في هذه الدراسة ، كان الغرض الرئيسي هو مراقبة الامتصاص الخلوي وإفراز الخلايا في نهاية المطاف للأنابيب النانوية الكربونية (CNTs). من هذا المنظور ، اقترحنا هنا طريقة فريدة باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير متعدد الأطياف مما يسمح بالقياس الكمي وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في عدد من الخلايا ذات الصلة إحصائيا.
مقالة منهجية
توطين والكمي النسبية من أنابيب الكربون النانوية في الخلايا مع متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تنتمي المواد النانوية القائمة على الكربون ، مثل الأنابيب النانوية الكربونية (CNTs) ، إلى هذا النوع من الجسيمات النانوية التي يصعب تمييزها عن هياكل الخلايا الغنية بالكربون ، وفي الواقع لا توجد حتى الآن طريقة كمية لتقييم توزيعها على مستوى الخلايا والأنسجة. ما نقترحه هنا هو طريقة مبتكرة تسمح باكتشاف وقياس الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا باستخدام مقياس تدفق التصوير متعدد الأطياف (ImageStream ، Amnis). يدمج هذا الجهاز المطور حديثا كلا من الإنتاجية العالية للخلايا والتصوير عالي الدقة ، مما يوفر صورا لكل خلية في التدفق مباشرة وبالتالي تحليل الصور ذي الصلة إحصائيا. يتم الحصول على كل صورة خلية على قنوات المجال الساطع (BF) والمجال المظلم (DF) والفلورسنت ، مما يتيح الوصول على التوالي إلى مستوى وتوزيع امتصاص الضوء والضوء المتناثر والفلورة لكل خلية. يتكون التحليل بعد ذلك من مقارنة بكسل تلو الآخر لكل صورة ، من 7,000-10,000 خلية تم الحصول عليها لكل حالة من حالات التجربة. أصبح توطين الأنابيب النانوية الكربونية وتقديرها ممكنا بفضل بعض الخصائص الجوهرية الخاصة للأنابيب النانوية الكربونية: امتصاص الضوء القوي والتشتت. في الواقع ، تظهر الأنابيب الكربونية الكربونية على شكل بقع داكنة ممتصة بقوة على BF وبقع ساطعة على DF مع تحديد موقع دقيق.
يمكن أن يكون لهذه المنهجية تأثير كبير على الدراسات حول التفاعلات بين المواد النانوية والخلايا بالنظر إلى أن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على مجموعة كبيرة من المواد النانوية ، بقدر ما تكون قادرة على امتصاص (و / أو تشتت) الضوء بقوة كافية.
المقدمة
خلال العقود الماضية ، اكتسب مكانة الجسيمات النانوية أهمية في مجموعة واسعة من التطبيقات. على وجه الخصوص ، يتم استكشاف الأنابيب النانوية الكربونية (CNTs) أكثر فأكثر كأدوات نانوية للتطبيقات التشخيصية والعلاجية المتنوعة. بفضل خصائصها الكهربائية والحرارية والطيفية الخاصة ، يمكن أن تعمل الأنابيب النانوية الكربونية كوسيلة توصيل للأدوية المتنوعة أو عوامل التباين ، أو يمكن أن تشارك أيضا في هندسةالأنسجة 1.
ومع ذلك ، فإن المخاوف بشأن السمية المحتملة لهذه المواد النانوية لا تزال قيد النقاش ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن مصير الأنابيب النانوية الكربونية في الكائن الحي لا يزال مثيرا للجدل للغاية. هناك بالفعل نقص في الطرق المناسبة لاكتشافها وتحديدها في الخلايا والأنسجة الحية: على سبيل المثال ، تم اقتراح تقنيات مثل التحليل الطيفي رامان ، والتصوير الصوتي الضوئي ، والتصوير الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريبة ، ولكن كل طريقة تظهر قيودا اعتمادا على نوع الأنابيب النانوية و / أو بيئتها2-8.
هنا ، يمكن أن تكون الطريقة المقترحة قابلة للتطبيق للكشف عن الجسيمات النانوية في الخلايا وقياسها كميا. أصبح هذا ممكنا من خلال استخدام ImageStream ، وهو جهاز يجمع بين قياس التدفق الخلوي والتصوير عالي الدقة. إنه يجمع بين مزايا الحصول على عدد كبير من الخلايا (حتى 5000 حدث / ثانية) - وفوائد البيانات الإحصائية والصور عالية الدقة لكل خلية في نفس الوقت (دقة مكانية 0.5 ميكرومتر). بشكل عام ، يتم جمع الصور باستخدام كاميرا CCD وهي تمثيل ثنائي الأبعاد للخلية. يتم قياس الضوء لكل بكسل في الصورة ويحدد كل من شدة وموقع التألق أو المكونات ذات الحجم الخلوي (في BF على سبيل المثال) ، مما يسمح بقدرة قوية على تمييز الخلايا بناء على مظهرها9،10.
كان الهدف هنا هو تصميم طريقة القياس النانوي التي من شأنها أن تمكن من إجراء تقييم كمي لتوزيع وسلوك الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا. على وجه الخصوص ، تم تطوير هذه الطريقة لدراسة امتصاص الخلايا ومعالجتها وإفراز الخلايا للأنابيب النانوية الكربونية. لقد أثبتنا أولا على الاتجار الخلوي المعقد للأنابيب النانوية الكربونية وثانيا نقل هذه المواد النانوية بين الخلايا: تهرب الأنابيب النانوية الكربونية المستوصلة بالخلايا من الخلايا المضيفة عند الإجهاد ، وتنتشر في الخارج في الفضاء خارج الخلية ويتم إعادة استيعابها بواسطة الخلايا الساذجة ، سواء كانت متجانسة أو غير متجانسة11
.
أظهرت الدراسة السابقة أن آليات مختلفة لامتصاص الخلايا ، سواء كانت نشطة أو سلبية ، يمكن أن تحدث اعتمادا على وظيفة CNT وحالة التجميع12. هنا تم تشغيل الأنابيب الكربونية متعددة الجدران من خلال الإضافة الحلقية ثنائية القطب 1،3 والحميد ثم اشتقاقها باستخدام مسبار فلوري ، فلوريس في إيزوثيوسيانات (FITC). في الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، يبدو أنها تستوعب الخلايا إما بشكل فردي مع توطين العصارة الخلوية أو كحزم ، توجد في الغالب في المقصورات الداخلية والليزوزومية11. في ImageStream ، تظهر الأنابيب الكربونية المجمعة بارتباط عال كبقع داكنة على BF ونقاط ساطعة على DF ، مما يسمح بتمييز واضح بين الخلايا المسماة CNT وخلايا التحكم. من ناحية أخرى ، لم يكن توزيع إشارة الفلورسنت المنبعثة من علامة الفلورسنت التي تعمل باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية متوضعا بشكل جيد: في الواقع ، على الأرجح بسبب ظاهرة التبريد ، لا تتطابق بقع الفلورسنت الخضراء بالضرورة مع البقع الموجودة على BF و DF. يشير هذا إلى أن المسبار الفلوري ، أولا ، ليس إلزاميا للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية باستخدام ImageStream ، وثانيا - من الأفضل - أنه ليس ممثلا تماما لكل من القياس الكمي وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية.
بالإضافة إلى إعطاء قياس إحصائي نسبي للجسيمات النانوية ، توفر هذه الطريقة أيضا معلومات تتعلق بتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا ، مما يعني أنها تميز ، على سبيل المثال ، الأنابيب النانوية الكربونية على الجزء الداخلي من الخلية مقابل تلك المرتبطة بغشاء البلازما. القدرة على توطين الأنابيب النانوية الكربونية على صور الخلية تتغلب بوضوح على قيود تحليل قياس التدفق الخلويالتقليدي 13. تم تطوير الإجراء هنا من خلال إنشاء أقنعة مناسبة لمناطق معينة من الخلية واختيار البقع الداكنة المقابلة للأنابيب النانوية الكربونية المحملة.
بشكل عام ، يمكن تطبيق هذه الطريقة لمجموعة كبيرة من التجارب التي تنطوي على الحاجة إلى التصور ، أو القياس الكمي ، في الخلايا بشرط أن تكون الجسيمات النانوية المستخدمة قادرة على امتصاص (و / أو تشتيت) الضوء بقوة.
البروتوكول
< p class = "jove_title" >1. تحضير الأنابيب النانوية الكربونية القابلة للتشتت بالماء (CNTs)
- تفريق الأنابيب النانوية الكربونية الأولى في مياه زراعة الخلايا ، قبل صوتنة لها لمدة 20 دقيقة في مكبر صوت بمياه الاستحمام عند 20 درجة مئوية. إذا تم تشغيل الأنابيب الكربونية باستخدام مسبار الفلورسنت ، فقم بحمايتها قدر الإمكان من الضوء طوال التجربة.
2. وضع العلامات على الخلايا باستخدام الأنابيب النانوية
الكربونية- زراعة الخلايا البطانية للأوردة السرية البشرية (HUVEC) (على سبيل المثال) على ألواح مساحتها 25 سم مربع في وسط DMEM، تحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
- تحضير محاليل الأنابيب النانوية الكربونية بتركيز 0 و 10 و 20 و 50 ميكروغرام / مل في وسط كامل واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 20 ساعة (2 مل من تعليق CNT للوحة 25 سم مربع).
3. تثبيت الخلية
- قم بإزالة وسط الحضانة بعد ذلك ؛ اشطف الخلايا باستخدام PBS ، وقم بالتربسين ، وأعد تعليق الخلايا في وسط DMEM كامل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1,200 دورة في الدقيقة.
- استبدل الوسط أولا ببارافورمالدهيد 4٪ لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، ثم ببرنامج تلفزيوني للحفاظ عليها. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الخلايا في هذه المرحلة من العملية عند 4 درجات مئوية لعدة أيام حتى تحليل القياس الخلوي.
- يجب أن تحتوي كل عينة على حوالي 106 خلايا مركزة في 50 ميكرولتر من PBS. قم بتعليقها بشكل صحيح لتجنب الركام أثناء التحليل وقم بتصفيتها من خلال صبغة شبكية 50 ميكرومتر.
ملاحظة: يجب تنفيذ كل خطوة برفق شديد للحفاظ على الخلايا.
4. اكتساب ImageStream
استخدم مقياس تدفق التصوير متعدد الأطياف ImageStream للحصول على صور للخلايا.
يجب احترام بعض النقاط:
- حدد تكبير مكيف (هنا يتم استخدام هدف 40X).
- إذا تم استخدام الفلوروكروم:
- تحضير عينة تحكم بدون fluorochrome.
- تحضير الخلايا ذات التحكم الإيجابي أحادي اللون لكل فلوروكروم مستخدم في
إضافة إلى عيناتك. - استخدم الليزر 488 نانومتر لإثارة FITC والقناة 02 لجمع انبعاث التألق (تمرير النطاق 480-560 نانومتر). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم أيضا القناتين 01 و 06 للمجال الساطع (BF) والمجال المظلم (DF) على التوالي.
- من بين جميع الأحداث المكتسبة ، يجب أن يقتصر التحليل أولا على مجموعة الخلايا المفردة: استخدم مخططا نقطيا ثنائي القياس يمثل "نسبة العرض إلى الارتفاع" (أي العرض / الارتفاع) مقابل "منطقة الخلية" (المعلمات المطبقة على الخلايا على BF) (الشكل 1). ثم يتم تمييز الخلايا المفردة المدرجة في منطقة الاهتمام ذات المساحة القياسية ونسبة العرض إلى الارتفاع القريبة من 1 من الأحداث متعددة الخلايا (مساحة كبيرة ونسبة عرض إلى ارتفاع صغيرة) والحطام (مساحة صغيرة للغاية).
- لتحديد الخلايا في المستوى المركز ، استخدم مخططا نقطيا ثنائي القياس تم تكييفه للخلايا ذات التباين الشديد المسمى CNTs: ارسم "التباين" مقابل "تدرج RMS" (الذي يقيس جودة حدة الصورة) على صورة BF - يسمح باستبعاد الخلايا غير المركزة التي تظهر كلا من تدرج RMS منخفض وتباين منخفض في صور BF الخاصة بها (الشكل 1).
-
- حدد المعلمة التي توفر أفضل فصل إحصائي بين الخلايا المسماة وغير المسماة باستخدام "العثور على أفضل ميزة". في دراستنا ، ميزة كائن البكسل المتوسطة هي المعلمة الأنسب (الشكل 2).
