يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من تحت الجلد والخلايا الكبدية داخل الكبد سرطان Xenografts الإنسان في الفئران العوز المناعي

36.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50544

⸱

سبتمبر 25, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Department of Pathology, University Health Network, 3Division of General Surgery, University Health Network

في هذه المقالة

ملخص

xenografts الورم في الفئران العوز المناعي البشري هي أدوات قيمة لدراسة بيولوجيا السرطان. موصوفة بروتوكولات محددة لتوليد xenografts تحت الجلد وداخل الكبد من خلايا سرطان الكبد الإنسان أو شظايا الورم. ويرد تجديد الكبد الناجم عن استئصال الكبد الجزئي في الفئران المتلقية كاستراتيجية لتسهيل engraftment داخل الكبد.

الملخص

في الجسم الحي نماذج تجريبية من سرطان الكبد (سرطان الكبد) أن ألخص هذا المرض الإنسان توفير منصة قيمة للبحث في الفيزيولوجيا المرضية المرض وقبل السريرية لتقييم علاجات جديدة. نقدم مجموعة متنوعة من الأساليب لتوليد تحت الجلد أو مثلي xenografts سرطان الكبد في الفئران العوز المناعي البشري التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية. مع التركيز على استخدام أنسجة الورم الرئيسي من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الجراحي كنقطة انطلاق، ونحن تصف إعداد تعليق خلية الورم أو شظايا لxenografting. وصفنا تقنيات محددة لطعم أجنبي هذه الأنسجة ط) تحت الجلد، أو ب) intrahepatically، إما عن طريق زرع الخلايا السرطانية مباشرة أو شظايا في الكبد، أو بشكل غير مباشر عن طريق حقن الخلايا في الطحال الماوس. نحن أيضا وصف استخدام الاستئصال الجزئي للكبد الفأر الأم في وقت xenografting كاستراتيجية لإحداث حالة من التجديد الكبد النشط في الماوس المتلقي التي قد تسهل engraftment داخل الكبد من الخلايا السرطانية البشرية الأولية. ويوضح النتائج المتوقعة من هذه التقنيات. وقد تم التحقق من صحة البروتوكولات وصفها باستخدام الإنسان الأساسية HCC العينات وxenografts، التي تؤدي عادة أقل بقوة من خطوط الخلايا البشرية سرطان الكبد الراسخة التي يتم استخدامها على نطاق واسع في كثير من الأحيان واستشهد في الأدب. في المقارنة مع خطوط الخلايا، ونحن نناقش العوامل التي يمكن أن تسهم في فرصة منخفضة نسبيا من سرطان الكبد الأولية في engraftment نماذج زرع الأعضاء والتعليق على القضايا الفنية التي قد تؤثر على حركية النمو طعم أجنبي. نحن أيضا تشير الأساليب التي ينبغي تطبيقها لضمان الحصول على xenografts تشبه بدقة أنسجة سرطان الكبد الأم.

المقدمة

سرطان الكبد (سرطان الكبد) هو خامس أكثر أنواع السرطان شيوعا في جميع أنحاء العالم والسبب الأكثر تزايدا سريعا للوفاة بالسرطان في أمريكا الشمالية. عامل الخطر الأكثر انتشارا لسرطان الكبد تليف الكبد هو، والتي تحدث بشكل متكرر نتيجة لالتهاب الكبد الفيروسي المزمن، إساءة استخدام الكحول، وأمراض المناعة الذاتية، أو اضطرابات التمثيل الغذائي الوراثية 1.

على الرغم من عبء المرض الثقيل الذي تفرضه على السكان في جميع أنحاء العالم HCC، يتم فهم الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد ضعيفا نسبيا بالمقارنة مع غيرها من أنواع السرطان الشائعة مثل القولون والمستقيم، وسرطان الثدي، أو سرطان البروستاتا. على سبيل المثال، لا تزال الأحداث الجزيئية والخلوية محددة يقود إلى تكون الأورام تكون محددة بوضوح 2. مثل معظم سرطانات الظهارية صلبة أخرى، كشفت النهج الجيني عدم التجانس في الانحرافات المرتبطة سرطان الكبد 3. وقد كشفت عدد من الدراسات النشاط المختلين من مجموعة متنوعة من مسارات إشارات تشارك في تكاثر الخلايا، سورvival، والتمايز، والأوعية الدموية 4. بالإضافة إلى ذلك، يبقى دور الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان الكبد البيولوجيا المرضية إلى توضيح 5.

