مقالة منهجية

توطين والكمي النسبية من أنابيب الكربون النانوية في الخلايا مع متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/50566

⸱

ديسمبر 12, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), CNRS/Université Paris Diderot, 2ImagoSeine BioImaging Core Facility, Institut Jacques Monod, CNRS/Université Paris Diderot, 3Laboratoire d'Immunopathologie et Chimie Thérapeutique, CNRS/Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، كان الغرض الرئيسي هو مراقبة الامتصاص الخلوي وإفراز الخلايا في نهاية المطاف للأنابيب النانوية الكربونية (CNTs). من هذا المنظور ، اقترحنا هنا طريقة فريدة باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير متعدد الأطياف مما يسمح بالقياس الكمي وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في عدد من الخلايا ذات الصلة إحصائيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتمي المواد النانوية القائمة على الكربون ، مثل الأنابيب النانوية الكربونية (CNTs) ، إلى هذا النوع من الجسيمات النانوية التي يصعب تمييزها عن هياكل الخلايا الغنية بالكربون ، وفي الواقع لا توجد حتى الآن طريقة كمية لتقييم توزيعها على مستوى الخلايا والأنسجة. ما نقترحه هنا هو طريقة مبتكرة تسمح باكتشاف وقياس الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا باستخدام مقياس تدفق التصوير متعدد الأطياف (ImageStream ، Amnis). يدمج هذا الجهاز المطور حديثا كلا من الإنتاجية العالية للخلايا والتصوير عالي الدقة ، مما يوفر صورا لكل خلية في التدفق مباشرة وبالتالي تحليل الصور ذي الصلة إحصائيا. يتم الحصول على كل صورة خلية على قنوات المجال الساطع (BF) والمجال المظلم (DF) والفلورسنت ، مما يتيح الوصول على التوالي إلى مستوى وتوزيع امتصاص الضوء والضوء المتناثر والفلورة لكل خلية. يتكون التحليل بعد ذلك من مقارنة بكسل تلو الآخر لكل صورة ، من 7,000-10,000 خلية تم الحصول عليها لكل حالة من حالات التجربة. أصبح توطين الأنابيب النانوية الكربونية وتقديرها ممكنا بفضل بعض الخصائص الجوهرية الخاصة للأنابيب النانوية الكربونية: امتصاص الضوء القوي والتشتت. في الواقع ، تظهر الأنابيب الكربونية الكربونية على شكل بقع داكنة ممتصة بقوة على BF وبقع ساطعة على DF مع تحديد موقع دقيق.

يمكن أن يكون لهذه المنهجية تأثير كبير على الدراسات حول التفاعلات بين المواد النانوية والخلايا بالنظر إلى أن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على مجموعة كبيرة من المواد النانوية ، بقدر ما تكون قادرة على امتصاص (و / أو تشتت) الضوء بقوة كافية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال العقود الماضية ، اكتسب مكانة الجسيمات النانوية أهمية في مجموعة واسعة من التطبيقات. على وجه الخصوص ، يتم استكشاف الأنابيب النانوية الكربونية (CNTs) أكثر فأكثر كأدوات نانوية للتطبيقات التشخيصية والعلاجية المتنوعة. بفضل خصائصها الكهربائية والحرارية والطيفية الخاصة ، يمكن أن تعمل الأنابيب النانوية الكربونية كوسيلة توصيل للأدوية المتنوعة أو عوامل التباين ، أو يمكن أن تشارك أيضا في هندسةالأنسجة 1.

ومع ذلك ، فإن المخاوف بشأن السمية المحتملة لهذه المواد النانوية لا تزال قيد النقاش ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن مصير الأنابيب النانوية الكربونية في الكائن الحي لا يزال مثيرا للجدل للغاية. هناك بالفعل نقص في الطرق المناسبة لاكتشافها وتحديدها في الخلايا والأنسجة الحية: على سبيل المثال ، تم اقتراح تقنيات مثل التحليل الطيفي رامان ، والتصوير الصوتي الضوئي ، والتصوير الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة ، ولكن كل طريقة تظهر قيودا اعتمادا على نوع الأنابيب النانوية و / أو بيئتها2-8.

