فحص<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الخلايا الطرفية الرغامي بواسطة المجهر الضوئي

ملخص

هنا، نقدم طريقة لتحليل المجهر الضوئي للخلايا القصبة الهوائية في محطة ذبابة الفاكهة اليرقات. هذا الأسلوب يسمح للفحص السريع للفرع والتشكل التجويف في الحيوانات كلها وسيكون من المفيد تحليل المسوخ الفردية أو شاشات لالطفرات التي تؤثر على تطور الخلايا الطرفية.

الملخص

شكل الخلية أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلية. ومع ذلك، على الرغم من أهمية مورفولوجيا الخلايا، لا يعرف إلا القليل حول كيفية الخلايا الفردية توليد الأشكال محددة. ذبابة الفاكهة الخلايا محطة القصبة الهوائية أصبحت نموذجا الوراثية قوية لتحديد وتوضيح دور كل من الجينات المطلوبة لتوليد الأشكال التضاريسية الخلوية. الخلايا محطة هي مكون من مكونات شبكة أنبوبية متفرعة، ونظام القصبة الهوائية الذي يعمل على توريد الأكسجين إلى الأنسجة الداخلية. الخلايا محطة هي نموذج ممتاز للتحقيق في الأسئلة من شكل الخلية كما أنها تمتلك اثنين من أبنية الخلوية متميزة. أولا، خلايا محطة لها مورفولوجيا متفرعة تفصيلا، على غرار الخلايا العصبية المعقدة، وثانيا، يتم تشكيل فروع الخلية محطة وأنابيب رقيقة وتحتوي على تجويف داخل الخلايا غشاء محدد. التحليل الكمي من محطة الخلية رقم الفرع، تنظيم فرع وشكل فرع الفردية، ويمكن استخدامها لتقديم معلومات حول دور الميكانيكية وراثية محددةanisms في صنع خلية متفرعة. تحليل تشكيل أنبوب في هذه الخلايا يمكن أن تكشف عن آليات الحفظ من tubulogenesis مشتركة لشبكات أنبوبي الأخرى، مثل الأوعية الدموية الفقارية. نحن هنا وصف التقنيات التي يمكن استخدامها لإصلاح بسرعة، صورة، وتحليل كل أنماط المتفرعة وتشكيل أنبوب في الخلايا الطرفية داخل يرقات ذبابة الفاكهة. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتحليل الخلايا الطرفية في البرية من نوع ومتحولة الحيوانات، أو الفسيفساء الوراثية. بسبب الكفاءة العالية من هذا البروتوكول، وأيضا مناسبة تماما لأنها وراثية، المستندة إلى رني، أو شاشات المخدرات في النظام القصبة الهوائية ذبابة الفاكهة.

