل الكمي من الخلايا الجذعية التفاعلات البطانة داخل المكروية تعريف 9. وقد تم دراسة مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الجذعية باستخدام هذا النموذج، بما في ذلك الفئران ج طقم + الخلايا الجذعية نخاع العظم والخلايا الجذعية الوسيطة، وكذلك CD الإنسان الخلايا الجذعية نخاع العظم 133 + 10-12. بعد عزل الخلايا من نخاع العظام المانحة ووضع العلامات الفلورية عن التصور، يتم تطبيق انتقائي الخلايا الجذعية في دوران الأوعية الدقيقة المشمرة باستخدام حقنة الشرياني عن طريق الشريان الفخذي، وبالتالي تجنب أي فخ خلية داخل الأجهزة عن بعد. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج العضلات المشمرة مفيد بشكل خاص منذ كيموكينات مختلف يحتمل التوسط الهجرة الخلايا الجذعية المحلية ضمن إعدادات منها، ويمكن تطبيقها موضعيا على الأنسجة المستهدفة بواسطة تقنية superfusion بسيطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول بالكامل بعد عزل الخلايا يستغرق حوالي 2 ساعة.

1. إعداد المجهرية

  1. أداء الجذعية العزلة الخلية من نخاع العظام المانحة ووضع العلامات الفلورية من الفئات السكانية المعزولة وفقا لبروتوكولات موحدة 9،12 يسمح للخلايا للراحة خلال فترة يتم تنفيذ العملية الحيوان. لوضع العلامات الفلورية نوصي CFDA (Carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر).
  2. تخدير ماوس الذكور وزنها 20-25 غ مع الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وزيلازين (2.5 ملغ / كلغ). في جميع أنحاء العمليات الجراحية التجريبية والبروتوكولات، ينبغي الحفاظ على التخدير عن طريق المكملات الغذائية (10٪ من الحقن الأولى، IP) حسب الحاجة (عادة كل 30-60 دقيقة).
  3. يحلق بلطف الجانب الأمامي من كيس الصفن الحق وكذلك الفخذ الأيمن وأعلى الفخذ. جمع كل يفقد الشعر مع مسحة القطن مبللة. وضع الجانب البطني الماوس حتى على مرحلة عرض شبكي وتحديد رسومر باستخدام ثنى مرونة. وحسب الطلب المرحلة، تتكون من قاعدة لوحة لوحة والثانية على حافة الذيلية من قاعدة لوحة لارتفاع كل من الساقين وكيس الصفن. وضع المرحلة على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. بعد التثبيت على المسرح، وضع الحيوان تحت المجهر تشغيل وتنفيذ الخطوات العملية التالية باستخدام 10 - إلى 16 أضعاف التكبير.
  4. جعل شق الأولي باستخدام مقص الجلد في الفخذ الأيمن، الأمامي فقط من السفن الفخذ من الركبة حتى إلى أعلى الفخذ.
  5. التعرف على الشريان الفخذي ومتابعته بشكل قريب، وحشد من الشريان المحيطة الأنسجة اللينة. تحديد وخفض فرع كبير إلى الخصية اليسرى باستخدام مكواة. وضع بعد ذلك خياطة إقامة سطحي في الخصية اليسرى. والجر لطيف تيسير مواصلة تعبئة القريب من الشريان الفخذي.
  6. بعد الانتهاء من تعبئة الداني، وتحديد وخفض فرع بتشغيل كبير medially في الفخذ بواسطة مكواة. بعد ذلك ligate الشريان الفخذي في الجزء الأعلى من الفخذ الأيمن. والجر لطيف على ربطة مساعدة مزيد من التحضير.