هنا ، يمكن أن تكون الطريقة المقترحة قابلة للتطبيق للكشف عن الجسيمات النانوية في الخلايا وقياسها كميا. أصبح هذا ممكنا من خلال استخدام ImageStream ، وهو جهاز يجمع بين قياس التدفق الخلوي والتصوير عالي الدقة. إنه يجمع بين مزايا الحصول على عدد كبير من الخلايا (حتى 5000 حدث / ثانية) - وفوائد البيانات الإحصائية والصور عالية الدقة لكل خلية في نفس الوقت (دقة مكانية 0.5 ميكرومتر). بشكل عام ، يتم جمع الصور باستخدام كاميرا CCD وهي تمثيل ثنائي الأبعاد للخلية. يتم قياس الضوء لكل بكسل في الصورة ويحدد كل من شدة وموقع التألق أو المكونات ذات الحجم الخلوي (في BF على سبيل المثال) ، مما يسمح بقدرة قوية على تمييز الخلايا بناء على مظهرها9،10.

كان الهدف هنا هو تصميم طريقة القياس النانوي التي من شأنها أن تمكن من إجراء تقييم كمي لتوزيع وسلوك الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا. على وجه الخصوص ، تم تطوير هذه الطريقة لدراسة امتصاص الخلايا ومعالجتها وإفراز الخلايا للأنابيب النانوية الكربونية. لقد أثبتنا أولا على الاتجار الخلوي المعقد للأنابيب النانوية الكربونية وثانيا نقل هذه المواد النانوية بين الخلايا: تهرب الأنابيب النانوية الكربونية المستوصلة بالخلايا من الخلايا المضيفة عند الإجهاد ، وتنتشر في الخارج في الفضاء خارج الخلية ويتم إعادة استيعابها بواسطة الخلايا الساذجة ، سواء كانت متجانسة أو غير متجانسة11

.

أظهرت الدراسة السابقة أن آليات مختلفة لامتصاص الخلايا ، سواء كانت نشطة أو سلبية ، يمكن أن تحدث اعتمادا على وظيفة CNT وحالة التجميع12. هنا تم تشغيل الأنابيب الكربونية متعددة الجدران من خلال الإضافة الحلقية ثنائية القطب 1،3 والحميد ثم اشتقاقها باستخدام مسبار فلوري ، فلوريس في إيزوثيوسيانات (FITC). في الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، يبدو أنها تستوعب الخلايا إما بشكل فردي مع توطين العصارة الخلوية أو كحزم ، توجد في الغالب في المقصورات الداخلية والليزوزومية11. في ImageStream ، تظهر الأنابيب الكربونية المجمعة بارتباط عال كبقع داكنة على BF ونقاط ساطعة على DF ، مما يسمح بتمييز واضح بين الخلايا المسماة CNT وخلايا التحكم. من ناحية أخرى ، لم يكن توزيع إشارة الفلورسنت المنبعثة من علامة الفلورسنت التي تعمل باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية متوضعا بشكل جيد: في الواقع ، على الأرجح بسبب ظاهرة التبريد ، لا تتطابق بقع الفلورسنت الخضراء بالضرورة مع البقع الموجودة على BF و DF. يشير هذا إلى أن المسبار الفلوري ، أولا ، ليس إلزاميا للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية باستخدام ImageStream ، وثانيا - من الأفضل - أنه ليس ممثلا تماما لكل من القياس الكمي وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية.

بالإضافة إلى إعطاء قياس إحصائي نسبي للجسيمات النانوية ، توفر هذه الطريقة أيضا معلومات تتعلق بتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا ، مما يعني أنها تميز ، على سبيل المثال ، الأنابيب النانوية الكربونية على الجزء الداخلي من الخلية مقابل تلك المرتبطة بغشاء البلازما. القدرة على توطين الأنابيب النانوية الكربونية على صور الخلية تتغلب بوضوح على قيود تحليل قياس التدفق الخلويالتقليدي 13. تم تطوير الإجراء هنا من خلال إنشاء أقنعة مناسبة لمناطق معينة من الخلية واختيار البقع الداكنة المقابلة للأنابيب النانوية الكربونية المحملة.