المقدمة

شكل الخلية هو أمر حاسم لوظيفة الخلايا الفردية داخل الكائن الحي، وكذلك الخلايا التي وظيفة كجزء من النسيج أو العضو. نحن نستخدم خلايا ذبابة الفاكهة محطة القصبة الهوائية، وهو مكون من الجهاز التنفسي الحشرات، للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تشارك في السيطرة على نوعين الحفظ من التشكل الخلوي: المتفرعة وتشكيل أنبوب (lumenogenesis). وتقع محطة الخلايا على نصائح من شبكة من أنابيب متفرعة الذي يعمل على إيصال الأوكسجين إلى الأنسجة الداخلية ⁽¹⁾ ولها مورفولوجيا متفرعة معقدة والتي تعتمد على مسار الإشارات جمعية جيل المستقبل التي تسيطر عليها مستويات الاوكسجين المحلية داخل الأنسجة المستهدفة ^2. فروع الخلية محطة هي أنابيب رقيقة، مع التجويف التحت خلوية مليئة بالغاز من خلال تشغيل كل فرع. أبنية الخلوية متميزة من الخلايا الطرفية، جنبا إلى جنب مع سهولة عن طريق التحليل الجيني التي يمكن أن يؤديها في ذبابة الفاكهة، وجعل هذه الخلايا نموذج F ممتازأو التحقيق في آليات ثمرة الخلوية، المتفرعة، وتشكيل أنبوب داخل الخلايا. وقد أثبتت الخلايا محطة نموذجا مفيدا لفهم بعض مسارات الإشارات المؤدية إلى تمايز الخلية متفرعة، ثمرة، ونضوج ^2-4. باستخدام هذا النظام غير متحيز، وقد أجريت شاشات الوراثية إلى الأمام بالنسبة المسوخ التشكل الخلية، مما أسفر عن نظرة ثاقبة آليات السيطرة على شكل الخلية ^5،6. على سبيل المثال، فقد كشفت هذه الشاشات أن RabGAP محددة مطلوب لقطبية هيكل الخلية والاتجار حويصلة في تشكيل التجويف وتحديد المواقع ^(7)؛ أن التصاق إنتغرين بوساطة مطلوب من أجل الاستقرار فرع ^8، وأن البروتينات PAR-قطبية الظهارية تنظيم الاتجار غشاء الاستقطاب المطلوبة لكلا المتفرعة وتشكيل التجويف ^9. وقد أظهرت دراسات أخرى في الخلايا الطرفية التي تراكم أكتين غير المتماثلة وتنظيم أنيبيب مطلوب للاستطالة الخلية وlumenogenesis 10. وهكذا، وآليات متنوعة، الخلية المحمية البيولوجية تسهم في محطة التشكل الخلية.

هنا، نحن تصف طريقة لإصلاح بسرعة سليمة، الطور الثالث يرقات ذبابة الفاكهة لتحليل محطة خلية المتفرعة وتشكيل التجويف. ويمكن أيضا أن يتم هذا البروتوكول خارجا على الحيوانات على حد سواء الطور الأول والثاني. المفتاح لهذه التقنية هو القدرة على تصور الخلايا الطرفية التي وصفت وراثيا بواسطة فلوري بروتين تعبير مباشرة من خلال إهاب اليرقات من الحيوانات سليمة. لأن هذا الإجراء لا يتطلب أي تلاعب في مرحلة ما بعد التثبيت، مثل تلوين الأجسام المضادة، لمراقبة الخلايا، فإنه هي مناسبة تماما لتحليل إنتاجية عالية، بما في ذلك الفحص الجيني أو المخدرات. فلوري بروتين تعبير يكشف عن هيكل من الفروع cytoplasmically مليئة. يمكن رصدها تشكيل أنبوب بالتوازي باستخدام المجهر brightfield لتحديد التجويف مليئة بالغاز، الذي يتناقض مع السوائل المحيطة ملءالأنسجة إد.

المدرجة في هذا البروتوكول هو طريقة لتوليد الفسيفساء الجينية على أساس نظام MARCM ^11، لإنتاج خلايا متماثلة اللواقح محطة متحولة المسمى مع البروتينات الفلورية في الحيوانات غير المسماة خلاف ذلك. وهذا أمر ضروري، لأن الخلايا الطرفية وضع فقط هياكلها المعقدة في وقت متأخر نسبيا في التنمية؛ الفسيفساء الوراثية تسمح لتجاوز متطلبات الجينات في الأنسجة الأخرى في مجال التنمية في وقت سابق. . لتوليد الحيوانات المستنسخة MARCM، وصفت القصبة الهوائية باستخدام برنامج تشغيل القصبة الهوائية محددة لاهث (زجاجة) ¹² صفها هنا هو بروتوكول لذبابة الفاكهة كروموسوم X؛ للصبغيات أخرى، إجراء مماثل يمكن استخدامها، مع الكواشف الجينية المناسبة للكروموسوم يجري فحصها. هنا، وصفت القصبة الهوائية عن طريق التعبير عن GFP المترجمة cytoplasmically، ولكن هذا الإجراء يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع التعبير عن البروتينات الفلورية الأخرى، مثل DsRed.