  7. تحويل الاهتمام الآن إلى الشريان الفخذي الداني مرة أخرى ووضع خياطة حول الشريان قريب كما ممكن. إعداد عقدة ولكن لا ربط عليه حتى الآن. تطبيق الجر لطيف لخياطة وخلق مجعد الشرايين.
  8. بعد إنشاء مجعد، شق الشريان يتم بعناية باستخدام microscissor. عناية خاصة لا تلحق الضرر الوريد الفخذي.
  9. إدراج microcatheter استعداد (القطر الداخلي 0.28 مم) عن طريق شق. يجب deaired القسطرة (0.9٪ كلوريد الصوديوم، كلوريد الصوديوم) ومتصلة الإدراج قبل 1 مل حقنة.
  10. بعد الإدراج الناجح لقسطرة، وتخفيف بعناية مجعد من أجل تسهيل مرور القسطرة. وينبغي أن يكون تدفق الدم في الشرايين مرئية على الفور داخل القسطرة. بلطف دفع القسطرة بضعة ملليمترما وراء مجعد السابقة. بعد ذلك، ربط ربطة أسفل أعدت لتثبيت القسطرة.
  11. مسح بلطف القسطرة (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ونضح لتأكيد الموقف الصحيح. استخدام قطعة من الشريط لتأمين مزيد من القسطرة إلى المرحلة العملية.
  12. بعد تثبيت كافية، ووضع القسطرة جانبا لإعداد الخطوات التالية للعضلة المشمرة. تطبيق التنظيف العادية وتطلع القسطرة كل 5-10 دقيقة من أجل منع تشكيل جلطة.
  13. تحويل الاهتمام الآن إلى كيس الصفن الحق وإجراء شق طريق قطع الجلد واللفافة فوق الجانب البطني للكيس الصفن الحق. والحرص على عدم لمس الأنسجة الكامنة مع أي الصكوك.
  14. تمديد شق تصل إلى أضعاف الأربية ونحو caudally إلى نهاية البعيدة للكيس الصفن.
  15. الأنسجة منفصلة بعناية الكامنة لينة والضام فوق كيس المشمرة، دون لمسها. تحديد نهاية البعيدة للالمشمرة، ووضع خياطة البقاء هنا لSLightly تمديد العضلات. يقطع الآن المتبقية الأنسجة الرخوة تحت كيس العضلات عن طريق سحب بلطف العضلة الأمامية ونحو caudally.
  16. بعد فصل كامل من النسيج الضام، وفتح كيس المشمرة عند نقطة واحدة على حافة الجمجمة باستخدام المقص. تمديد شق من هذا الانفتاح وصولا الى نهاية البعيدة للعضلة.
  17. ختم سفينة صغيرة يربط بين الخصية والمشمرة باستخدام مكواة، وقطع الاتصالات بعد ذلك المتبقية بين العضلات والخصية باستخدام المقص.
  18. وضع جانبا الخصية، من الحقل المجهري.
  19. والمشمرة فتح الآن يضع شقة على المسرح. وضع أربع 6-0 الغرز إقامة البرولين على حواف الأنسجة واصلاحها مع ثنى مرونة من أجل نشر الأنسجة العضلية المشمرة. من الآن فصاعدا بلل باستمرار الأنسجة بمحلول ملحي (PBS) الفوسفات مخزنة باستخدام حقنة 1 مل (الشكل 1).
  20. تسمح الآن إعداد لبقية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك حقن0.05-0.1 مل من 1٪ رودامين-ديكستران عبر الشريان الفخذي الأيسر لتعزيز النقيض من الأوعية الدموية الدقيقة. إذا تم التخطيط لأي كيموكينات التهابات أو وكلاء للتطبيق، يجب عليك الآن بلل موضعيا في العضلات مع كاشف كل باستخدام حقنة 1 مل. في حالة وجود تجربة السيطرة، ويستمر تبليل مع برنامج تلفزيوني.