بشكل عام ، يمكن تطبيق هذه الطريقة لمجموعة كبيرة من التجارب التي تنطوي على الحاجة إلى التصور ، أو القياس الكمي ، في الخلايا بشرط أن تكون الجسيمات النانوية المستخدمة قادرة على امتصاص (و / أو تشتيت) الضوء بقوة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير الأنابيب النانوية الكربونية القابلة للتشتت بالماء (CNTs)

  1. تفريق الأنابيب النانوية الكربونية الأولى في مياه زراعة الخلايا ، قبل صوتنة لها لمدة 20 دقيقة في مكبر صوت بمياه الاستحمام عند 20 درجة مئوية. إذا تم تشغيل الأنابيب الكربونية باستخدام مسبار الفلورسنت ، فقم بحمايتها قدر الإمكان من الضوء طوال التجربة.

2. وضع العلامات على الخلايا باستخدام الأنابيب النانوية

الكربونية
  1. زراعة الخلايا البطانية للأوردة السرية البشرية (HUVEC) (على سبيل المثال) على ألواح مساحتها 25 سم مربع في وسط DMEM، تحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. تحضير محاليل الأنابيب النانوية الكربونية بتركيز 0 و 10 و 20 و 50 ميكروغرام / مل في وسط كامل واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 20 ساعة (2 مل من تعليق CNT للوحة 25 سم مربع).

3. تثبيت الخلية

  1. قم بإزالة وسط الحضانة بعد ذلك ؛ اشطف الخلايا باستخدام PBS ، وقم بالتربسين ، وأعد تعليق الخلايا في وسط DMEM كامل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1,200 دورة في الدقيقة.
  2. استبدل الوسط أولا ببارافورمالدهيد 4٪ لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، ثم ببرنامج تلفزيوني للحفاظ عليها. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الخلايا في هذه المرحلة من العملية عند 4 درجات مئوية لعدة أيام حتى تحليل القياس الخلوي.
  3. يجب أن تحتوي كل عينة على حوالي 106 خلايا مركزة في 50 ميكرولتر من PBS. قم بتعليقها بشكل صحيح لتجنب الركام أثناء التحليل وقم بتصفيتها من خلال صبغة شبكية 50 ميكرومتر.
    ملاحظة: يجب تنفيذ كل خطوة برفق شديد للحفاظ على الخلايا.

4. اكتساب ImageStream

استخدم مقياس تدفق التصوير متعدد الأطياف ImageStream للحصول على صور للخلايا.
يجب احترام بعض النقاط:

  1. حدد تكبير مكيف (هنا يتم استخدام هدف 40X).
  2. إذا تم استخدام الفلوروكروم:
    - تحضير عينة تحكم بدون fluorochrome.
    - تحضير الخلايا ذات التحكم الإيجابي أحادي اللون لكل فلوروكروم مستخدم في
    إضافة إلى عيناتك.
  3. استخدم الليزر 488 نانومتر لإثارة FITC والقناة 02 لجمع انبعاث التألق (تمرير النطاق 480-560 نانومتر). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم أيضا القناتين 01 و 06 للمجال الساطع (BF) والمجال المظلم (DF) على التوالي.
< p class = "jove_title" >5. ما بعد المعالجة - برنامج تحليل الأفكار (الإصدار 4.0)

  1. من بين جميع الأحداث المكتسبة ، يجب أن يقتصر التحليل أولا على مجموعة الخلايا المفردة: استخدم مخططا نقطيا ثنائي القياس يمثل "نسبة العرض إلى الارتفاع" (أي العرض / الارتفاع) مقابل "منطقة الخلية" (المعلمات المطبقة على الخلايا على BF) (الشكل 1). ثم يتم تمييز الخلايا المفردة المدرجة في منطقة الاهتمام ذات المساحة القياسية ونسبة العرض إلى الارتفاع القريبة من 1 من الأحداث متعددة الخلايا (مساحة كبيرة ونسبة عرض إلى ارتفاع صغيرة) والحطام (مساحة صغيرة للغاية).
  2. لتحديد الخلايا في المستوى المركز ، استخدم مخططا نقطيا ثنائي القياس تم تكييفه للخلايا ذات التباين الشديد المسمى CNTs: ارسم "التباين" مقابل "تدرج RMS" (الذي يقيس جودة حدة الصورة) على صورة BF - يسمح باستبعاد الخلايا غير المركزة التي تظهر كلا من تدرج RMS منخفض وتباين منخفض في صور BF الخاصة بها (الشكل 1).
    1. حدد المعلمة التي توفر أفضل فصل إحصائي بين الخلايا المسماة وغير المسماة باستخدام "العثور على أفضل ميزة". في دراستنا ، ميزة كائن البكسل المتوسطة هي المعلمة الأنسب (الشكل 2).
    2. تتبع الرسم البياني باستخدام هذه المعلمة مقابل التردد الطبيعي لمقارنة كمية الأنابيب النانوية الكربونية الممتسة للتركيزات المختبرة (الشكل 3).
    3. تتبع الرسم البياني ثنائي القياس "كائن متوسط البكسل على BF" (التدوين: متوسط Pixel_Object (M01 ، Ch01 ، ضيق) _Ch01) مقابل "الشدة على DF" (Intensity_MC_Ch06) ، من أجل دراسة العلاقة بين هاتين المعلمتين (الشكل 4).
  4. يتم تقييم القياس الكمي أيضا عن طريق الأقنعة:
    1. نظرا لأن الأنابيب الكربونية النانوية تظهر على أنها تمتص البقع الداكنة بقوة على BF ، فقم أولا بإنشاء قناع عتبة يناسبها بدقة عن طريق تحديد نطاق مقيد من وحدات البكسل ذات الكثافة المنخفضة التي تتكون من 0-533 في هذه الدراسة (القناع 1 ، التدوين: الكثافة (M01 ، BF ، 0-533)) (الشكل 5). يتم اختيار شدة العتبة على الخلايا المسماة مقارنة بخلايا التحكم.
    2. على العكس من ذلك ، قم بإنشاء قناع مناسب مع وحدات البكسل عالية الكثافة (150-4095 في هذه الحالة) من DF (القناع 2 ، التدوين: الكثافة (M06 ، DF ، 150-4095)) (الشكل 6).
    3. ارسم رسما بيانيا باستخدام مساحة القناع (إما 1 أو 2 ؛ (التدوين: Area_Intensity(M01 ، BF ، 0-533) للقناع 1): سيوفر تقديرا نسبيا لاستيعاب الأنابيب النانوية الكربونية بتركيزات مختلفة (الشكل 7).
    4. تحقق من درجة الارتباط بين هذين القناعين (بفضل المخطط ثنائي القياس "مساحة القناع 1" مقابل "مساحة القناع 2") (الشكل 7).
  5. قم بإنشاء أقنعة أخرى لترجمة الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا:
    1. قناع يناسب الجزء الداخلي من الخلية: تآكل (M01 ، 7) - يتوافق مع قناع الخلية بأكملها (M01) (الشكل 8) ، والذي يتآكل بشكل أكبر من 7 بكسل (الشكل 9).
    2. قناع يناسب الغشاء فقط باستخدام المعادلة المنطقية: M01 وليس التآكل (M01،7) - قناع الخلية بأكملها (M01) مطروحة من الداخل (التآكل (M01،7)) (الشكل 10).
    3. للنظر في وحدات البكسل الداكنة على الغشاء (المقابلة للأنابيب النانوية الكربونية) ، قم بإنشاء القناع: Intensity (M01 وليس Erode (M01 ، 7) ، BF ، 0-533) (الشكل 11).
    4. تصور الأقنعة المختلفة المطبقة على مجموعة من الخلايا للتحقق من ملاءمتها (الشكل 12) للخلايا المصنفة وغير المسماة.
    5. قم بتطبيق منطقة الميزة على القناع مع تحديد وحدات البكسل السوداء على الغشاء "Area_الكثافة (M01 وليس التآكل (M01 ، 7) ، BF ، 0-533)" ما يسمى بالمنطقة السوداء. سيسمح بالقياس الكمي للأنابيب الكربونية على الغشاء.
      < / > للتمييز أخيرا بين الأنابيب الكربونية الكربونية التي تم استيعابها من تلك التي تم امتصاصها فقط على الغشاء ، ارسم المنطقة السوداء على الغشاء مقابل المنطقة السوداء على الخلية بأكملها (أي "شدة Area_ (M01 وليس التآكل (M01 ، 7) ، BF ، 0-533" مقابل "كثافة Area_ (M01 ، BF ، 0-533)"). < / > < / > ملاحظه: يتم تطبيق نفس النوع من الإجراءات مع إشارة فلورسنت FITC: قارن زيادة شدة مضان FITC مقابل انخفاض متوسط إشارة البكسل على BF ، أو التحديد المشترك بين البقع الداكنة على شدة مضان BF و FITC. في حالتنا ، هذا النوع من التحليل غير مناسب لأن إشارة التألق لا تتطابق بشكل صحيح مع البقع الداكنة على BF من ناحية ومع المجال الساطع على DF من ناحية أخرى ، مما يدل على أن الخصائص الجوهرية للأنابيب النانوية الكربونية (امتصاص الضوء والتشتت) أكثر ملاءمة من الإشارة المتعلقة بمسبار التألق.
  6. بمجرد إنشاء جميع المخططات على حالة تجريبية واحدة ، قم بإنشاء "قالب تقرير إحصائي" ، واحفظ القالب كملف .ast وقم بتجميع جميع ملفات البيانات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرة عامة على مبدأ جهاز ImageStream مذكورة في الشكل 1. ينتج صورا متعددة عالية الدقة لكل خلية في التدفق ، بما في ذلك المجال الساطع (BF) ، والمجال المظلم (DF أو الضوء الجانبي المتنثر) ، وقناة (قناة) الفلورية ، كما هو موضح في الشكل 2 مع ثلاث خلايا مختلفة تحمل الأنابيب الكربونية النانوية. يتم أيضا عرض تراكبات هذه القنوات ، للوهلة الأولى توضح الارتباط.

بالنظر إلى أن جميع تحليلات ما بعد المعالجة تعتمد على تصوير الخلايا ، فإن اختيار الخلايا المركزة أمر بالغ الأهمية للدراسة (الشكل 3). في الواقع ، يؤدي وجود الأنابيب النانوية الكربونية إلى إحداث تغييرات في كل من التباين والتدرج مقارنة بالخلايا غير المصنفة: تميل الخلايا المركزة ، التي استوعبت كمية كبيرة من الأنابيب النانوية الكربونية ، إلى أن يكون لها تدرج منخفض RMS (والذي عادة ما يكون المعلمة الفريدة المستخدمة للتمييز بين الخلايا المركزة مقابل الخلايا غير المركزة) ولكن أيضا تباين مهم ، مما يفسر سبب أهمية المخطط ثنائي القياس. يظهر في الشكل 3 التمييز بين الخلايا غير المركزة (المنطقة الصفراء) مقابل الخلايا المركزة (المنطقة الزرقاء).

< p class = "jove_content" > يمكن تمييز الأنابيب الكربونية الكربونية الداخلية بوضوح - خاصة على BF الذي يظهر على أنه يمتص البقع الداكنة بقوة (انظر تأثير تركيز الملصقات المتنوع ، الشكل 4). علاوة على ذلك ، تم تحليل متوسط إشارة البكسل على BF ، مما يعطي تقديرا نسبيا للامتصاص: تظهر الرسوم البيانية في الشكل 5 زيادتها الكبيرة مع تركيز وضع العلامات على القناة النانوية الكربونية (نتائج حوالي 7,000 خلية لكل حالة تجريبية).

ثانيا ، يمكن أيضا القياس الكمي للأنابيب النانوية الكربونية من خلال استخدام الأقنعة ، المطبقة إما على نطاق مقيد من وحدات البكسل المظلمة للBF أو على البكسل عالي الكثافة ل DF (انظر الأمثلة في الشكل 6) ، المقابلة للبقع الناتجة عن وجود الأنابيب النانوية الكربونية. وبالتالي ، فإن رسم مساحة هذه الأقنعة يسمح بتسليط الضوء بالإضافة إلى زيادة الامتصاص (كما هو موضح في الشكل 7 مع مساحة القناع على BF ، وتحديد وحدات البكسل التي تتراوح من 0-533).

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم الارتباط بين البقع على BF و DF عن طريق رسم شدة DF مقابل إشارة بكسل BF المتوسطة (كما في الشكل 8) (تحليل مستقل عن القناع) أو مساحة القناع على BF (القناع 1) مقابل المنطقة الموجودة على DF (القناع 2).

فيما يتعلق بالإجراء الذي تم إنشاؤه لتوطين الأنابيب النانوية الكربونية داخل الخلايا، يعرض الشكل 9 أ الأقنعة المختلفة التي تم إنشاؤها. لاحظ أنه يجب التحقق من متانة أقنعة الترجمة (استنادا إلى تآكل قناع الخلية الافتراضي) بصريا على مجموعة من الخلايا المسماة وغير المسماة. يتم استخدام نفس الأقنعة لجميع العينات.

