مقالة منهجية

قياس النمو وحيوية التعبير الجيني للورم استهداف S. تيفوميوريم البكتيريا

DOI:

10.3791/50540

⸱

يوليو 6, 2013

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن S. تيفوميوريم المستعمرات البكتيرية المتزايد داخل الأورام. يغطي هذا الفيديو إعداد ورم الخلايا وزرع، وإعداد البكتيريا وحقن، والتصوير كله والحيوان التلألؤ، والاستئصال الورم، والبكتيرية العد مستعمرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن S. المستعمرات البكتيرية تيفوميوريم المتزايد داخل الأورام.

نحن ولدت الأورام طعم أجنبي نموذج في الفئران عن طريق الحقن تحت الجلد من المبيض خط الخلايا السرطانية البشرية، OVCAR-8 (NCI DCTD مستودع ورم، فريدريك، MD).

نحن تحولت سلالات موهنة من S. البكتيريا التيفية الفأرية (ELH430: SL1344 phoPQ-1) مع وسيفيراز أعرب جوهري (luxCDABE) البلازميد عن التصور 2. هذه السلالات استعمار تحديدا أورام في حين تبقى أساسا غير خبيثة إلى الماوس 1.

مرة واحدة تم تأسيسها الأورام قابلة للقياس، تم حقن البكتيريا عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل مع اختلاف الجرعة. الورم المترجمة، تم رصد بكتيريا التعبير الجيني في الوقت الحقيقي على مدار 60 ساعة باستخدامفي الجسم الحي نظام التصوير (IVIS). في كل نقطة زمنية، ويستأصل الأورام، المتجانس، ومطلي ل quantitate المستعمرات البكتيرية للارتباط مع بيانات التعبير الجيني.

معا، هذه البيانات تعطي مقياس كمي للنمو في الجسم الحي، وديناميات التعبير الجيني من البكتيريا المتزايد داخل الأورام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أحرز تقدم في البيولوجيا التركيبية بسرعة على مدى العقد الماضي، ويتم وضع الآن أن تؤثر المشاكل الهامة في مجال الطاقة والصحة. ومع ذلك، فقد تباطأ التوسع في الساحة السريرية من قبل مخاوف تتعلق بالسلامة وغياب وضع معايير لتصميم الدوائر الجينية في الجسم الحي. سوف تسريع التطبيقات الطبية عالية تأثير تتطلب استخدام أساليب تلك الواجهة مباشرة مع البنية التحتية الطبية، والدوائر الجينية التي تعمل خارج من إعداد مختبر للرقابة، والمضيفين الميكروبية آمنة وسريريا المقبولة.

وقد تم التحقيق في عدد من سلالات لعلاج السرطان نظرا لقدرتها على النمو بشكل تفضيلي في الأورام. وقد شملت هذه C. النوفية، كولاي، V. cholorae، B. الطويل ل، و س. تيفوميوريم 3-8. S. وقد ولدت تيفوميوريم أهمية خاصة لأنها أظهرت سلامة والتسامح في عدد من التجارب السريرية البشرية 9-12. هذه البكتريا عرضت في البداية لخلق تأثيرات مضادة للورم من خلال تحفيز الجهاز المناعي المضيف ونضوب المغذيات اللازمة لعملية التمثيل الغذائي الخلايا السرطانية. تم ادراج إنتاج البضائع العلاجية في وقت لاحق من خلال التعديلات الجينية. في حين أن هذه الدراسات تمثل تقدما هاما في استخدام البكتيريا لعلاجات الأورام، وقد اعتمدت غالبية الجهود القائمة على التعبير عن المستوى الذي ينتج عادة في إيصال جرعات عالية، والآثار بعيدا عن الهدف، وتطوير المقاومة المضيفة 13-16 .

الآن، قد البيولوجيا التركيبية إضافة إنتاج البضائع القابلة للبرمجة من خلال الاستفادة من الدوائر الجينية حسابيا التصميم التي يمكن أن تؤدي الاستشعار المتقدمة والتسليم 17-20. ويمكن تصميم هذه الدوائر لتكون بمثابة أنظمة التسليم التي تستشعر المحفزات ورم محددة والتنظيم الذاتي إنتاج البضائع حسب الضرورة. ومع ذلك، ودراسة وظيفة من هذه الدوائر في الجسم الحي وهكذا تم حتى الآن تحديا.

ve_content "> منذ البلازميدات هي إطار مشترك للدوائر الاصطناعية، ونحن تصف طريقة لوصف ديناميات التعبير الجيني القائم على البلازميد في الجسم الحي باستخدام نموذج الفأر. هذه الأساليب الاستفادة من الوقت الفاصل بين التصوير التلألؤ والقياس الكمي للbiodistribution. معا، توفر هذه النهج إطارا لدراسة الشبكات القائمة على البلازميد في الجسم الحي بالنسبة إلى التطبيقات السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلية

  1. خطوط الخلايا مرور باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية. في هذه التجربة، كنا OVCAR-8 خلايا (NCI DCTD مستودع ورم، فريدريك، MD). تنمو الخلايا إلى confluency الهدف من 80-100٪.
  2. احتضان الخلايا مع 5 مل التربسين لمدة 5 دقائق، ثم يضاف 5 مل RPMI المتوسطة + FBS لإبطال نشاط التربسين.
  3. خلايا الحصاد والاعتماد على عدادة الكريات. resuspend في الفينول DMEM الحمراء الخالية في تركيز الهدف من 5 × 10 7 خلية / مل، أو حوالي 200 ميكرولتر في القارورة.
  4. إضافة 15٪ انخفاض النمو عامل Matrigel دينار بحريني (العلوم البيولوجية) والحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الزرع.

2. زرع الورم

  1. تخدير 4 أسبوع أنثى NCR / نو الفئران القديمة باستخدام 3٪ isoflurane ووانتظر ما يقرب من 5 دقائق لضمان التخدير العميق. استخدام مرهم طبيب بيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  2. تحميل الخلايا (100 ميكرولتر لكل ورم) في 1 مل حقنة وإرفاق 27 1/ 2 إبرة قياس.
  3. لكل من موقعين حقن الجناح الخلفيتين الثنائية، ورفع الجلد بلطف مع ملقط لجعل خيمة وحقن الخلايا في القاعدة. والحرص على عدم التوغل عميقا جدا، وإنتاج الدم. استخدام ملاقط لإزالة بلطف حقنة دون ترشيش.
  4. رصد نمو الورم يوميا لمدة 10 - 20 يوما حتى يبلغ قطرها ورم من 2 - 4 مم وصلت.

3. البكتيريا التحضير

  1. بدء الثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا في 3 مل LB سائل الإعلام + الأمبيسلين من -80 الأسهم الفريزر C أو لوحة مبردة. في هذه التجربة، كنا S. تيفوميوريم سلالة ELH430 (SL1344 PhoPQ-أروى-).
  2. في الصباح، تمييع 1:100 الثقافة في LB تصفيتها وتنمو لOD600 0،4-0،6.
  3. تدور باستمرار وغسل 3 مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و resuspend في OD600 النهائي من 0.1 (حوالي 1 × 10 7 خلية / مل).

4. البكتيريا حقن

  1. تخدير الحيوان علىموقف د على جانبها مع الذيل لافتا نحو يدك المهيمنة. استخدام مرهم طبيب بيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  2. تمدد الوريد الذيل باستخدام الماء الدافئ أو مصباح الحرارة.
  3. تحميل بكتيريا (100 ميكرولتر في الماوس) في 1 مل حقنة وثني غيض فقط أقل من 90 درجة.
  4. محاذاة طرف الحقنة في الوريد مع الذيل، وتخترق على عمق ضحل (ينبغي أن يشعر أي مقاومة)، وحقن البكتيريا. مراقبة النزوح تدفق الدم لحقن ناجحة.

5. الماوس التصوير

  1. تخدير الحيوانات في غرفة تحريض ثم وضع كل الماوس على منصة التصوير. استخدام مرهم طبيب بيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. الحفاظ على تحديد المواقع بدقة لضمان النتائج الكمية بين نقاط الوقت.
  2. الحيوانات الصورة باستخدام الطيف نظام التصوير IVIS (الفرجار علوم الحياة). إذا التصوير أكثر من 1 الحيوان، مكان الحواجز ضوء بينهما لمنع انتقال illumination. ينبغي تصويرها الحيوانات أولا على الجانب البطني للتأكد توطين البكتيريا.
  3. الحيوانات صورة ظهريا باستخدام IVIS كل 2 ساعة لمدة التجربة (36 ساعة). توليد دورة الوقت لROI معين.

6. قياس Biodistribution البكتيرية

  1. الموت ببطء الحيوانات باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 ومكان على ظهر على حفاضات ماصة.
  2. تحويل الحيوان لفضح اثنين هند الجناح الأورام تحت الجلد. قطع أنسجة الجلد المحيطة لفصل وإزالة الأورام. عقد ورم مع ملاقط، وإزالة الجلد باستخدام حركة مقص عكس. عندما تم فصل الغالبية العظمى من الجلد، وإزالة الورم بالكامل باستخدام الملقط.
  3. وضع الأجهزة في أنابيب microcentrifuge سبق وزنه. منذ كتلة هذه الأنابيب يمكن أن تختلف بشكل ملحوظ من المهم مسبقا وزن لهم من أجل تحقيق النتائج الكمية.

7. قياس Biodistribution البكتيرية

  1. في كل مرة نقطة والمكوس وتزن الأورام.
  2. إضافة 500 ميكرولتر PBS + 15٪ الجلسرين والتجانس باستخدام مناديل-Tearor (BioSpec). شطف الخالط 3 مرات مع الإيثانول بين العينات.
  3. توليد التخفيفات التسلسلي ولوحة للبكتيريا العد مستعمرة. لوحة التخفيفات متعددة على استخدام لوحة واحدة لوحات ما قبل مقطوع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قادرون على توليد بيانات عن النمو في الجسم الحي، وديناميات التعبير الجيني للورم البكتيريا المستهدفة. ويلخص سير العمل الكلي في الشكل 1.

في المرحلة الأولى، ونحن حقن البكتيريا (الخضراء) وصورة للحيوان باستخدام IVIS لقياس التعبير الجيني مع التلألؤ (الازرق) كمراسلة.

ثم، في المرحلة الثانية، ونحن ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا الإجراء، ونحن قادرون على توليد الدورات الوقت لنمو وديناميات التعبير الجيني من البكتيريا استعمار الأورام. في حين أن هذه القياسات تتم بصورة روتينية في المختبر في الثقافة دفعي أو الأجهزة على microfluidics، فهي لأداء في الجسم الحي أكثر صعوبة بكثير.

وهناك العديد من التعديلات التي يمكن تطبيقها على هذه الأساليب. بينما استخدمنا-8 OVCAR خط الخلية لتوليد نماذج الماوس لدينا، عدد من خطوط الخلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر H. فليمينغ لقراءة نقدية وتحرير للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل Misrock ما بعد الدكتوراه زمالة (TD) وNDSEG زمالة دراسات عليا (AP). البنك المركزي السويسري هو محقق HHMI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل حقنةBD Biosciences309602
3/10 سم مكعب حقنة الأنسولينBD Biosciences309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X) ، سائل ، مع L-glutamineInvitrogen11875-119
AmpicillinSigma AldrichA0166-5G
LB Agar مرقسيجما ألدريتشL2897
مرق لوريا بيرتانيBD Biosciences244610

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511(2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IVIS

مقالات ذات صلة