2. حيوي داخلي المجهر

  1. الحفاظ على الماوس ثابتة على الساحة العملية وتتحرك تحت المجهر مضان المعدلة لبرنامج التحصين الموسع في الإضاءة ومتصلة اتفاقية مكافحة التصحر (إلى جانب المسؤول عن الجهاز) كاميرا الفيديو. عناية خاصة ليس لخلخل الشريان الفخذي القسطرة.
  2. إجراء تجارب باستخدام الهدف الغمر بالماء.
  3. بعد ضبط الهدف لتصور كاف من دوران الأوعية الدقيقة المشمرة وقبل حقن الخلايا، وتحديد عشوائيا ستة الوريدات شعيرة وريدية لتحليلها لاحقا من شركة تمسك الخلايا الجذعية.
  4. إدارة الخلايا الجذعية التي تحمل علامات الفلورسنت،المذاب في 200 ميكرولتر PBS، عند 0.4 × 10 6 خلايا في الحقن، مع ما مجموعه خمسة حقن متتالية الاستفادة من الشريان الفخذي والقسطرة حقنة 1 مل. يهز بعناية عينة الخلية قبل الحقنة الأولى.
  5. سجل الخلايا الجذعية المتداول مباشرة بعد حقن الخلايا، وبالتالي تحديد "المتداول"، كما خفض أكثر من 50٪ من سرعة الخلايا البطانية على طول بطانة بالاشتراك مع نموذجية الخلوية "العصا والافراج عن" الحركات. أداء عد الخلايا الجذعية المتداول وجميع الخلايا الجذعية اجتياز المسافة المحددة مسبقا وريدي خلال 1 دقيقة من المراقبة بعد كل حقنة واحدة. وأعرب عن كمية من الخلايا الجذعية المتداول كنسبة مئوية من جميع الخلايا المارة. لا تعول الخلايا العارضة عشوائية الظواهر الربط الإيجاز قدر الخلايا المتداول.
  6. بعد حقن الخلايا الماضي تحديد عدد الخلايا الجذعية ملتصقة بقوة عن طريق عد والتعبير عن كمية فيما يتعلق سطح البطانية تحسب من اله ستة الأوردة محددة مسبقا (قطر × طول × π) كما الخلايا الملتصقة / مم 2. وتعتبر شركة التصاق عندما لا حركة الخلية قابلا للاكتشاف لمدة 30 ثانية.
  7. بعد الانتهاء من intravital المجهري إزالة بعناية العضلات المشمرة وتخزينها في المراسلات لتحليلها لاحقا (المناعية أو البيولوجيا الجزيئية). التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم. تحليل تسجيلات intravital المجهري لتقدير حجم الخلية الجذعية المتداول والتصاق البطانية الشركة، فضلا عن ديناميكا الدم الاوعية الدموية الدقيقة، مثل سرعة خلية الدم الحمراء (ملم / ثانية)، وطول السفينة (ميكرون)، وقطره سفينة (ميكرون)، ومعدل نصيب الجدار (ثانية -1)، وينبغي أن يؤديها حاليا من قبل المحقق أعمى لعلاج الأنسجة التجريبية منها على الاستفادة من برامج معالجة الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بشكل عام، والتفاعل مباشرة من حقن الخلايا الجذعية أو السلف مع بطانة الأوعية الدموية داخل العضلات المشمرة دوران الأوعية الدقيقة هو حدث نادر ويحدث حصرا في الأوردة شعيرة وريدية (قطر: 30-80 ميكرون). نظرا لوضع العلامات مضان المتداول والخلايا الجذعية تمسكا راسخا يمكن قياسها كميا بشكل واضح في فصل كريات الدم البيضاء من تعميم الذاتية في الأوردة لاحظ (الشكل 2).

الشروط الأوعية الدقيقة ممثلة في سرعة تدفق الدم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حيوي داخلي المجهري مضان يسمح للرؤية مباشرة والتحليل الكمي من الخلايا الجذعية، البطانة التفاعلات. نموذج العضلات المشمرة مفيد بشكل خاص، لأن التعرض المجهرية وتقنيات التصور حيوي داخلي تم راسخة خلال البحوث على التفاعلات الكرية البيضاء البطانة والمكونات الكيميائية المختلفة يمكن تطبيقها بشكل انتقائي إلى النسيج المستهدف بواسطة تقنية superfusion بسيطة. نظرا لعدم وجود القطع الأثرية الحركة والضوضاء صورة شديدة، وهذا نموذج معين، بالمقارنة مع غيرها من الإعدادات حيوي داخلي المجهر، ويوفر ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات، التي أجريت لهذه المخطوطة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المحلي.

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كربوكسي فلوريسين ثنائي أسيتات السكسينيميديلستر (CFDA)Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةC1157
Rhodamine 6 G (1٪)Sigma-Aldrich ، ميونيخ ، ألمانيا83697
كيتامين (Ketanest)Pfizer ، برلين ، ألمانياغير متوفر
Xylacin (Rompun)Bayer ، Leverkusen ، ألمانياغير متوفر
فوسفات دولبيكو - محلول ملحي مخزن (PBS)PAN Biotech ، Aidenbach ، ألمانياP04-36500

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
  2. Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home? Blood. 106, 1901-1910 (2005).
  3. Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
  4. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  5. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
  6. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  7. Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
  8. Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874(2011).
  9. Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
  10. Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
  11. Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
  12. Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة