مقالة منهجية

طريقة حساسة لقياس خلايا السرطان هرمة

DOI:

10.3791/50494

⸱

أغسطس 2, 2013

 , 
1MILPAT (EA 4652), Université de Caen Basse-Normandie

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سواء الشيخوخة يمنع تكون الأورام أو يروج تبقى مثيرة للجدل. منذ المخدرات chemotherapeutical يمكن أن تحفز الخلايا السرطانية إلى senesce، ودراسة الشيخوخة أمر ضروري لاقتراح علاجات جديدة. ومع ذلك، فإن معيار وتستخدم على نطاق واسع فحص β-غالاكتوزيداز يعرض العوائق الرئيسية. نقترح هنا تدفق فحص السريع وحساسة القائم على الخلوي لتحديد الشيخوخة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا البشرية لا تتكاثر إلى ما لا نهاية. عند الإشارات الخارجية و / أو الجوهرية، قد تموت الخلايا أو إدخال مستقر الخلية اعتقال دورة تسمى الشيخوخة. وقد تبين أن العديد من الآليات الخلوية، مثل تقصير التيلومير والتعبير غير طبيعي من الجينات المسرطنة مولد للتفتل، أن تسبب الشيخوخة. لا يقتصر الشيخوخة للخلايا الطبيعية، وقد تم الإبلاغ أيضا عن الخلايا السرطانية إلى senesce.

وقد ثبت أن الأدوية Chemotherapeutical للحث على الشيخوخة في الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فإنه لا تزال موضع جدل ما إذا كانت الشيخوخة يمنع تكون الأورام أو يروج. كما أنه قد يكون في نهاية المطاف المريض محددة، سيتم قريبا المطلوبة طريقة سريعة وحساسة لتقييم الشيخوخة في الخلايا السرطانية.

وتحقيقا لهذه الغاية، ومعيار فحص β-غالاكتوزيداز، والطريقة المستخدمة حاليا، ويعرض العوائق الرئيسية: فهو مضيعة للوقت وغير حساسة. نقترح هنا تدفق مقايسة على أساس الخلوي لدراسة الشيخوخة على لىهاء الخلايا. هذا الاختبار يوفر ميزة كونها سريعة وحساسة، ويمكن أن يقترن إلى الوسم المناعي من مختلف العلامات الخلوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ مطلع الستينات واكتشافه من قبل Hayflick ومورهيد، الشيخوخة لا يزال فضول الخلوية 1. الخلايا البشرية لا تتكاثر إلى ما لا نهاية، وبحلول الشيخوخة، Hayflick ومورهيد صاغ عملية الخلوية من الشيخوخة. الشيخوخة هو مستقر الخلية اعتقال دورة في الخلايا التي لا تزال نشطة عملية الأيض في مقابل الموت الخلوي. حتى الآن، وقد ثبت أن أربع آليات الخلوية للحث على الشيخوخة: تقصير التيلومير، الحمض النووي من التلف، اضطراب لونين، والتعبير غير طبيعي من الجينات المسرطنة مولد للتفتل 2. هذا يشير إلى أن الخلايا الطبيعية فحسب، بل أيضا الخلايا السرطانية قادرة على الخضوع الشيخوخة 3. كما واقع الأمر، عرضت خلايا السرطان الذين يخضعون الشيخوخة تشكل عائقا أمام مزيد من تطور الورم 4-5. ومع ذلك، فقد أشارت العديد من التقارير الآن إلى أنه، في ظل ظروف معينة، الشيخوخة الخلوية يمكن أيضا أن تعزز خباثة 6-7. دراسة الشيخوخة من سرطان سلLS على وشك أن تصبح الرغبة في أبحاث السرطان كما هو مستخدم حاليا أدوية العلاج الكيميائي يمكن أن يؤدي إلى الشيخوخة من الخلايا السرطانية في المختبر ليس فقط ولكن أيضا في الجسم الحي 8.

مقايسة ماستر للتحقيق لوجود خلايا هرمة هو فحص β-غالاكتوزيداز في الرقم الهيدروجيني الحمضية. ويعكس هذا الاختبار النسيجية زيادة في نشوء حيوي الليزوزومية التي تحدث في معظم خلايا هرمة. لفترة وجيزة، الخارجية X-غال، وتطبيقها على الخلايا، هو المشقوق بواسطة β-غالاكتوزيداز المخصب في الجسيمات الحالة من خلايا هرمة، مما أدى إلى اللون الأزرق 9. ويمكن بعد ذلك كميا خلايا هرمة الأزرق تحت المجهر حقل مشرق. على الرغم من شعبية جدا، الفحص β-غالاكتوزيداز يعرض العوائق الرئيسية. أولا، يتم تنفيذ هذا الاختبار على خلايا ثابتة. الثاني، هو مضيعة للوقت لأنه يعني لقياس درجة من الشيخوخة عن طريق عد عدد كبير كبير من خلايا هرمة تحت المجهر. ثالثا، هذا الاختبارليست حساسة مثل التمييز بين خلايا هرمة وغير هرمة يعتمد كليا على المراقب.

