Method Article

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

DOI:

10.3791/50541

⸱

August 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف الكمي للتفاعلات البروتين ضروري عمليا في أي مجال من مجالات علوم الحياة، وخاصة اكتشاف المخدرات. معظم الطرق المتاحة حاليا من K D تقرير تتطلب الوصول إلى تنقية البروتين من الفائدة، الجيل الذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ومكلفة. لقد قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح لتحديد تقارب ملزمة من قبل thermophoresis الميكروسكيل (MST) من دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. ينطوي على طريقة overexpression من البروتين GFP تنصهر وتحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف. تطبيق طريقة لSTAT3-GFP أعرب عابر في HEK293 الخلايا يسمح لتحديد لأول مرة تقارب من عامل النسخ مدروسة لأليغنوكليوتيد] مع سلاسل مختلفة. بروتوكول واضح وصريح ويمكن أن يكون لها مجموعة متنوعة من التطبيقات لدراسة التفاعلات بين البروتينات مع جزيئات صغيرة، الببتيدات، DNA، RNA، وProteins.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف الكمي للتقارب من التفاعلات بين الجزيئات مهم في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية. ملزمة التفكك المستمر (K D) أمر ضروري ليس فقط في اكتشاف المخدرات وإنما هو أيضا معلمة هامة في توصيف أي تفاعل ثنائي في أي نظام بيولوجي. أساليب الكيمياء الحيوية المستخدمة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات، مثل مناعي والخميرة شاشات هجين اثنين، لم يكن لاعلامنا على كيفية ضيق هي تلك التفاعلات، في حين يحدد ما إذا كان هذا التقارب مجمع خاص موجود تحت ظروف معينة في الجسم الحي. في عملية اكتشاف المخدرات، والتنمية مقايسة ملزمة هي واحدة من اللازم وغالبا من أشد الخطوات تستغرق وقتا طويلا. الأساليب الأكثر استخداما من K D ع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلايا المحللة

ويهدف هذا البروتوكول لخلايا ملتصقة تعرب عن أي بروتين GFP تنصهر. مطلوب عدد الخلايا يمكن أن تختلف من منخفضة تصل إلى 10 6 إلى ما يصل إلى 20 × 10 6 خلايا، اعتمادا على مستوى التعبير البروتين. على سبيل المثال، تم إعداد المحللة من كلوة الجنين البشري خلايا overexpressing GFP-STAT3 عن طريق علاج الخلايا المزروعة في 10 T75 القوارير إلى قرب 70٪ confluency مع 1 مل العازلة تحلل. ومع ذلك، كان هذا المحللة إلى أن تضعف 150 أضعاف لتوفير المستوى الأمثل من مضان لتجربة MST. بروتوكول تحلل الخلية يعتمد بقوة على خصائص وتوطين الخلايا من البر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس تقارب من البروتين STAT3 غير فسفرته ملزمة لأليغنوكليوتيد].

واستخدمت HEK293 الخلايا معربا عن GFP STAT3-كمصدر للfluorescently المسمى STAT3 لفحص الحمض النووي ملزم. أعدت لست] الخلية باستخدام RIPA العازلة (20X10 6 خلية / مل). للدراسات ملزم، وتضعف لست] 150X مع MST العازلة الحمض النووي الملزمة لتوفير المستوى الأمثل من البروتين الفلوري في رد فعل ملزم (حوالي 20 نانومتر). وقد استخدمت الخلايا HE.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعبير البروتين وتنقية هو خطوة شاقة ومكلفة، والتي، مع ذلك، من الضروري لتحديد التفاعلات 'K D بواسطة الأسلوب الأكثر المستخدمة حاليا. تطبيق يسمح MST تجنب تنقية البروتين وبالتالي تبسيط بشكل كبير وتسريع توصيف الكمي من التفاعلات. أنه يقدم مزايا كبيرة خاصة في حالة يصعب التعبير وتنقية البروتينات، مثل البروتينات الغشاء وعوامل النسخ.

فإن القيود الرئيسية ومتطلبات MST هو القدرة على التعبير عن بروتين باعتبارها ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. محتوى هذا المنشور لا تعكس بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الصحة والخدمات البشرية، ولا ذكر الأسماء التجارية، المنتجات التجارية، أو المنظمات لا تعني مصادقة من قبل الحكومة الأمريكية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، مركز لأبحاث السرطان؛ اتفاقية الأبحاث التعاونية بين لجنة التحقيق الوطنية وCalidris التداوي؛ جمعية السرطان الأمريكية منحة IRG 97-152-17 إلى OT؛ والأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان، المعاهد الوطنية للصحة، تحت HHSN26120080001E العقد.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RIPA bufferMillipore20-188تعمل المخازن المؤقتة للشركة المصنعة الأخرى أيضا
كوكتيل مثبطات البروتيازSigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 CapillaryTray NanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 القياسية المعالجة الشعيرات الدمويةNanoTemper Technologies GmbHK002
NT برنامج التحكمNanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT برنامج التحليلNanoTemper Technologies GmbH1.4.27
جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولةEppendorf5417Rأجهزة طرد مركزي مبردة أخرى توفر
أنبوب Protein LoBind 0.5 ملإيبندورف22431064

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microscale ThermophoresisBinding Affinity DeterminationProtein Purification free MethodGFP fused ProteinCell Lysate AnalysisLigand Dilution SeriesFluorescence MeasurementThermophoresis ExperimentSTAT3 GFP TransfectionOligonucleotide Binding Assay

Related Articles