- تتبع الرسم البياني باستخدام هذه المعلمة مقابل التردد الطبيعي لمقارنة كمية الأنابيب النانوية الكربونية الممتسة للتركيزات المختبرة (الشكل 3).
- تتبع الرسم البياني ثنائي القياس "كائن متوسط البكسل على BF" (التدوين: متوسط Pixel_Object (M01 ، Ch01 ، ضيق) _Ch01) مقابل "الشدة على DF" (Intensity_MC_Ch06) ، من أجل دراسة العلاقة بين هاتين المعلمتين (الشكل 4).
- يتم تقييم القياس الكمي أيضا عن طريق الأقنعة:
- نظرا لأن الأنابيب الكربونية النانوية تظهر على أنها تمتص البقع الداكنة بقوة على BF ، فقم أولا بإنشاء قناع عتبة يناسبها بدقة عن طريق تحديد نطاق مقيد من وحدات البكسل ذات الكثافة المنخفضة التي تتكون من 0-533 في هذه الدراسة (القناع 1 ، التدوين: الكثافة (M01 ، BF ، 0-533)) (الشكل 5). يتم اختيار شدة العتبة على الخلايا المسماة مقارنة بخلايا التحكم.
- على العكس من ذلك ، قم بإنشاء قناع مناسب مع وحدات البكسل عالية الكثافة (150-4095 في هذه الحالة) من DF (القناع 2 ، التدوين: الكثافة (M06 ، DF ، 150-4095)) (الشكل 6).
- ارسم رسما بيانيا باستخدام مساحة القناع (إما 1 أو 2 ؛ (التدوين: Area_Intensity(M01 ، BF ، 0-533) للقناع 1): سيوفر تقديرا نسبيا لاستيعاب الأنابيب النانوية الكربونية بتركيزات مختلفة (الشكل 7).
- تحقق من درجة الارتباط بين هذين القناعين (بفضل المخطط ثنائي القياس "مساحة القناع 1" مقابل "مساحة القناع 2") (الشكل 7).
- قم بإنشاء أقنعة أخرى لترجمة الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا:
- قناع يناسب الجزء الداخلي من الخلية: تآكل (M01 ، 7) - يتوافق مع قناع الخلية بأكملها (M01) (الشكل 8) ، والذي يتآكل بشكل أكبر من 7 بكسل (الشكل 9).
- قناع يناسب الغشاء فقط باستخدام المعادلة المنطقية: M01 وليس التآكل (M01،7) - قناع الخلية بأكملها (M01) مطروحة من الداخل (التآكل (M01،7)) (الشكل 10).
- للنظر في وحدات البكسل الداكنة على الغشاء (المقابلة للأنابيب النانوية الكربونية) ، قم بإنشاء القناع: Intensity (M01 وليس Erode (M01 ، 7) ، BF ، 0-533) (الشكل 11).
- تصور الأقنعة المختلفة المطبقة على مجموعة من الخلايا للتحقق من ملاءمتها (الشكل 12) للخلايا المصنفة وغير المسماة.
- قم بتطبيق منطقة الميزة على القناع مع تحديد وحدات البكسل السوداء على الغشاء "Area_الكثافة (M01 وليس التآكل (M01 ، 7) ، BF ، 0-533)" ما يسمى بالمنطقة السوداء. سيسمح بالقياس الكمي للأنابيب الكربونية على الغشاء.
< / > للتمييز أخيرا بين الأنابيب الكربونية الكربونية التي تم استيعابها من تلك التي تم امتصاصها فقط على الغشاء ، ارسم المنطقة السوداء على الغشاء مقابل المنطقة السوداء على الخلية بأكملها (أي "شدة Area_ (M01 وليس التآكل (M01 ، 7) ، BF ، 0-533" مقابل "كثافة Area_ (M01 ، BF ، 0-533)"). < / > < / > ملاحظه: يتم تطبيق نفس النوع من الإجراءات مع إشارة فلورسنت FITC: قارن زيادة شدة مضان FITC مقابل انخفاض متوسط إشارة البكسل على BF ، أو التحديد المشترك بين البقع الداكنة على شدة مضان BF و FITC. في حالتنا ، هذا النوع من التحليل غير مناسب لأن إشارة التألق لا تتطابق بشكل صحيح مع البقع الداكنة على BF من ناحية ومع المجال الساطع على DF من ناحية أخرى ، مما يدل على أن الخصائص الجوهرية للأنابيب النانوية الكربونية (امتصاص الضوء والتشتت) أكثر ملاءمة من الإشارة المتعلقة بمسبار التألق.
- بمجرد إنشاء جميع المخططات على حالة تجريبية واحدة ، قم بإنشاء "قالب تقرير إحصائي" ، واحفظ القالب كملف .ast وقم بتجميع جميع ملفات البيانات.
النتائج
يتم تقديم نظرة عامة على مبدأ عمل جهاز ImageStream في الشكل 1. حيث يقوم الجهاز بإنتاج صور متعددة عالية الدقة لكل خلية أثناء التدفق، بما في ذلك الحقل المضيء (BF)، والحقل المظلم (DF أو الضوء المشتت جانبياً)، وقناة (أو قنوات) الفلورسنت، كما هو موضح في الشكل 2 مع ثلاث خلايا مختلفة موسومة بـ CNTs. كما تظهر الصور المتراكبة لهذه القنوات، مما يوضح الارتباط للوهلة الأولى.
بما أن جميع تحليلات ما بعد المعالجة تعتمد على تصوير الخلايا، فإن اختيار الخلايا المركزة يعد أمراً بالغ الأهمية للدراسة (الشكل 3). وفي الواقع، يؤدي وجود أنابيب الكربون النانوية (CNTs) إلى إحداث تغييرات في كل من التباين والتدرج مقارنة بالخلايا غير الملحقة: فالمناطق المركزة، التي استوعبت كمية كبيرة من أنابيب الكربون النانوية، تميل إلى امتلاك تدرج جذر متوسط مربعات (rms) منخفض (وهو المعامل الذي يُستخدم عادةً كمعيار وحيد للتمييز بين الخلايا المركزة مقابل غير المركزة) ولكنها تمتلك أيضاً تباينًا ملحوظاً، وهو ما يفسر سبب أهمية المخطط ثنائي المعاملات. ويظهر في الشكل 3 التمييز بين الخلايا غير المركزة (المنطقة الصفراء) مقابل الخلايا المركزة (المنطقة الزرقاء).
يمكن تمييز أنابيب الكربون النانوية (CNTs) التي استدخلتها الخلايا بوضوح - لا سيما في صور المجال الساطع (BF) حيث تظهر كبقع داكنة شديدة الامتصاص (انظر تأثير تراكيز الوسم المختلفة، الشكل 4). علاوة على ذلك، تم تحليل متوسط إشارة البكسل في صور المجال الساطع، مما أعطى تقديراً كمياً نسبياً لعملية الامتصاص: وتظهر الرسوم البيانية في الشكل 5 زيادة ملحوظة في هذا الامتصاص مع زيادة تركيز الوسم بـ CNTs (النتائج تخص حوالي 7,000 خلية لكل حالة تجريبية).
ثانياً، يمكن أيضاً تقدير كمية أنابيب الكربون النانوية (CNTs) من خلال استخدام الأقنعة، والتي يتم تطبيقها إما على نطاق محدود من البكسلات المظلمة في المجال الساطع (BF) أو على البكسلات ذات الكثافة العالية في المجال المظلم (DF) (انظر الأمثلة في الشكل 6)، والتي تقابل البقع الناتجة عن وجود أنابيب الكربون النانوية. وبذلك، فإن رسم مساحة هذه الأقنعة يسمح بتسليط الضوء على زيادة الامتصاص (كما هو موضح في الشكل 7 باستخدام مساحة القناع في المجال الساطع BF، مع اختيار بكسلات تتراوح قيمها بين 0-533).
بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم الارتباط بين البقع في BF وDF عن طريق رسم شدة DF مقابل متوسط إشارة البكسل في BF (كما هو موضح في الشكل 8) (تحليل مستقل عن القناع) أو مساحة القناع في BF (القناع 1) مقابل المساحة في DF (القناع 2).