نناقش هنا ل، وسريعة، وحساسية مقايسة على أساس الخلوي غير المستغلة لتقييم وجود خلايا هرمة الحية. ويستند هذا الاختبار على التحلل من جزيء نفاذية الغشاء، و5 dodecanoylaminofluorescein دى β-D-galactopyranoside (C 12 FDG)، بواسطة β-غالاكتوزيداز المخصب في خلايا هرمة. بعد التحلل والإثارة ليزر، وC 12 FDG تنبعث مضان أخضر، وبالتالي يمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي 10، 11. الكشف عن خلايا هرمة عبر التدفق الخلوي يوفر ميزة كبيرة من كونها سريعة وحساسة. وبالإضافة إلى ذلك، والكشف عن خلايا هرمة بواسطة التدفق الخلوي يمكن أن يقترن مع الكشف عن علامات الخلوية الأخرى. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لكشف خلايا هرمة ضمن مجموعة من السكان من الخلايا السرطانية تعامل مع العلاج الكيميائي ويمكن وضعها بشكل روتينيحتى على أقسام الأنسجة، بعد الخلوية التفكك، في العيادة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد C12FDG، Bafilomycin A1، والثقافة الخليوي

  1. حل مسحوق FDG C 12 في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى التركيز النهائي من 20 ملم. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. DMSO ينبغي أن تستخدم مع شروط السلامة المناسبة.
  2. حل مسحوق A1 bafilomycin في DMSO إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم. قسامة وتخزينها في - 20 درجة مئوية. Bafilomycin ينبغي أن تستخدم مع شروط السلامة المناسبة.
  3. زراعة RPMI 8226 خط الخلية، أو خطوط الخلايا الأخرى ملتصقة أم لا، في وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ المضادات الحيوية، عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تقدير عدد الخلايا اللازمة للتجربة. من أجل تسجيل عدد كاف من الأحداث خلال تحليل التدفق الخلوي، يطلب 5 × 10 5 خلايا. لتحديد النسبة المئوية للخلايا هرمة، هناك حاجة إلى ثلاث عينات الخلايا: عينة غير المسماة، الخلايا غير المعالجة ملطخة C 12 FDG، الخلايا المعالجة ملطخةC 12 FDG.
  4. بذور الخلايا 24 ساعة قبل إجراء التجربة بحيث الخلايا في مراحل سجل من منحنى الانتشار الخلوي.

2. تحريض الشيخوخة

  1. لحث الشيخوخة للخلايا السرطانية وذلك بإضافة المخدرات chemotherapeutical. وينبغي تكييف تركيز الدواء ومدة العلاج إلى نوع من الخلايا التي تم اختبارها. تبدأ مع العلاج الموارد البشرية 48 في تركيز النهائي من 50 نانومتر دوكسوروبيسين لتركيز من الخلايا في حوالي 10 6 خلية / مل. لا تنسى أن تشمل عينة غير المعالجة (مراقبة سلبية).

3. Bafilomycin A1 معالجة

  1. تحقق بقاء الخلية عن طريق خلط الخلايا مع التريبان الأزرق (V / V)، والدواء chemotherapeutical المستخدمة في الخطوة السابقة قد يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الخلية. شغل في غرفة مالاسيه وحساب عدد الخلايا الزرقاء (الخلايا الميتة) والخلايا البيضاء (الخلايا الحية). إذا كانت النسبة المئوية للبقاء أقل من 70٪، قد تكون الخلايا الميتة REMاوفيد باستخدام عدة المناسبة لضمان عدم التحيز في التحليل اللاحق الخلايا الميتة.
  2. إزالة وسائل الإعلام والثقافة، واستبدال من قبل وسائل الاعلام prewarmed ثقافة جديدة. علاج الخلايا مع تركيز النهائي من 100 نانومتر من bafilomycin A1. يستخدم Bafilomycin A1 لتحييد الحموضة الحمضية من الجسيمات الحالة. احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

4. C 12 FDG تلطيخ

  1. حل C 12 FDG في prewarmed سائل الإعلام والثقافة الطازجة إلى تركيز النهائي من 2 مم.
  2. إضافة إلى مركب الخلايا في تركيز النهائي من 33 ميكرومتر واحتضان 2 ساعة على 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. إذا باستخدام الخلايا غير ملتصقة، الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية (قد يكون من سرعة إلى تعديل لنوع من الخلايا المستخدمة)، وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني. Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة. إذا باستخدام الخلايا الملتصقة، وإزالة وسائل الاعلام وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني. حصاد الخلايا الملتصقة باستخدام محلول التربسين وأجهزة الطرد المركزيالخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ° C (سرعة قد يتعين تعديلها لنوع من الخلايا المستخدمة). Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة. في كلتا الحالتين، يجب أن يكون تركيز خلية حوالي 10 6 خلية / مل.
  3. أداء المشارك الوسم المناعي لمزيد من تميز السكان من خلايا هرمة.