بالإضافة إلى ذلك، أدرجنا طريقة لقياس أنماط المتفرعة وتشكيل التجويف في الخلايا الطرفية، على أساس الطرق وضعت لوصف أنماط فرع العصبية ^13. هذا النوع من البيانات الكمية يمكن أن تكون حاسمة في المميزين الدور الدقيق للجينات في عملية التفرع أو lumenogenesis، فضلا عن السماح لإجراء مقارنات مباشرة بين المسوخ مختلف ^9.

البروتوكول

1. الجيل فسيفساء

1. الصليب الوراثية
   ث FRT ^19A الحوض: GAL80 FLP ¹²² / Y؛ زجاجة، GAL4، UAS GFP-(ذكور) X * FRT ^19A / بال (الإناث)، حيث * يمثل متحولة لفحصها. ملاحظة: إعداد عبور يوم واحد على الأقل قبل التجربة، وهذا يسمح للحيوانات لزميله بشكل مناسب.
2. قبل العلمانيين: تحويل الصليب إلى قارورة يطير الغذاء مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة الطازجة وضعها على وسائل الإعلام. السماح لوضع لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية.
3. وضع: نقل الحيوانات من مرحلة ما قبل وضع قنينة إلى قارورة جديدة مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة الطازجة. السماح لوضع لمدة 6 ساعة عند 25 درجة مئوية.
4. نقل البالغين يعود إلى ما قبل وضع قنينة للتخزين والاستخدام في التجارب اللاحقة. الصدمة الحرارية على الفور القارورة التي تحتوي على ارساء 0-6 ساعة الأجنة القديمة لمدة 45 دقيقة عند 38 درجة مئوية، في حمام مائي تعميم. ملاحظة: يجب على السطح من المواد الغذائية تكون تحت مستوى الماء للتحقق من جميعالأجنة يتم تسخين مناسب بالصدمة.
5. احتضان قارورة صدمت الحرارة عند 25 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام حتى الثالث يرقات العمر تبدأ في يهيمون على وجوههم.

2. الشاشة للحيوانات الفسيفساء

1. باستخدام ملقط غرامة اختيار بلطف تجول اليرقات طور مرحلي الثالثة من الجانبين من القارورة ووضعها في مبرد الجلسرين بنسبة 100٪ في لوحة بلاستيكية صغيرة.
2. دراسة اليرقات باستخدام مجهر التكبير تشريح عالية مجهزة البصريات الفلورسنت. تحديد اليرقات مع التعبير فسيفساء من خلايا القصبة الهوائية fluorescently المسمى. عادة، هذا يمكن القيام به في 10 20X التكبير.

3. تثبيت الحرارة

1. باستخدام ملقط غرامة اختيار بعناية الحيوانات فسيفساء من طبق وضعها في قطرة من الطازجة 100٪ الجلسرين على 75x25x1 مم أبيض شريحة المجهر والزجاج. ملاحظة: الحيوانات متعددة يمكن وضعها في قطرة (الشكل 1A).
   ويمكن أيضا أن توضع الحيوانات في قطرة من الجلسرين مباشرة على ساترة،ولكن يجب توخي الحذر أثناء التثبيت (الخطوة 3.2)، حيث أن الحيوانات سوف الحرارة بسرعة جدا ويمكن أن تصبح أكثر ثابت.
2. مكان شريحة زجاجية على 70 درجة مئوية كتلة الحرارة حتى الحيوانات فقط يتوقف عن الحركة، لا يزيد عن 20 ثانية لشريحة، و 10 ثانية لزلة تغطية (1B الشكل). سوف تملص الحيوانات في البداية ولكن توقف وأصبحت جامدة وميتة ممدود مرة واحدة. ملاحظة: سوف التعرض للحرارة أطول مما يضر فروع محطة شمعة وكذلك جعل إشارة GFP خافت ومنتشر. لتحقيق الكفاءة المثلى فمن المستحسن أن يكون كتلة الحرارة في نفس الغرفة مع والمجاهر.
3. باستخدام ملقط غرامة بعناية توجيه جميع اليرقات في الانخفاض في اتجاه واحد، مثل أن جميع اليرقات على الشريحة هي موازية موجهة إلى بعضها البعض (الشكل 1C).
4. وضع بلطف على 18x18mm الغطاء الزجاجي الصغير على رأس اليرقات (أو عكس ساترة على شريحة زجاجية) وتجنب فقاعات التشكيل (1D الشكل). ملاحظة: قد لا ساترة تكمن بالضبطشقة على يرقات، هذه ليست مشكلة.
5. اليرقات صورة في غضون 30 دقيقة. حرارة الخلايا الطرفية الثابتة سوف تتحلل وسوف إشارة GFP أصبح منتشر جدا.

4. في مجال التصوير المجراة من الخلايا الطرفية الرغامي

1. ضع الشريحة على مرحلة من مراحل stereomicroscope المجمع. باستخدام الهدف 5X تحديد موقع اثنين من جذوع الظهرية متوازية تمتد من الأمامي إلى الخلفي على السطح الظهري للحيوان (الشكل 1F). تحديد موقع اثنين من الخلايا محطة الظهرية، مباشرة بين اثنين من جذوع الظهرية. هذا يساعد على تحديد الجزء المناسب للتحليل.
2. مرة واحدة موجهة، وتناوب على الحيوانات لصورة الخلايا الطرفية المطلوب. للقيام بذلك، ودفع بعناية ساترة على حافة مع ملقط عمودي على محور طويل من اليرقات، المتداول ببطء اليرقات تحت ساترة (أرقام 1E و1G).
3. تحديد الخلايا محطة مناسبة أمر حاسم بالنسبة لنتائج متسقةوالمقارنات بين المسوخ. تم العثور على فرع الدهون في الجسم (الفيس بوك) الخلايا الطرفية بسهولة المتاخمة للجذع الظهرية، الوحشي على خط الوسط. تم العثور بسهولة على مجموعة الخلايا محطة G الوحشي (LG) وتقع فقط الجانبي من خط الوسط بطني (الشكل 1H). ملاحظة: في (TR10) شرائح الأكثر الأمامي (TR1) والخلفي ترتيب الخلية المحطة هو متباينة من القطاعات الأخرى. نحن فقط تحليل الخلايا الطرفية في قطاعات TR2-TR9. الخلايا محطة الظهرية لديها نمط المتفرعة أكثر من غيرها من الخلايا النمطية محطة القصبة الهوائية. قد تعتمد على هذا، وإشارات إضافية مستقلة غير الخلية، وهذا ينبغي أخذها في الاعتبار عند تحديد ما إذا كان لتضمينها في التحليل.
4. مرة واحدة وقد تم التعرف على خلية محطة من الفائدة، والتقاط صورة باستخدام التكبير المطلوب، عادة 10X 20X أو أفضل (الشكل 2A). ملاحظة: نظرا لأنماط المتفرعة متغير، في محاولة لالتقاط الصور التي تشتمل على العديد من الفروع ونصائح فرع ممكن.
5. دون تحريك المرحلة، إيقاف مضان وتشغيل ضوء المنقولة لالتقاط صورة brightfield من نفس الخلية والمستوى البؤري (الشكل 2B). فإن التجويف يمكن تصور والمتناقضة على نحو مظلم داخل الفضاء خلية محطة. إذا كان التخطيط على تحديد الفروع خلية محطة وشمعة، وجمع صور متعددة في طائرات التنسيق متعددة من كل خلية محطة.