< p class = "jove_content" > إن رسم المساحة الإجمالية للبقع السوداء على غشاء الخلية مقابل تلك الموجودة في الخلية بأكملها يوفر درجة من الاستيعاب للخلايا التي تم تحضينها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مقارنة ب 2 ساعة حضانة عند 4 درجات مئوية (انظر الشكل 9 ب) ؛ يشير إلى أن الأنابيب الكربونية الكربونية تقع في الغالب على الغشاء عند 4 درجات مئوية ، بينما عند 37 درجة مئوية يتم استيعاب الأنابيب النانوية الكربونية في أكثر من 90٪ من الخلايا.

أخيرا فيما يتعلق بالتألق ، لم يتم استخدام هذه المعلمة كمؤشر للقياس الكمي للأنابيب النانوية الكربونية بسبب الارتباط المنخفض جدا بين بقع الفلورسنت والبقع على BF (و DF). في الواقع ، يشير الارتباط بين شدة FITC ومتوسط البكسل للمجال الساطع إلى معامل ارتباط بيرسون -0.2. في الشكل 10 ، تم توضيح حالتين ، حيث تتطابق إشارة التألق بشكل صحيح أو لا تتطابق مع البقعة السوداء للمجال الساطع.

figure-results-1
الشكل 1. نظرة عامة على ImageStream - التشغيل العام. يكتسب نظام التصوير متعدد الأطياف ما يصل إلى 12 صورة / خلية في ثلاثة أوضاع مختلفة: المجال الساطع ، والحقل المظلم ، والفلورة. يتكون الإعداد من 5 ليزر إثارة ، بما في ذلك 405 و 488 و 560 و 658 نانومتر. يتم جمع الضوء من الخلايا المتدفقة في الكوفيت بعدسة موضوعية مختلفة (في هذه الدراسة ، تم استخدام العدسة الموضوعية 40X) ونقله إلى عنصر التحلل الطيفي ، والذي يتكون من مجموعة من مرشحات التمرير الطويل في مصفوفة زاوية. يتم تشغيل كاميرا CCD التي تجمع الصور الخلوية باستخدام تقنية تسمى تكامل تأخير الوقت من أجل تجنب خطوط الصور. يعد عمق المجال الممتد (EDF) خيارا.

figure-results-2
الشكل 2. معرض صور للخلايا المصنفة بأنابيب نانوية كربونية (50 ميكروغرام / مل) تم التقاطها بواسطة ImageStream من خلال قنوات متنوعة (المجال الساطع (BF) ، المجال المظلم (DF) ، التألق (FITC) ، وتراكباتها). تظهر الأنابيب النانوية الكربونية المحصورة داخل الجسيمات الحالة داخل الخلايا كبقع سوداء كبيرة على صور المجال الساطع. على العكس من ذلك ، فإنها تخلق نقاطا مضيئة في المجال المظلم وعلى الصور الفلورية.

figure-results-3
الشكل 3. اختيار الخلايا في التركيز. يسمح مخطط النقاط ثنائي المتغير الذي يمثل تدرج متوسط مربع الجذر (rms) مقابل التباين في صور BF باستبعاد الخلايا غير المركزة. هنا تمثل المنطقة الصفراء الخلايا غير المركزة ، بينما يتم تمثيل الخلايا المركزة باللون الأزرق. تتميز الخلايا غير المركزة بكل من التباين المنخفض والتدرج المنخفض في صورة المجال الساطع. بالإضافة إلى تدرج rms ، تتطلب ميزة التباين تمييز الخلايا المركزة بعد وضع العلامات عليها باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-4
الشكل 4. امتصاص الأنابيب النانوية الكربونية المعتمدة على الجرعة التي تم تصورها بواسطة ImageStream. يتزايد عدد ومساحة البقع السوداء على صور المجال الساطع مع جرعة الأنابيب النانوية الكربونية أثناء الحضانة بالخلايا (تتراوح من 0-50 ميكروغرام / مل). لاحظ أن خلايا التحكم خالية من البقع السوداء. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-5
الشكل 5. القياس الكمي النسبي لامتصاص النانوية نانوية الكربونية بناء على صور المجال الساطع. تظهر الرسوم البيانية لميزة متوسط البكسل المطبقة على "الكائن" القناع الذي يضم الخلية بأكملها بوضوح سلوكا يعتمد على الجرعة ، والذي يمكن استخدامه للقياس الكمي. نطاق R9 يحيط بالخلايا الإيجابية للقناة الكربونية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-6
الشكل 6. إنشاء أقنعة لتحديد البقع السوداء على BF والنقاط المضيئة على صور DF. نظرا لأن الأنابيب النانوية الكربونية تظهر على أنها تمتص البقع الداكنة بقوة على صورة BF ، يتم إنشاء قناع عتبة لتحديد نطاق مقيد من وحدات البكسل ذات الكثافة المنخفضة التي تتكون من 0-533 في هذه الدراسة (القناع 1 ، التدوين: الشدة (M01 ، BF ، 0-533)). وعلى العكس من ذلك، يستخدم قناع ملائم لوحدات البكسل عالية الكثافة (4095-150 في هذه الحالة) على صورة تحديد الاتجاه (القناع 2، التدوين: الشدة (M06، DF، 4095-150)) لتحديد نقطة مضيئة على تحديد الحديد، تتوافق مع مناطق التشتت العالية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-7
الشكل 7. يتضح امتصاص الأنابيب الكربونية النانوية الكربونية المعتمد على الجرعة من خلال القياس الكمي لمنطقة البقعة السوداء على صور BF. باستخدام قناع العتبة (القناع 1) المطبق على BF ، يمكن قياس مساحة البقع السوداء لكل خلية ، مما يدل على توزيع يعتمد على الجرعة. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-8
الشكل 8. ترتبط طرق القياس الكمي CNT على أساس صور BF (الامتصاص) و DF (التشتت). على اليسار ، يظهر متوسط البكسل على صورة BF مقابل الشدة على صورة DF ارتباطا جيدا للخلايا المصنفة بالنانوية الكربونية (50 ميكروغرام / مل) (معامل ارتباط بيرسون r = -0.68). على اليمين ، منطقة القناع تناسب البقع الداكنة على BF مقابل منطقة القناع التي تناسب النقاط المضيئة على DF للخلايا المصنفة بالنانوية الكربونية (50 ميكروغرام / مل). معامل ارتباط بيرسون هو r = -0.83 ، يتم رسم القيم من 7,000 خلية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-9
الشكل 9. توطين CNT في الخلايا باستخدام أقنعة محددة. (أ) يتم إنشاء الأقنعة لتناسب موقعا معينا للخلية ، أي من اليسار إلى اليمين - الخلية بأكملها ، والغشاء فقط ، وداخل الخلية. قناع آخر يناسب البقع السوداء بفضل شدة العتبة (القناع 1 ، التدوين: الكثافة (M01 ، BF ، 0-533)). (ب) يمكن الحصول على تقييم توطين الأنابيب النانوية الكربونية عن طريق قياس مساحة البقع السوداء على توطين مختلف للخلايا باستخدام أقنعة التوطين الموصوفة في A. تم إجراء الحضانة باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية (50 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية وعند 4 درجات مئوية لتثبيط مسار الاستيعاب. يظهر الرسم البياني الذي يمثل المنطقة السوداء على الغشاء مقابل المنطقة السوداء في الخلية بأكملها امتصاصا يعتمد على الجرعة للأنابيب النانوية الكربونية على الغشاء عند 4 درجات مئوية ، في حين أن الاستيعاب الكامل للأنابيب النانوية الكربونية فعال عند 37 درجة مئوية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-10
الشكل 10. تحديد موقع البقع السوداء التي تسببها الأنابيب النانوية الكربونية على BF مع البقع المضيئة الفلورية على صورة FITC. لا يتم دائما تداخل البقع المضيئة الفلورية مع البقع السوداء على BF. تتطابق بشكل صحيح مع أول خليتين معروضتين ، ولكن ليس للخليتين الأخيرتين.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