فيما يتعلق بالإجراء الذي تم إنشاؤه لتحديد مواقع أنابيب الكربون النانوية (CNTs) داخل الخلايا، يوضح الشكل 9A الأقنعة المختلفة التي تم إنشاؤها. يرجى ملاحظة أنه يجب التحقق بصرياً من متانة أقنعة التحديد (بناءً على تآكل قناع الخلية الافتراضي) على مجموعة من الخلايا الموسومة وغير الموسومة. وتُستخدم الأقنعة نفسها لجميع العينات.
يوفر رسم المساحة الإجمالية للبقع السوداء على غشاء الخلية مقابل مساحتها على الخلية بأكملها درجة لمدى الاستيعاب الداخلي للخلايا التي تم تحضينها لمدة 20 hr عند 37 °C مقارنة بالتحضين لمدة 2 hr عند 4 °C (انظر الشكل 9B)؛ وهو ما يشير إلى أن الأنابيب الكربونية النانوية (CNTs) تتركز في الغالب على الغشاء عند 4 °C، بينما يتم استيعابها داخلياً في أكثر من 90% من الخلايا عند 37 °C.
وأخيراً فيما يتعلق بالفلورة، لم يتم استخدام هذا المعامل كمؤشر لتقدير كمية أنابيب الكربون النانوية (CNTs) نظراً لضعف الارتباط بين البقع الفلورية والبقع الظاهرة في مجال السطوع (BF) (والمجال المظلم DF). وبالفعل، فإن الارتباط بين شدة FITC ومتوسط بكسل مجال السطوع يشير إلى معامل ارتباط بيرسون قدره -0.2. وفي الشكل 10، تم توضيح حالتين، حيث تتطابق إشارة الفلورة بشكل صحيح أو غير صحيح مع البقعة السوداء في مجال السطوع.
الشكل 1. نظرة عامة على آلية التشغيل العامة لجهاز ImageStream. يقوم نظام التصوير متعدد الأطياف بالتقاط ما يصل إلى 12 صورة لكل خلية في ثلاثة أنماط مختلفة: الحقل المضيء، والحقل المظلم، والفلورة. يتكون الإعداد من 5 ليزرات إثارة، بما في ذلك 405، 488، 560، و 658 nm. يتم تجميع الضوء من الخلايا المتدفقة في الكيوفيت باستخدام عدسات شيئية مختلفة (في هذه الدراسة، تم استخدام العدسة الشيئية 40X) ونقله إلى عنصر التفكيك الطيفي، الذي يتكون من مجموعة من مرشحات تمرير طويلة في مصفوفة زاويّة. تعمل كاميرا CCD التي تجمع صور الخلايا باستخدام تقنية تسمى "تكامل تأخير الوقت" (time-delay-integration) لتجنب ظهور تلطخ في الصور. كما يتوفر خيار عمق المجال الممتد (EDF).
الشكل 2. معرض صور لخلايا وسمت بأنابيب الكربون النانوية (50 μg/mL) تم التقاطها بواسطة ImageStream عبر قنوات متنوعة (المجال المضيء (BF)، والمجال المظلم (DF)، والفلورية (FITC)، وتراكباتها). تظهر أنابيب الكربون النانوية المحصورة داخل الليزوزومات داخل الخلوية كنقاط سوداء كبيرة في صور المجال المضيء. وعلى العكس من ذلك، فإنها تشكل نقاطاً مضيئة في صور المجال المظلم والصور الفلورية.
الشكل 3. اختيار الخلايا الموجودة في بؤرة التركيز. يسمح مخطط النقاط ثنائي المتغير الذي يمثل جذر متوسط المربع (rms) للتدرج مقابل التباين في صور BF باستبعاد الخلايا غير المركزة. هنا تمثل المنطقة الصفراء الخلايا غير المركزة، بينما تمثل الخلايا المركزة باللون الأزرق. تتميز الخلايا غير المركزة بانخفاض كل من التباين وجذر متوسط المربع للتدرج في صورة الحقل المضيء. وبالإضافة إلى جذر متوسط المربع للتدرج، تكون ميزة التباين مطلوبة لتمييز الخلايا المركزة بعد وسمها بـ CNTs.
الشكل 4. امتصاص CNTs المعتمد على الجرعة كما تم تصويره بواسطة ImageStream. يزداد عدد ومساحة البقع السوداء في صور المجال المضيء مع زيادة جرعة CNTs أثناء الحضن مع الخلايا (تتراوح من 0-50 µg/ml). يلاحظ أن الخلايا الضابطة خالية من البقع السوداء.
الشكل 5. التكميم النسبي لامتصاص CNT استناداً إلى صور المجال المضيء. تُظهر الرسوم البيانية لمتوسط ميزة البكسل المطبقة على قناع "object" الذي يمثل الخلية كاملة بوضوح سلوكاً يعتمد على الجرعة، وهو ما يمكن استخدامه للتكميم. يحيط النطاق R9 بالخلايا الموجبة لـ CNT.
الشكل 6. إنشاء أقنعة لاختيار البقع السوداء في صور BF والبقع المضيئة في صور DF. نظرًا لأن أنابيب الكربون النانوية (CNTs) تظهر كبقع داكنة شديدة الامتصاص في صورة BF، تم إنشاء قناع عتبة لاختيار نطاق محدد من البكسلات ذات الكثافة المنخفضة التي تتراوح بين 0-533 في هذه الدراسة (القناع 1، التدوين: Intensity(M01, BF, 0-533)). وعلى العكس من ذلك، يتم استخدام قناع يتناسب مع البكسلات ذات الكثافة العالية (150-4095 في هذه الحالة) في صورة DF (القناع 2، التدوين: Intensity (M06, DF, 150-4095)) لاختيار البقع المضيئة في DF، والتي تقابل مناطق التشتت العالي.
الشكل 7. يظهر الامتصاص المعتمد على الجرعة لـ CNTs من خلال قياس مساحة البقع السوداء في صور BF. باستخدام قناع العتبة (mask 1) المطبق على BF، يمكن قياس مساحة البقع السوداء لكل خلية، مما يظهر توزيعاً معتمداً على الجرعة.
الشكل 8. ترتبط طرق قياس كمية CNT بناءً على صور BF (الامتصاص) وصور DF (التشتت). على اليسار، يظهر متوسط البكسل في صورة BF مقابل الكثافة في صورة DF ارتباطاً جيداً للخلايا الموسومة بـ CNTs (50 µg/ml) (معامل ارتباط بيرسون r = -0.68). على اليمين، تظهر مساحة القناع المطابق للبقع الداكنة في BF مقابل مساحة القناع المطابق للبقع المضيئة في DF للخلايا الموسومة بـ CNTs (50 µg/ml). معامل ارتباط بيرسون هو r = -0.83. تم رسم القيم الخاصة بـ 7,000 خلية.
الشكل 9. تحديد تموضع CNT في الخلايا باستخدام أقنعة محددة. (A) يتم إنشاء الأقنعة لتناسب موقعًا معينًا في الخلية، وتحديدًا من اليسار إلى اليمين - الخلية بأكملها، الغشاء فقط، وداخل الخلية. ويناسب قناع آخر البقع السوداء بفضل شدة العتبة (Mask 1, notation: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) يمكن الحصول على تقييم لتموضع CNTs عن طريق قياس مساحة البقع السوداء في مواقع مختلفة من الخلايا باستخدام أقنعة التموضع الموضحة في A. تم إجراء الحضن مع CNTs (50 µg/ml) عند 37 °C و 4 °C لتثبيط مسار الاستدخال. يظهر الرسم البياني الذي يمثل المساحة السوداء على الغشاء مقابل المساحة السوداء في الخلية بأكملها امتصاصًا يعتمد على الجرعة لـ CNTs على الغشاء عند 4 °C، بينما يكون الاستدخال الكامل لـ CNTs فعالاً عند 37 °C.
الشكل 10. التوضع المشترك للبقع السوداء الناجمة عن CNT في الحقل المضيء (BF) مع البقع الفلورية الساطعة في صورة FITC. لا تتوضع البقع الفلورية الساطعة دائماً بشكل مشترك مع البقع السوداء في BF؛ حيث تتطابق بشكل صحيح في الخليتين الأوليين المعروضتين، ولكن ليس في الخليتين الأخيرتين.
المناقشة
1. التعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
في هذه الدراسة ، كان الهدف الأول هو تقييم كمية وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا. يمكن أن يكون الفحص المجهري متحد البؤر مسبقا الطريقة الذهبية لتقييم التوزيع داخل الخلايا للأنابيب النانوية الكربونية التي تعمل باستخدام علامة الفلورسنت FITC8،14. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي هو القيود المفروضة على التصوير أحادي الخلية ، وبالتالي نقص البيانات ذات الصلة إحصائيا. يسمح ImageStream بالعمل بما يتجاوز هذه العقبات: في الواقع ، من خلال فحص عدد كبير من الخلايا (5,000-10,000) في وقت قصير (<دقيقة) ، فإنه ينتج عنه نتائج قوية إحصائيا ، معززة أيضا من خلال التصوير عالي الدقة الذي يوفر صورا لكل خلية بدقة تحت الخلية (0.5 ميكرومتر). يجعل من الممكن تحليل كمية كبيرة من البيانات بناء على تحليل صورة واحدة.
بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي التقليدي ، فإن الميزة الفريدة ل ImageStream هي توفير صور متعددة الأطياف لكل خلية ومقارنة بكسل تلو الآخر لشدة الإشارة. وبالتالي ، يجمع ImageStream بين القوة الإحصائية لقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية والمزايا التحليلية للتصوير متحد البؤر لكل خلية تم تحليلها. إنه أمر بالغ الأهمية للقياس الكمي النسبي الخالي من الملصقات وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا.
2. الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
تتكون الخطوة الحاسمة من اختيار المعلمات الأكثر ملاءمة لكل دراسة. في حالتنا ، كانت أفضل طريقة هي بناء التحليل على خصائص الامتصاص والتشتت للأنابيب النانوية: العلاقة الجيدة بين توطين البقع الداكنة على BF والنقاط المضيئة على DF تدعم أن الطريقة المطورة ذات صلة وموثوقة - وربما لم تكن ممكنة بدون تصوير الخلية.
3. قيود التقنية
يجب التأكيد على أن تصور الأنابيب النانوية الكربونية في الخلايا كان ممكنا فقط لأنها تميل إلى التراكم في الحويصلات داخل الخلايا الداخلية ، ثم تظهر كبقع امتصاص ومبعثرة قوية. لا ينبغي اكتشاف الأنابيب النانوية الفردية بناء على هذه الطريقة بينما يمكن اكتشافها في النهاية عند التألق ، مما يشكل قيدا واضحا. ثانيا ، القياس الكمي ليس "مطلقا" ولكنه نسبي لتركيزات الملصقات المختلفة وبالمقارنة مع الخلايا الضابطة غير المسماة. بعض السمات الكمية (متوسط البكسل ، الكثافة ، إلخ) هي معلمات مطلقة ، بينما يعتمد البعض الآخر على اختيار الأقنعة (قناع العتبة ، أقنعة التوطين).
4. الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية
فيما يتعلق بالتألق ، يسلط تحليل ImageStream الضوء على ضعف التنسيق المشترك لمجموعات CNT بين الإشارة الساطعة FITC والبقع على القنوات الأخرى. لذلك ، يبدو أن التألق لم يكن مؤشرا موثوقا به لقياس وتوطين الأنابيب النانوية الكربونية. ومع ذلك ، من خلال التغلب على قيود قياس التدفق الخلوي التقليدي ، والذي يعتمد بشكل أساسي على القياس الكمي للفلورة ، فإن ImageStream متعدد الأطياف عالي الإنتاجية يمهد الطريق لقياس كمي إحصائي خال من الملصقات ، مع توفير توطين الأنابيب النانوية الكربونية داخل الخلايا.
5. التطبيقات المستقبلية
يمكن تعميم طريقة النانومترولوجيا الإحصائية عالية الإنتاجية هذه على أي مواد نانوية ، والتي تظهر امتصاصا وتشتتا عاليا للضوء عند التفاعل مع الخلايا. لذلك ، قد يكون لها تطبيقات مهمة لتحقيقات الواجهة الحيوية النانوية ، وعلم السموم النانوية ، والطب النانوي.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل ANR P2N (مشروع Nother 2010-NANO-008-04) ، من قبل منطقة إيل دو فرانس (العقد رقم E539) ، و CNRS. تم دفع تكاليف الوصول المفتوح بواسطة EMD Millipore.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ImageStream |  أمنيس (Amnis) |
المراجع
- Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
- De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
- Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
- Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
- Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
- Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
- Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
- Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
- Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
- Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
- Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
- Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).
إعادة الطباعة والأذونات