مع فهم محدود من سرطان الكبد الفيزيولوجيا المرضية، ظلت أرممنتريوم علاجات فعالة للسرطان الكبد أيضا محدودة نسبيا. المرضى في مرحلة مبكرة مع أورام الكبد تقتصر على المرشحين للعلاج العلاجية باستخدام الاجتثاث الورم أو استئصال الجراحي، على الرغم من تكرار أمر شائع. للمرضى الذين يعانون من مرض أكثر تقدما، والعلاج الكيميائي والإشعاع ذات فعالية محدودة وتستخدم في المقام الأول لمكافحة الأمراض بقصد الملطفة 6.

جودة عالية في نماذج تجريبية المجراة من سرطان الكبد الإنسان وبالتالي توفير منصة قيمة لحاجة الكثير من الأبحاث الأساسية في الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد الإنسان، وكذلك لتقييم النهج العلاجية الرواية. بالمقارنة مع استخدام خطوط الخلايا أو النماذج الماوس محددة للغاية، xenografts من الحزب الثوري المؤسسيظهرت أورام الإنسان ماري في الفئران العوز المناعي كأدوات قيمة لمثل هذه الدراسات لأنها قادرة على التلخيص الأمراض التي تصيب البشر مع الدقة العالية أثناء التقاط أيضا عدم التجانس التي موجود داخل وبين مختلف المرضى 7،8. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير مجموعة متنوعة من الأساليب لإنشاء xenografts سرطان الكبد في الفئران العوز المناعي البشري. في حين أن الغالبية العظمى من الدراسات المنشورة التي تنطوي على xenografts سرطان الكبد وصف استخدام خطوط الخلايا البشرية سرطان الكبد راسخة لهذا الغرض، فقد ركزنا على تحسين المقايسات جهدنا لتوليد xenografts من عينات سرطان الكبد الأولية التي تم الحصول عليها على الفور بعد استئصال الجراحي من المرضى.

قد يكون مطلوبا تقنيات xenografting مختلفة للتطبيقات البحثية المختلفة. على سبيل المثال، يتم إنشاء xenografts تحت الجلد الناتجة عن شظايا الورم بسرعة، يمكن رصدها بسهولة، وربما يكون من الأنسب للإدارة المحلية من علاجات جديدة مع مريحةرصد استجابة الورم. قد يكون xenografts داخل الكبد أكثر أهمية للدراسات المتعلقة بدور المكروية الكبدي سرطان الكبد في علم الأحياء. Xenografts المتولدة من تعليق خلية الورم ضرورية لتحديد وتوصيف مجموعات فرعية الخلايا السرطانية أو الشروع في التجارب التي تتطلب التلاعب في المختبر من خلايا الورم قبل زرع الأعضاء. وبالتالي قمنا بتطوير والتحقق من صحة البروتوكولات التالية لإنشاء تحت الجلد أو داخل الكبد xenografts من الايقاف الخلية أو شظايا الورم المشتقة من عينات سرطان الكبد الإنسان الأساسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ويقدم لمحة التخطيطي للبروتوكول في الشكل 1.

1. تجهيز العينات HCC الإنسان

الحصول على عينات سرطان الكبد الإنسان الأولية مع موافقة المريض الخطية وبموافقة من مجلس أخلاقيات البحوث المؤسسية. وقد أجريت هذه البروتوكولات بها في مؤسستنا مع موافقة من مجلس أخلاقيات البحوث الصحية شبكة جامعة في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية، والدولية من أجل رفاهية الإنسان.

جمع العينات HCC جديدة في أقرب وقت ممكن بعد إجراء العمليات الجراحية تم أخذ عينات مرة واحدة مناسبة لأغراض سريرية. من الناحية المثالية ينبغي أن تأخذ هذا المكان في غضون 30 دقيقة بعد إزالة الأنسجة من المريض. كما هو موضح في الشكل 2، وشمل عينة من 1 سم على الأقل 3 تم الحصول عليها من محيط الورم هو الأمثل، والجزء المركزي من الورم قد يكون نخرية.ويفضل الأورام التي لم تتلق أي علاج قبل استئصال مثل الإشعاع، والعلاج الكيميائي، أو الاجتثاث من أجل تعظيم فرصة أن الخلايا السرطانية هي قابلة للحياة. التعامل مع الأنسجة البشرية الأساسية وفقا للبروتوكولات الحماية الشخصية القياسية للمواد biohazardous. أداء جميع التلاعبات مختبر أنسجة الورم والاستعدادات خلية في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية باستخدام تقنيات العقيم.

  1. وضع عينة HCC جديدة في 10-25 مل معدلة F12 النسر متوسطة / هام 'ق Dulbecco والمصل خالية في 4 درجات مئوية، ونقل على الجليد إلى المختبر لمعالجة فورية وإعداد شظايا الأنسجة و / أو خلايا لxenografting في الفئران.
  2. باستخدام ملقط معقم، ضع عينة الورم في 100 مم × 20 مم طبق بتري أو غيرها من مناسبة سطح العمل العقيمة. تقسيم عينة الورم إلى أجزاء من حوالي 2-3 مم 3 باستخدام شفرة المشرط الجراحي NO.10. عند هذه النقطة، والنظر في الأداة الإضافية تجميد أو التلاعب في نتائج الفورمالين قلى بعد شظايا الورم لتجارب أخرى أو يحلل كما هو مطلوب.
  3. لxenografting من شظايا الورم، ضع بعض من شظايا سرطان الكبد في واحدة أو أكثر أنابيب microcentrifuge تحتوي على ما يكفي للسماح Matrigel شظايا بالبقاء مغمورة. إبقاء هذه الأنابيب على الجليد.
  4. لإعداد تعليق خلية الورم، واستخدام شفرة المشرط الجراحي لتخطر على أنسجة سرطان الكبد المتبقية قدر الإمكان وتخلط مع 5-10 مل من DMEM-F12 في أنبوب 50 مل المخروطية اعتمادا على حجم الأنسجة المفروم.
  5. إضافة نوع كولاجيناز الرابع وdispase الثاني بتركيزات النهائي من 200 وحدة / مل و 0.8 وحدة / مل على التوالي. ماصة الخليط صعودا وهبوطا جيدا باستخدام ماصة 25 مل.
  6. ختم الأنبوب واحتضان الخليط من الخطوة 1.6 عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة تبعا ليونة من أنسجة الورم. ماصة الخليط صعودا وهبوطا عدة مرات كل 10 دقيقة لتقييم التقدم المحرز في عملية الهضم الأنزيمية.
  7. بعد ديGESTION كاملة، وتمرير الحل الورم من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون. الهريس بلطف الأنسجة المتبقية على مصفاة الخلية باستخدام ماصة 25 مل تلميح لتمكين أكبر عدد ممكن من الخلايا السرطانية بالمرور. جمع تعليق خلية المتوترة في أنبوب مخروطي 15 مل.
  8. الطرد المركزي تعليق خلية الورم في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. صب بلطف طاف. اعتمادا على حجم بيليه، إضافة 2-5 مل من الجليد الباردة 1X خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة وبلطف ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend بيليه. الحفاظ على الجليد لمدة 5 دقائق.
  10. إضافة DMEM-F12 إلى وحدة تخزين ما مجموعه 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتغسل العازلة تحلل RBC.
  11. صب بلطف طاف و resuspend الحرة RBC بيليه الخلايا السرطانية في DMEM-F12.
  12. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام الاستبعاد التريبان الأزرق إما يدويا أو مع خلية مكافحة الآلي.
  13. مأخوذة الطرد المركزي الخلايا السرطانية التي تحتوي على numbe المطلوبص من الخلايا للحقن كما هو موضح أعلاه، resuspend الكرية الخلية مما أدى إلى 30 ميكرولتر من الجليد الباردة Matrigel، ومتجر على الجليد.

اختياري: بعد الخطوة 1.11، ونحن بشكل روتيني CD45 + تستنفد خلايا الإنسان (الكريات البيض) من الخلية تعليق الورم الأكبر و / أو تنقية مجموعات فرعية من الخلايا السرطانية باستخدام التدفق الخلوي أو الخرز immunomagnetic. بروتوكولات مفصلة عن هذه التقنيات موصوفة بشكل جيد من قبل الشركات المصنعة للأجسام ذات الصلة، والخرز، وأجهزة قياس التدفق الخلوي.

ملاحظة: وصف بروتوكول أعلاه يمكن أن تستخدم أيضا لمعالجة ورم xenografts الإنسان تحصد من الفئران من أجل أداء زرع المسلسل، واستبدال الأنسجة طعم أجنبي للأنسجة سرطان الكبد الإنسان الأساسي في الخطوة 1.1. في هذه الحالة، بعد الخطوة 1.11، ونحن تستنزف بشكل روتيني تسلل خلايا الفئران من تعليق خلية باستخدام الأجسام المضادة ضد المستضد الماوس التوافق النسيجي H2K.

2.Xenografting

إجراء كافة الإجراءات الحيوانية في الامتثال للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية. وقد تم الانتهاء من الإجراءات الموضحة في هذه الوثيقة تحت محددة بروتوكول استخدام الحيوان التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان شبكة الصحة جامعة وفقا والامتثال لجميع الجهات ذات العلاقة التنظيمية والمؤسسية واللوائح والمبادئ التوجيهية.

معدات للتسليم من وكلاء مخدر متقلبة الاستنشاق للحيوانات الصغيرة ينبغي أن تستخدم وفقا لإجراءات التشغيل الموحدة للمنشأة الحيوان ومعهد البحوث. تنفيذ جميع العمليات الجراحية باستخدام تقنية العقيم وأدوات معقمة في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية. استخدام غير البدناء السكري نقص المناعة الشديد مجتمعة (NOD / SCID) أو NOD / SCID / انترلوكين 2 مستقبلات غاما سلسلة فارغة (مجموعة موردي المواد النووية) سلالات من الفئران من كلا الجنسين في 6-8 أسابيع من العمر (مختبر جاكسون، بار هاربور، ME) 9،10. هؤلاءيجب أن يضم الفئران وصيانتها في منشأة قادرة على توفير ظروف مناسبة خالية من مسببات الأمراض للحيوانات العوز المناعي.

إعداد الفئران لإجراء عملية جراحية في غرفة توريد 5٪ (ت / ت) استنشاق isoflurane وفي 1 لتر / دقيقة من الأوكسجين. الحفاظ على التخدير حتى يكون هناك فقدان منعكس القرنية وأخمص القدمين في الحيوان (ق). لxenografting تحت الجلد، ويحلق واحد أو أكثر من مجالات صغيرة على ظهر الحيوان (ق) وتطهير الجلد مع الايثانول 70٪. لxenografting داخل الكبد، يحلق الصدر والبطن بطني من الحيوان (ق) من الإبطين وصولا الى المنطقة الأربية وتطهير الجلد مع الايثانول 70٪.

2.1 زرع تحت الجلد من شظايا ورم

  1. ضع الماوس تخدير عرضة، والحفاظ على التخدير الاستنشاق isoflurane و(2٪ (ت / ت) في 1 لتر / دقيقة O 2) مع لسان حال. تطبيق المسيل للدموع جل لحماية العينين الحيوان من الإصابات.
  2. تعقيم المنطقة الظهرية حلق (s) مع بتدينفرك الجراحية تليها الايثانول 70٪ وأخيرا مع محلول البوفيدون اليود.
  3. جعل 5 مم شق الجلد باستخدام مقص حاد العقيمة.
  4. إدراج مقص حادة مغلق برفق في الفضاء تحت الجلد وتنتشر بلطف لتطوير جيب كبيرة بما يكفي لاستيعاب جزء الورم.
  5. إدراج جزء الورم أعدت في الخطوة 1.3 في جيب تحت الجلد باستخدام ملقط غرامة معقمة.
  6. إغلاق شق الجلد باستخدام الخيوط الجراحية أو مقاطع.
  7. توفير الرعاية بعد العملية الجراحية لالماوس كما هو موضح أدناه.

2.2 الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية

  1. إعداد الحيوان كما هو موضح في الخطوات 2.1.1 و2.1.2.
  2. تحميل تعليق الخلايا السرطانية في Matrigel أعدت في الخطوة 1.13 في حقنة الأنسولين مع 29 G 1/2 في الإبرة.
  3. ادخال الإبرة في الفضاء تحت الجلد وتفريغ محتويات الحقنة. تتقدم الإبرة عدة مليمترات على طول الطائرة تحت الجلد بعيدا الابأوم الموقع ثقب الجلد يمنع تسرب تعليق الخلية السرطانية من موقع الوخز على سحب الإبرة.
  4. توفير الرعاية بعد العملية الجراحية لالماوس كما هو موضح أدناه.

2.3 زرع داخل الكبد من شظايا ورم

  1. باستخدام 27 G 1/2 في إبرة على حقنة 1 مل، 350 ميكرولتر من إدارة معقمة طبيعية تحت الجلد محلول ملحي في ظهر الرقبة تخدير الحيوان للتعويض عن الخسائر السوائل أثناء العملية. لتسكين وإدارة 350 ميكرولتر من العقيمة المالحة العادية التي تحتوي على البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) تحت الجلد على الجناح الحيوان، وذلك باستخدام إبرة 1/2-in 27 G على حقنة 1 مل.
  2. ضع الماوس مستلق على وسادة قبل ساخنة مع الأنف والفم وضعه داخل المعبرة لتقديم الصيانة التخدير الاستنشاق isoflurane و(2٪ (ت / ت) في 1 لتر / دقيقة O 2).
  3. تمديد أطرافه وتأمينها مع الشريط على سطح التشغيل لتحسين التعرض للالبطن بطني والصدر.
  4. تنفيذ الإجراء تحت مصباح المكبرة لتحسين التصور.
  5. تعقيم الجلد حلق على البطن بطني والصدر مع بتدين فرك الجراحية تليها الايثانول 70٪ وأخيرا مع محلول البوفيدون اليود.
  6. باستخدام مقص حاد العقيمة، وجعل عرضية الثنائية تحت الضلع شق الجلد وتقسيم طبقات العضلات لدخول التجويف البريتوني للسماح التعرض الكافي للكبد كامل.
  7. وضع غرزة في الجلد فوق الناتئ الرهابي وثبته لسان حال بشريط من أجل السماح التعرض أفضل من الكبد والهياكل المحيطة بها.
  8. استخدام اثنين من تطبيقها القطن ذات الرؤوس المجاورة والخلفية إلى الكبد لتحقيق الاستقرار فيه.
  9. إجراء شق 3 ملم في الطول والعمق على سطح الكبد باستخدام مشرط معقم رقم 10 شفرة.
  10. تطبق على الفور Surgicel وضغط لطيف على موقع شق لتحقيق الارقاء، وإزالة بعد 60-90 ثانيةوالمضي قدما الا اذا كان قد تم تحقيق الإرقاء كاملة.
  11. وضع جزء خطوة الورم 1.3 في شق الكبد مع ملقط غرامة معقمة أو مع إبرة G 18.
  12. تطبيق قطعة صغيرة من خلال شق Surgicel الكبد لمنع تشريد جزء الورم وضمان استمرار الارقاء.
  13. إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع.
  14. توفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه

2.4 زرع الخلايا السرطانية داخل الكبد عبر الحقن المباشر في الكبد

  1. إعداد الماوس كما هو موضح في خطوات 2.3.1 إلى 2.3.7 أعلاه.
  2. تحميل تعليق الخلية السرطانية (المعد في الخطوة 1.13) في حقنة الانسولين باستخدام 29 G 1/2 في الإبرة.
  3. مع استقرار الكبد باستخدام قضيب من القطن طرف، إدراج حقنة الأنسولين الإبرة في الكبد ودفع غيض بضعة ملليمترات وراء موقع الوخز على طول الطائرة تحت المحفظة.
  4. الوفاء بلطف محتويات حقنة ورالدجاجة إزالة الإبرة من الكبد.
  5. المكان Surgicel على موقع البزل وتطبيق ضغط لطيف مع قضيب من القطن ذات الرؤوس لمنع التسرب من تعليق خلية الورم وتحقيق الإرقاء كاملة.
  6. إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع وتوفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه.

2.5 Xenografting داخل الكبد من الخلايا السرطانية عن طريق الحقن في الطحال

  1. إعداد الماوس كما هو موضح في الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.5 أعلاه.
  2. باستخدام مقص حاد العقيمة، وجعل ترك 1 سم تحت الضلع شق للدخول في التجويف البريتوني.
  3. استخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس لتعكس المعدة cranially والجانب الأيمن الحيوان من أجل فضح الطحال.
  4. من خلال التعامل مع الأنسجة الدهنية المحيطة بها مع ملقط معقم ارضحي غرامة، وتقديم الطحال في شق ووضع قضيب من القطن ذات الرؤوس وراء الطحال لتحقيق الاستقرار فيه.
  5. باستخدام 5-0 خياطة الحرير، ومكانعقدة فضفاضة مرتبطة مسبقا حول الطحال فوق القطب السفلي.
  6. تحميل تعليق الخلية السرطانية (المعد في الخطوة 1.13) في حقنة الانسولين باستخدام 29 G 1/2 في الإبرة.
  7. إدراج الأنسولين حقنة الإبرة في القطب السفلي من الطحال ودفع من الماضي من مستوى عقدة فضفاضة مرتبطة مسبقا.
  8. الوفاء ببطء محتويات حقنة، وإزالة الإبرة من الطحال، وتشديد عقدة لمنع أي تسرب من تعليق خلية الورم حقن.
  9. استبدال الطحال في التجويف البريتوني.
  10. إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع وتوفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه.

2.6 استئصال الكبد الجزئي لتسهيل داخل الكبد Engraftment من نسيج الورم الإنسان

  1. إعداد الماوس كما هو موضح في الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.7.
  2. مع مقص حاد العقيمة، تقسيم الرباط المنجلي تعلق على الفص وسيطة من الكبد.
  3. باستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس، وحشدالفص الأيسر من الكبد وموقف عقدة فضفاضة تعادل 5-0 قبل من الحرير خياطة حول الفص الأيسر. دفع عقدة فضفاضة في أقرب وقت ممكن من أجل عنيق-bilio الأوعية الدموية في الفص الأيسر وتشديد عقدة.
  4. استئصال الفص الأيسر البعيدة إلى ربطة باستخدام مقص العقيمة، وترك جذع صغير لمنع انزلاق عقدة ونزيف اللاحقة.
  5. باستخدام تقنية مماثلة، ligate ويقطع غالبية الفص وسيطة من الكبد، وتجنب المرارة.
  6. استخدام Surgicel وضغط لطيف مع قضيب من القطن ذات الرؤوس على طول أسطح قطع لحمة الكبد لتحقيق الإرقاء كاملة.
  7. لxenografting داخل الكبد من جزء أو ورم الخلايا السرطانية، والمضي قدما مع خطوات 2.3.8 إلى 2.3.11 أو 2.4.2 إلى 2.4.5 كما هو موضح أعلاه.
  8. لxenografting داخل الكبد من الخلايا السرطانية عن طريق الحقن الطحال، والاستفادة من تطبيقها القطن ذات الرؤوس لتعكس بلطف المعدة cranially والجانب الأيمن الحيوان، exposiنانوغرام الطحال. المضي قدما في خطوات 2.5.4 إلى 2.5.9 كما هو موضح أعلاه.
  9. إغلاق شق مع الغرز أو مقاطع وتوفير الرعاية بعد العملية الجراحية كما هو موضح أدناه.

2.7 رعاية ما بعد الجراحة

  1. إزالة الماوس من التخدير سان حال الاستنشاق.
  2. ضع الماوس في قفص تحت مصباح الحرارة لمدة 20 دقيقة تقريبا حتى تعافى من التخدير وحشد بالكامل.
  3. تكرار الجرعة كل 8-12 ساعة البوبرينورفين خلال 2-3 أيام بعد العملية الجراحية الأولى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 3 مظهر نموذجي من تحت الجلد طعم أجنبي HCC الإنسان وظهور الأنسجة المقابلة للورم. تطوير ونمو xenografts تحت الجلد يمكن رصدها بسهولة عن طريق الفحص اليومي من الفئران المتلقية. الفاصل الزمني بين xenografting وتطوير ورم قد تختلف اختلافا كبيرا تبعا لنوع من الأنسجة (الورم جزء مقابل تعليق خلية)، ومصدر من الأنسجة (العينة الأولية المريض، طعم أجنبي passaged، أو خط الخلية)، وكمية من النسيج المزروع ( عدد الخلايا أو حجم الورم جزء). على سبيل المثال، قد xenografts لا بأس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفناها مجموعة متنوعة من التقنيات لإقامة تحت الجلد وداخل الكبد xenografts سرطان الكبد في الفئران العوز المناعي البشري التي يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية والمقايسات. في حين xenografts تحت الجلد وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة مختلف جوانب سرطان الكبد البيولوجيا، ونادرا ما وصفه xenografts داخل الكبد في الأدب. وعلاوة على ذلك، فإن غالبية الدراسات التي تصف استخدام xenografts لقد ولدت هذه من خطوط الخلايا راسخة. بالنظر إلى القيود المفروضة على خطوط الخلايا السرطانية ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة المرحلة 1 جائزة الطبيب-ساينتست (AG) وغرانت التشغيل من جمعية أبحاث السرطان (AG). المؤلفون ممتنون للدكتور جون ديك لدعمه لهذا المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco&# 8217; ق وزارة الدفاع. النسر المتوسط / هام &# 8217; s F12 50/50 Mix x1 (DMEM-F12) WISENT Bioproducts319-075-CL
كولاجيناز من النوع الرابعسيجما ألدريتشC5138
Dispase II تقنيات الخلايا الجذعية7923
ماتريكل ماتريكسبيكتون-ديكنسون للعلومالبيولوجية 354234
10٪ محلول فورمالينمخزن سيجما ألدريتشHT501128
0.9٪ محلول ملحي محلول (NaCl) ، معقمالبيت العلامة التجارية1011-L8001
مقشر جراحي للبيتادينبوردو فارماNPN 00158313
بوبرينورفين (تيميجيسيك) NR 0.3 مجم / ملريكيت بينكيزر
إيزوفلوران USP ، 99.9٪ ، مخدر استنشاقشركاء المستحضرات الصيدلانية في كنداM60302
Tear-Gel Novartis Pharmaceuticals
مركب القسم المجمد VWR95057-838
Cryomold ، Tissue -Tek Sakura Finetek4566
Precision Glide Needle 18G 1 &# 189 ؛ Becton-Dickinson Biosciences305196
Precision Glide Needle 27G &# 189; Becton-Dickinson Biosciences305109
حقنة الأنسولين ، 3/10 سم مكعب U-100 ، 29G & # 189 ؛ بيكتون ديكنسون بايوسينسز309301
الشفرة الجراحية رقم 10شركة شفرة السلامة الريشة08-916-5A
# 5-0 خياطة جراحية من الحرير الناعم ، 3/8 "إبرة نقطة تفتق SynetureVS-880
شريط جراحي Transpore3M الرعاية الصحية1577-1
قضيب قطن Medpro018-425
Surgicel ، السليلوز المؤكسد المتجددEthicon1951
مصفاة الخلية 100 & # 956 ؛ م نايلونBecton-Dickinson Biosciences352360
إضاءة التكبير مع قاعدة متنقلةBenson Medical Industries Inc.الموديل: RLM-CLT-120V
Petridish معقم 100x20 مم ملقط الأنسجة Sarstedt821474
، أسنان 1x2 ، 4-1 / 2 "AlmedicA10-302
ملقط خلع الملابس Adson 4-3 / 4" AlmedicA10-220
ملقط تضميد العين ، مسنن ، مستقيم ، 4 "AlmedicA19-560
ملقط مرقئ هارتمان ، منحني ، 3-1 / 2 "مقص قزحية AlmedicA12-142
، منحني ، 4-1 / 4" مقصقزحية AlmedicA8-690
، مستقيم ، 4-1 / 2 "AlmedicA8-684
Olsen-Hegan سائق إبرة ، 5-1 / 2" AlmedicA17-228

المراجع

  1. El-Serag, H. B. Hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).
  2. Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
  3. Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
  4. Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
  5. Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
  6. Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
  7. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
  8. Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
  11. Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179(2012).
  12. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
  13. Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
  14. Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
  15. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
  16. Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
  17. Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
  18. Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
  19. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
  20. Zhang, D. Y., Friedman, S. L. Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis. Hepatology. 56, 769-775 (1002).
  21. Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جيل من تحت الجلد والخلايا الكبدية داخل الكبد سرطان Xenografts الإنسان في الفئران العوز المناعي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.