في هذه الدراسة ، كان الهدف الأول هو تقييم كمية وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا. يمكن أن يكون الفحص المجهري متحد البؤر مسبقا الطريقة الذهبية لتقييم التوزيع داخل الخلايا للأنابيب النانوية الكربونية التي تعمل باستخدام علامة الفلورسنت FITC8،14. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي هو القيود المفروضة على التصوير أحادي الخلية ، وبالتالي نقص البيانات ذات الصلة إحصائيا. يسمح ImageStream بالعمل بما يتجاوز هذه العقبات: في الواقع ، من خلال فحص عدد كبير من الخلايا (5,000-10,000) في وقت قصير (<دقيقة) ، فإنه ينتج عنه نتائج قوية إحصائيا ، معززة أيضا من خلال التصوير عالي الدقة الذي يوفر صورا لكل خلية بدقة تحت الخلية (0.5 ميكرومتر). يجعل من الممكن تحليل كمية كبيرة من البيانات بناء على تحليل صورة واحدة.

بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي التقليدي ، فإن الميزة الفريدة ل ImageStream هي توفير صور متعددة الأطياف لكل خلية ومقارنة بكسل تلو الآخر لشدة الإشارة. وبالتالي ، يجمع ImageStream بين القوة الإحصائية لقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية والمزايا التحليلية للتصوير متحد البؤر لكل خلية تم تحليلها. إنه أمر بالغ الأهمية للقياس الكمي النسبي الخالي من الملصقات وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا.

2. الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول

تتكون الخطوة الحاسمة من اختيار المعلمات الأكثر ملاءمة لكل دراسة. في حالتنا ، كانت أفضل طريقة هي بناء التحليل على خصائص الامتصاص والتشتت للأنابيب النانوية: العلاقة الجيدة بين توطين البقع الداكنة على BF والنقاط المضيئة على DF تدعم أن الطريقة المطورة ذات صلة وموثوقة - وربما لم تكن ممكنة بدون تصوير الخلية.

3. قيود التقنية

يجب التأكيد على أن تصور الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا كان ممكنا فقط لأنها تميل إلى التراكم في الحويصلات داخل الخلايا الداخلية ، ثم تظهر كبقع امتصاص ومبعثرة قوية. لا ينبغي اكتشاف الأنابيب النانوية الفردية بناء على هذه الطريقة بينما يمكن اكتشافها في النهاية عند التألق ، مما يشكل قيدا واضحا. ثانيا ، القياس الكمي ليس "مطلقا" ولكنه نسبي لتركيزات الملصقات المختلفة وبالمقارنة مع الخلايا الضابطة غير المسماة. بعض السمات الكمية (متوسط البكسل ، الكثافة ، إلخ) هي معلمات مطلقة ، بينما يعتمد البعض الآخر على اختيار الأقنعة (قناع العتبة ، أقنعة التوطين).

4. الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية

فيما يتعلق بالتألق ، يسلط تحليل ImageStream الضوء على ضعف التنسيق المشترك لمجموعات CNT بين الإشارة الساطعة FITC والبقع على القنوات الأخرى. لذلك ، يبدو أن التألق لم يكن مؤشرا موثوقا به لقياس وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية. ومع ذلك ، من خلال التغلب على قيود قياس التدفق الخلوي التقليدي ، والذي يعتمد بشكل أساسي على القياس الكمي للفلورة ، فإن ImageStream متعدد الأطياف عالي الإنتاجية يمهد الطريق لقياس كمي إحصائي خال من الملصقات ، مع توفير توطين الأنابيب النانوية الكربونية داخل الخلايا.

5. التطبيقات المستقبلية

يمكن تعميم طريقة النانومترولوجيا الإحصائية عالية الإنتاجية هذه على أي مواد نانوية ، والتي تظهر امتصاصا وتشتتا عاليا للضوء عند التفاعل مع الخلايا. لذلك ، قد يكون لها تطبيقات مهمة لتحقيقات الواجهة الحيوية النانوية ، وعلم السموم النانوية ، والطب النانوي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل ANR P2N (مشروع Nother 2010-NANO-008-04) ، من قبل منطقة إيل دو فرانس (العقد رقم E539) ، و CNRS. تم دفع تكاليف الوصول المفتوح بواسطة EMD Millipore.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات

ImageStreamfigure-materials-1 Amnis

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
  2. De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
  3. Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
  4. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
  5. Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
  6. Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
  7. Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
  8. Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
  9. Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
  10. Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
  11. Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
  12. Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
  13. Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
  14. Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة