Method Article

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل تدفق cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء يوفر طريقة الكمية الإنتاجية العالية لدراسة التفاعل البروتين البروتين. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لرسم الخرائط مواقع الربط البروتين ولفحص العوامل التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بين أساليب لدراسة التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا، التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) هو بسيط نسبيا وحساسة. ويستند BiFC على إنتاج مضان باستخدام اثنين من شظايا غير فلوري من بروتين فلوري (يتم استخدام فينوس، أصفر نيون البديل البروتين، هنا). وتنصهر شظايا فينوس غير الفلورسنت (VN وVC) لاثنين من البروتينات المتفاعلة (في هذه الحالة، AKAP-LBC وPDE4D3)، مما أسفر عن مضان بسبب التفاعل VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 وتشكيل بروتين فلوري وظيفية داخل الخلايا.

يوفر BiFC المعلومات على توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين وقوة تفاعلات البروتين على أساس كثافة مضان. ومع ذلك، تحليل BiFC باستخدام المجهر لقياس قوة التفاعل البروتين البروتين هو مضيعة للوقت وغير موضوعي إلى حد ما بسبب عدم التجانس في تعبير البروتين والتفاعل. بواسطة اقتران تدفق cytometricتحليل مع منهجية BiFC، وفلوري BiFC البروتين البروتين إشارة التفاعل يمكن قياسها بدقة للحصول على كمية كبيرة من الخلايا في وقت قصير. هنا، علينا أن نظهر تطبيق هذه المنهجية لرسم خريطة المناطق في PDE4D3 التي مطلوبة من أجل التفاعل مع AKAP-LBC. ويمكن تطبيق هذه المنهجية إنتاجية عالية لعوامل الفرز التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتقدر 650،000 البروتين البروتين التفاعلات في الوجود في interactome الإنسان، ولعب أدوارا حاسمة في الحفاظ على وظائف الخلية العادية 1،2. وبالاضافة الى المشارك مناعي (CO-IP)، المعيار الذهبي لدراسة التفاعل البروتين البروتين من الخلايا المحللة، العديد من البروتين شظية المقايسات تكامل (PCA) تم تطويرها لتحسين حساسية في الكشف عن تفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا 3. وتشمل تقنيات الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق)، تلألؤ بيولوجي بالرنين نقل الطاقة (BRET)، والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) 4،5. ويستند BiFC على جمعية تيسير اثنين من أجزاء من بروتين فلوري (هنا نستخدم فينوس؛ البديل YFP) التي تنصهر فيها كل لإمكانات شريك البروتين التفاعلي (في هذا المثال نستخدم AKAP-LBC وPDE4D3). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام داخل خلايا النتائج في مضان وظيفية، والتي يمكن أن تصور كتبها fالمجهر luorescence باستخدام خلايا حية أو الثابتة 6،7،8. مقارنة PCAs أخرى، BiFC حساس وأقل تحديا من الناحية التقنية، مع القدرة على دراسة توطين الخلوية في الخلايا الحية. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب ولكن هو أنه بمجرد تشكيل، مجمع بروتين فلوري لا يمكن عكسها. ولذلك فإنه ليس طريقة جيدة لدراسة ديناميكية التفاعل البروتين البروتين. في هذه الورقة، ونحن نستخدم BiFC لرسم خريطة للمواقع التفاعل من PDE4D3 مع AKAP-LBC خلال رصد كثافة مضان من كوكب الزهرة. بالمقارنة مع التحليل التقليدي باستخدام المجهر مضان، التي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة (إذا لم تنفذ باستخدام آلات مؤتمتة عالية الإنتاجية)، ويوفر التدفق الخلوي تحليل كمي مباشرة الآلاف من الخلايا في السكان غير متجانسة على مدى فترة زمنية قصيرة 9، 10. هنا، من خلال تنفيذ مقارنة جنبا إلى جنب من تحليل تدفق cytometric-BiFC والتقليدية المشارك IP، علينا أن نظهر أن اثنين من مethods توفير بيانات قابلة للمقارنة، ومع ذلك، تدفق تحليل BiFC cytometric هو أقل استهلاكا للوقت ويستخدم أقل من المواد التي قد تكون أكثر فائدة عندما يتم خلايا الفائدة محدودة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ترنسفكأيشن الخلية

  1. لوحة الخلايا في اليوم قبل ترنسفكأيشن، والطلاء أقل من الخلايا للالمناعي.
    1. لالمناعي: في 6 جيدا لوحة، ومعطف زلات غطاء زجاجي (1 لكل بئر) مع 0.02٪ الجيلاتين عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة، ويغسل مرة واحدة مع المتوسطة، ولكل بئر، لوحة 1 × 10 5 كلوة الجنين البشري 293T الخلايا في 2 مل كاملة النمو المتوسطة [وسائل الإعلام Dulbecco لتعديل النسر (DMEM)، بالإضافة إلى 10٪ FBS].
    2. لتدفق تحليلات لطخة cytometric والغربية: لوحة 1.2 × 10 5 خلايا 293T كلوة الجنين البشري / جيد في 2 مل متوسطة النمو الشامل في لوحة 6 جيدا (0.3 × 10 5 كلوة الجنين البشري 293T الخلايا في 0.5 مل كاملة النمو المتوسطة لكل بئر في لوحة 24 أيضا ).
  2. إعداد الحمض النووي لترنسفكأيشن وفقا لبروتوكول المصنع: Effectene (QIAGEN) يستخدم لالمناعي. يستخدم العابر LT1 (MIRUS) لتدفق تحليلات لطخة cytometric والغربية. يتم سرد كمية من الحمض النووي المستخدمة أدناه.
    24 لوحة جيدا (NG) لوحة 6 جيدا (NG)
    CFP ناقلات 10 50
    VN-N-AKAP LBC 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (كامل طول PDE4D3) 2.5، 5، 10، 20، 40، 80 100
    VC-N-PDE4D3 UCR1 (أ PDE4D3 N-محطة جزء يحتوي على نطاق UCR1) 100
    VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (أ PDE4D3 جزء C-محطة تحتوي على المجالات UCR2 والحفاز) 100
    ترنسفكأيشن باستخدام Effectene (6 أيضا):
    1. إضافة المبلغ المشار إليه من الحمض النووي البلازميد + 4 ميكرولتر محسن إلى 100 ميكرولتر العازلة EC، مزيج، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 5 ميكرولتر Effectene، مزيج، واحتضان لمدة 10 دقيقة فيدرجة حرارة الغرفة. إضافة الإفلات من الحكمة إلى الخلايا.
    ترنسفكأيشن باستخدام العابر LT1 (6-well/24-well):
    1. إضافة المبلغ المشار إليه من الحمض النووي البلازميد إلى 250 μl/50 ميكرولتر من غروب-MEM I المتوسطة المصل خالية في أنبوب العقيمة.
    2. إضافة العابر LT1 كاشف إلى خليط الحمض النووي المخفف وماصة بلطف لمزج. (العابر LT1 الكاشف: نسبة الحمض النووي هو 3 ميكرولتر من العابر LT1 كاشف لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي).
    3. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإضافة قطرة من الحكمة إلى الخلايا.