5. تحليل التدفق الخلوي

  1. معايرة عداد الكريات تدفق باستخدام الخرز المكافحة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للتدفق عداد الكريات. لجميع الخطوات، 10 على الأقل 4 الأحداث يجب أن يتم تسجيلها.
  2. تشغيل العينة الأولى التي تحتوي على خلايا غير المسماة. إعداد اثنين من المعلمة الرسم عرض القناة مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب قناة مبعثر (SSC). ضبط مضخم أنابيب (فرق إدارة المشاريع PMT) وتحديد المنطقة ذات الاهتمام استبعاد الخلايا الميتة والبقايا الخلوية يمكن أن تكون قد ظهرت أثناء إعداد العينة. بوابة هذه المنطقة من مصلحة في الرسم البياني، معلمة واحدة عرض FL1 على مقياس سجلللمحور X وعدد من الأحداث في المحور الصادي. إجمالي عدد الأحداث يمثل عدد الخلايا التي تم تحليلها. تعيين PMT بحيث تظهر الخلايا غير المسماة في العقد الأول على مقياس سجل من المحور س. تحديد تألق ذاتي للخلايا إذا لزم الأمر.
  3. تشغيل العينة الثانية التي تحتوي على الخلايا غير المعالجة. على الرسم البياني-معلمة واحدة عرض FL1 (مضان من C 12 FDG)، ضع المؤشر بعد السكان المسمى الخافتة. وسوف تسمح هذه العتبة التمييز بين الخلايا غير هرمة (الخلايا المسمى خافت) وخلايا هرمة (الخلايا المسمى الزاهية).
  4. تشغيل العينة الثالثة التي تحتوي على الخلايا المعالجة. المسمى الزاهية الخلايا، أي خلايا هرمة تظهر فوق العتبة المحددة في الخطوة السابقة. تقييم النسبة المئوية للخلايا هرمة بقسمة عدد من الأحداث مشرق في العدد الإجمالي للأحداث. إذا لزم الأمر، وآخر من β-غالاكتوزيداز يمكن أيضا أن يقدر باستخدام مضان يعنيكثافة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم المايلوما المتعددة، وهو الورم الخبيث الدم، لتقييم الشيخوخة الناجمة عن إجراء chemotherapeutical. للقيام بذلك كان يعالج خط خلية MM المتاحة تجاريا (RPMI 8226) لأيام 2 مع دوكسوروبيسين، وهو دواء chemotherapeutical. وبعد ذلك تعرض الخلايا لعلاج bafilomycin A1 وكذلك حضنت مع C 12 FDG. وقد تم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. ويوضح الشكل (1) والخطوات ومعارض مختلفة أن النسبة المئوية للخلايا هرمة يمكن تحديد غضون يوم واحد مع استخدام C 12 FDG...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمنا ​​هنا طريقة تعتمد على التدفق الخلوي لقياس الشيخوخة الخلوية في الخلايا السرطانية الحية. ويستند هذا الأسلوب على استخدام مركب نفاذية الغشاء، وC 12 FDG، وبالتالي يمكن استخدامها في أي نوع من أنواع الخلايا وبعد العلاجات المختلفة طالما يتم أخذ المجمع من قبل الخلايا. على امتصاص الخلوية، وC 12 FDG هو تحلل من قبل β-غالاكتوزيداز، مما أثرى في الجسيمات الحالة من خلايا هرمة. بعد الإثارة ليزر، مجمع تنبعث مضان أخضر، والسماح لالكمي لخلايا هرمة. يمكن إما أن يتم هذا القيا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر SF 4206 ICORE (جامعة كاين) لاستخدام المرفق الخلوي. تلقى JC زمالات ما بعد الدكتوراه من CONSEIL دي Radioprotection D'EDF وCONSEIL الإقليمي لباس نورماندي. وكانت تلك البيانات جزء من المشاريع الممولة من قبل الرابطة الوطنية مناهضة جنيه السرطان - مرافقة DE L'أورني وآخرون دو كالفادوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-dodecanoylaminofluorescein di- &# 946;-D-galactopyranoside InvitrogenD-2893
ثنائي ميثيل سلفوكسيد SigmaD2650
Bafilomycin A1SigmaB1793
DoxorubicinSandoz
Trypan blueSigmaT8154
RPMI 1640 وسط زراعة الخلاياLonzaBE12-702
مصل ربلة الساق الجنينيةمختبرات PAA GmBHA15 101
المضادات الحيويةGibco5290-018
مقياس التدفق الخلويGallios Beckman CoulterA94291

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
  4. Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
  5. Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
  6. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
  7. Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
  8. Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  9. Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
  10. Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
  11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  12. Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Flow Cytometry AssayC12 FDG SubstrateBeta Galactosidase ActivityDoxorubicin TreatmentFluorescence QuantificationCell Viability AnalysisImmunolabeling ControlsChemotherapeutic Drug ScreeningSenescence Detection Method

مقالات ذات صلة