5. التحليل النوعي والكمي لمورفولوجيا الخلايا الطرفية باستخدام يماغيج

1. فتح الصور الفلورسنت وbrightfield باستخدام يماغيج ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) المكونات في NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
2. باستخدام "اقتفاء أثر إضافة" أداة، يدويا تتبع الفروع وتجويف الخلية محطة بأكملها.
3. باستخدام "اقتفاء أثر تسمية" أداة، تسمية وRecolor لتعيين كل سطر ضمن التتبع تسمية محددة.
4. باستخدام "تعيين المعلمات" أداة، وضبط عرض الخط 6-10 بكسل (ل512X512 الصور التي تم الحصول عليها من قبل الكاميرا الرقمية متصلا المجهر المركب. للكاميرات أعلى أو أقل القرار، ينبغي أن تقاس عرض بكسل بشكل مناسب)، وذلك باستخدام جميع الإعدادات الافتراضية الأخرى، واختيار "موافق". ثم استخدم "جعل لقطة" أداة لالتقاط صورة. اختيار "رسم التتبع" للحصول على لقطة من التتبع التي يمكن أن تظهر جنبا إلى جنب مع النص الأصلي.
5. حدد "اقتفاء أثر قياس" أداة وحدد نوع تتبع (أي فروع لقياس والتي تقوم على التسميات المحددة التي عهدت في الخطوة 5.3). بعد ذلك، حدد "عرض القياسات تتبع" و "القياسات السابقة واضح" ثم انقر فوق "تشغيل". هذا وسوف تنتج جداول البيانات التي تحتوي على اسم، والتسمية، وطول (بالبكسل)، وغيرها من البيانات للصورة. ويمكن بعد ذلك يتم حفظ هذه البيانات في جدول بيانات Microsoft Excel لمزيد الإحصائيةتحليل.

النتائج

وتظهر النتائج في الشكل 2. مجموعة الوحشي واحدة (LG) خلية محطة يظهر المتفرعة التحت خلوية واسعة النطاق (تصور من قبل GFP؛ A) والتجويف التحت خلوية مليئة بالغاز من خلال تشغيل كل فرع من الفروع (تصور من قبل المجهري brightfield؛ B). وقد جمعت هذه الصور من فسيفساء L3 يرقة، تم إنشاؤها باستخدام نظام MARCM المبينة في القسمين 1 و 2، وحرارة ثابتة وتصويرها، كما هو موضح في البابين 3 و 4. لوحات C & D إظهار أثر NeuronJ ولدت، كما هو موضح في القسم 5، من فروع والتجويف على التوالي من...

المناقشة

تقنية تثبيت حرارة الموصوفة هنا هي أداة سريعة ومريحة للتصوير ذبابة الفاكهة اليرقات الخلايا محطة القصبة الهوائية. هنا، ونحن نستخدم هذه التقنية لدراسة المتفرعة ونمط التجويف من الخلايا من النوع البري. خلايا القصبة الهوائية معربا عن GFP، مدفوعا المروج محددة القصبة الهوائية لاهث، يمكن تصور بسهولة من خلال بشرة اليرقات بعد تثبيت الحرارة. أنماط معينة من الخلايا المتفرعة محطة الفردية، فضلا عن تلك لمعة مليئة بالهواء، ويمكن أن يكون سريعا تصور وقياسها باستخدام هذا الأسلوب. وي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الطالب دومون # 5 ملقط	أدوات علمية دقيقة	91150-20
Leica MZ16 مجهر تشريح (أو ما يعادله)	Leica	MZ16
AxioImager M1 (أو ما يعادله)	كارل زايس		مجهز ب AxioCam MRm و A-PLAN 10X / 0.25 و EC PLAN-NEOFLUAR20X / 0.5 ، مجموعة المرشحات 38HE
100٪ Glycerol	BioExpress	M152-4L
الجيني لمخزون			الذبابة: ث FRT19A الحوض: GAL80 FLP122 ؛ Btl-GAL4 ، UAS-GFP y w FRT19A
النمط الجيني لمخزون			الذبابة: y w FRT19A

مجهر مركب النمط