2. التحضير لخلية التدفق الخلوي، وصمة عار الغربية، والمناعي

  1. 24 ساعة ترنسفكأيشن آخر، تحقق مضان تحت المجهر epifluorescence قبل حصاد الخلايا.
  2. إعداد الخلايا لتحليل تدفق cytometric:
    1. غسل الخلايا مع 0.5 مل / 2 مل من الجليد الباردة PBS لوحات 24-well/6-well.
    2. فصل الخلايا باستخدام 50 ميكرولتر μl/250 0.05٪ التربسين.
    3. تحييد التربسين مع 200 ميكرولتر / 1 مل DMEM المتوسطة.
    4. بسllect 250 خلية ميكرولتر (لكل من 24 لوحة جيدا و6 أيضا) بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق، واستخدام الخلايا المتبقية (1 مل) للتحليل لطخة غربية.
    5. Resuspend الخلايا في 250 FACS العازلة ميكرولتر [PBS + 0.5٪ (W / V) BSA + 2 مم EDTA]، متجر على الجليد لتحليل تدفق cytometric. ويمكن أيضا أن تكون ثابتة في الخلايا 1٪ بارافورمالدهيد (في برنامج تلفزيوني) إذا سوف تحليل التدفق الخلوي لا يكون فوريا.
  3. إعداد خلية للتحليل لطخة غربية: نفذت بالتوازي مع إعداد خلية للتحليل التدفق الخلوي.
    1. غسل الخلايا مع 1X 2 مل الجليد الباردة PBS، ليز الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية [10 ملي العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.95، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 5 ملي EGTA، 1٪ تريتون X-100] .
    2. جمع الخلايا المحللة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في XG 21،000 في 4 درجات مئوية.
    3. قياس تركيز البروتين برادفورد فحص البروتين، وتحميل كميات متساوية من البروتين لكل حارة لSDS-PAGE، ونقل إلى النيتروسليلوز لimmunoblotting.
  4. إعداد الخلايا لالمناعي.
    1. شطف الخلايا 3X مع 2 مل PBS، إصلاح الخلايا في 1 مل من بارافورمالدهيد 3.7٪ (في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل 3X مع 2 مل برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    2. جبل تغطية زلة على شريحة زجاجية، وذلك باستخدام المتوسطة المتزايدة. ختم حواف ساترة باستخدام طلاء الأظافر إذا لزم الأمر.
    3. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية قبل الفحص.

3. التدفق الخلوي المناعي والمجهر

  1. يتم تنفيذ التدفق الخلوي باستخدام بيكمان كولتر سماوي ADP، ومجهزة 488 نانومتر، 405 نانومتر، و642 نانومتر ليزر الحالة الصلبة. ويستخدم برنامج قمة لاقتناء وتحليل.
    1. معايرة عداد الكريات تدفق باستخدام الخرز القياسية.
    2. مؤامرة مبعثر إلى الأمام (FSC) / Sideward مبعثر (SSC) على مقياس خطي لتبوب السكان الخلية الحية.
    3. مؤامرة FSC / الجهد العرض نبض لتبوب غير المجمعة السكان الخلية الحية.
    4. مؤامرة count/FL6 (CFP fluorescencه، 405 نانومتر) على نطاق وسجل لتبوب غير المجمعة إيجابية الخلايا CFP الحية.
    5. مؤامرة count/FL1 (YFP مضان، 488 نانومتر) على نطاق وسجل لشدة BiFC.
    6. تشغيل العينات سلبية YFP-CFP المزدوج، وضبط FSC، SSC، FL1 وFL6 صورة أنبوب المضاعف (PMT) الجهد لضبط عتبة لكل إشارة.
    7. تشغيل واحدة إيجابية (سواء YFP + + وCFP) عينات للمستقبل التعويض خارج الخط
    8. الحصول على ما لا يقل عن 10،000 الأحداث بوابات (غير مجمعة الحية CFP + الخلايا) للتحليل.
  2. يتم إجراء الفحص المجهري المناعي باستخدام زايس LSM 510 المجهر متحد البؤر ملاحظة: من المهم للحفاظ على جميع الإعدادات (مثل التكبير، والثقب، واكتساب كاشف، مكبر للصوت تعويض، حجم الإطار، سرعة المسح الضوئي والمسح الضوئي المتوسط، وقوة الليزر) متسقة بين عينات للمقارنة السليم لجميع البيانات.

4. تحليل البيانات (تنفيذها باستخدام برمجيات القمة)

  1. إعداد بروتوكول تحليل مماثلة لتلك التي لacquisitأيون مع تبوب المناسبة:
    بوابة 1 في FSC / SSC نقطة مؤامرة للخلايا الحية.
    بوابة 2 في FSC / عرض النبضة من بوابة 1 للخلايا الحية غير المجمعة.
    بوابة 3 في العد / CFP من بوابة 3 لCFP غير المجمعة + الخلايا الحية.
  2. تعويض YFP وإشارة CFP YFP باستخدام + + وCFP الخلايا إيجابية واحدة.
  3. إعادة تحديد خطوط وقف انتاج المواد الانشطارية للخلايا CFP / YFP إيجابية.
  4. تصدير YFP يعني كثافة مضان (MFI) من CFP + الخلايا إلى Excel للالتآمر البيانات.
  5. تطبيع YFP مؤسسة التمويل الأصغر إلى مستويات التعبير عن AKAP-LBC، PDE4D3، والسيطرة التحميل α-تويولين، على النحو الذي يحدده لطخة غربية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتنصهر AKAP-LBC وPDE4D3 بنيات (1B الشكل) إلى VN وشظايا VC، على التوالي. تفاعل AKAP-LBC وPDE4D3 النتائج في وظيفية YFP مضان (الشكل 1A). هنا نستخدم طريقة BiFC إلى خريطة مواقع AKAP-LBC ملزم في PDE4D3. منطقة الحفظ المنبع 1 (UCR1)، منطقة الحفظ المنبع 2 (UCR2) والمنطقة الحفاز (CAT) يتم حفظها بين PDE4 البروتينات الأسرة، بالتالي، طول كامل (FL)، UCR1 وUCR2 زائد القطة كانت تستخدم لفحص موقع ملزم من PDE4D3 لAKAP-LBC. التعبير عن VN-AKAP-LBC وVC-PDE4D3-شظايا في ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC هو وسيلة بسيطة وحساسة لدراسة التفاعل البروتين البروتين. هذا الأسلوب لا يمكن أن تستخدم لتحديد البروتين البروتين التفاعلات الجديدة، ومع ذلك، وأنها مريحة خاصة لتأكيد التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا ودراسة الخصائص الفنية؛ مثل توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين، ورسم خرائط لمواقع التفاعل البروتين البروتين، و للكشف عن جزيئات صغيرة / الببتيدات التي يمكن أن تعدل التفاعل البروتين البروتين. لأن VN VC وشظايا غير قابلة للفلوري، مضان الخلفية منخفضة، مما يساعد حساسية هذا الاختبا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر المختبر O'Bryan في UIC للتقييم التجريبي النقدي والمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 11SDG5230003 إلى مركز GKC والوطنية للنهوض بالحركة العلوم - مركز UIC للعلوم السريرية وبالحركة المنح UL1TR000050.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco&# 8217; s تعديل النسر &# 8217 ؛ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycin (قلم / بكتيريا) ، 100xInvitrogen15070-063
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Invitrogen16000-044
الأجسام المضادة المضادةللعلم SigmaM2 ، F1804
الأجسام المضادة المضادة ل HACovance16B12 ، MMS-101R
&# 945 ؛ -tubulinSigmaDM1A ، T9026
الأجسام المضادة ل GFPClontech632569
لوحات ثقافة الخلايا ، 6 آبار لزراعة الأنسجة المعالجةThermo Fisher Scientific130184
HEK 293T خلاياATCCCRL-11268
Maxiprep طقم تنقية البلازميد ، عالية السرعةQiagen12663
Dulbecco & # 8217 ؛ s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) ، معقم 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA ، 0.05٪ (وزن / حجم)Gibco25300
من البوليسترين مستديرة القاع لتلوين FACSBD Biosciences352052
ParaformaldehydeFisher ScientificS74337MF
إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان مع DAPIInvitrogenP-36931
Superfrost plus المجهر الشرائحفيشر Scientific12-550-15
Fisherfinest زجاج الغطاء الممتازفيشر Scientific12-548-5P
EQUIPMENT< / strong>
CO2< / sub> حاضنة مغلفة بالهواءNuAIR DH
التلقائي LSM510 METACarl Zeiss، Inc
وحدة الرحلان الكهربائي والنقلBiorad
Cyan ADP مقياس التدفقالخلوي بيكمان كولتر
أنابيب مجهر متحد البؤر التدفق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

Related Articles