يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

41.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50585

⸱

سبتمبر 26, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

في هذه المقالة

ملخص

في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا عزل السكان من الخلايا الجذعية البالغة، ووصف الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية أو ASCS، من الأنسجة الدهنية. توضح هذه المقالة عزلة ASCS من lipoaspirates باستخدام دليل، بروتوكول الهضم الأنزيمية باستخدام كولاجيناز.

الملخص

في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس، وعزل السكان جديدة من الخلايا الجذعية البالغة من liposuctioned الأنسجة الدهنية التي أسموه في البداية خلايا Lipoaspirate المصنعة أو خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. منذ ذلك الحين، تم إعادة تسمية هذه الخلايا الجذعية الخلايا الجذعية الدهنية كما مشتقة أو ASCS وذهبت لتصبح واحدة من خلايا جذعية للبالغين الأكثر شعبية للسكان في مجالات أبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي. وصف الآلاف من المقالات الآن استخدام ASCS في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجدد، بما في ذلك تجديد العظام، وإصلاح الأعصاب الطرفية والهندسة القلب والأوعية الدموية. وقد بدأت المقالات الأخيرة لوصف عدد لا يحصى من الاستخدامات لASCS في العيادة. ويحدد البروتوكول هو موضح في هذه المقالة الإجراء الأساسي لليدويا وإنزيمي عزل ASCS من كميات كبيرة من lipoaspirates تم الحصول عليها من الإجراءات التجميلية. يمكن بسهولة أن تحجيم هذا البروتوكول أعلى أو لأسفل لaccommodأكلت حجم lipoaspirate ويمكن تكييفها لعزل ASCS من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من خلال abdominoplasties وإجراءات أخرى مماثلة.

المقدمة

في عام 2001، وقد وصفت مجموعة من السكان المفترضة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من الأنسجة الدهنية في مجلة هندسة الأنسجة 1. أعطيت هذه الخلايا اسم معالجتها Lipoaspirate أو جيش التحرير الشعبى الصينى الخلايا بسبب اشتقاقها من الأنسجة المصنعة lipoaspirate الحصول عليها من خلال الجراحة التجميلية. واستند أسلوب العزل الموضحة في هذه المقالة على الاستراتيجيات القائمة الأنزيمية للعزلة من انسجة الوعائية الكسر (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية 2. تم تعريف صندوق التبرعات الخاص باعتباره الحد الأدنى من السكان معالجة خلايا الدم الحمراء، والخلايا الليفية، الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء، pericytes وقبل الخلايا الشحمية التي لم تنضم إلى ثقافة الركيزة الأنسجة 2، 3. ويقترح زراعة هذا SVF مع مرور الوقت للقضاء على العديد من هؤلاء السكان الخلية تلويث ويؤدي إلى ملتصقة والسكان ليفية. وقد تم تحديد هذه الخلايا الليفية في الأدب على مدى السنوات ال 40 الماضية بأنها مرحلة ما قبلالخلايا الشحمية. ومع ذلك، أظهر فريق بحثنا أن هذه الخلايا تمتلك أرومية متوسطة multipotency وإعادة تسمية السكان SVF ملتصقة باسم خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. وأضافت دراسات لاحقة من قبل العديد من المجموعات البحثية الأخرى لهذه الإمكانات، مما يشير إلى كل من الأديم الباطن وإمكانات الأدمة (للمراجعة انظر 4). منذ ذلك الوقت، ظهرت العديد من الشروط الإضافية لهذه الخلايا في الأدب. من أجل توفير نوع من التوافق في الآراء، اعتمد مصطلح الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة أو ASCS في المؤتمر الثاني IFATS السنوية 2. على هذا النحو، سيتم استخدام ASC المدى في هذه المقالة.

بروتوكول الموصوفة في هذه المقالة هو إجراء بسيط نسبيا والتي تتطلب معدات المختبرات القياسية ويستخدم الكواشف بسيطة مثل الفوسفات مخزنة المالحة والكواشف وسائل الاعلام زراعة الأنسجة القياسية وكولاجيناز. ويمكن ان تنتج أعداد كبيرة من ASCS اعتمادا على كمية من النسيج الدهني بدءا حجم وج اللاحقةالوقت ulture. ومع ذلك، فإن معالجة مثل هذا المبلغ الكبير من الأنسجة الدهنية يمكن أن تقدم بعض القضايا المادية التي يمكن تخفيفها إلى درجة باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول لا تتطلب مرافق زراعة الأنسجة عقيمة واغطية وافق السلامة الأحيائية، مما يجعل من الضروري استخدام مرفق زراعة الأنسجة المعتمدة. يمكن هذا الشرط أيضا خفض فائدة السكان ASC في التطبيقات السريرية ما لم يتم عزل كانوا في الممارسات التصنيعية الجيدة مرافق (GMP) وافق المصممة لعزل وتوسيع المواد للاستخدام السريري. كبديل، فإن النظم الآلية التي يمكن عزل ASCS في نظام مغلق في غرفة العمليات تجنب هذه المسألة الأساسية والسماح للاستخدام الفوري من ASCS دون أي حاجة لاحقة التوسع في المختبر. حتى الآن، هناك ستة النظم الآلية المتوفرة تجاريا لعزل الخلايا من الأنسجة البشرية. هذه الأنظمة قد تجعل من الممكن عزلعدد كبير من ASCS من كميات كبيرة من الأنسجة الدهنية التالية الحصاد على الفور. ويمكن عندئذ أن يعيد هذه ASCS في جسم المريض لمجموعة متنوعة من الأغراض دون التجدد المريض الاضطرار إلى مغادرة غرفة العمليات. بالإضافة إلى هذا البروتوكول يصف العزلة دليل ASCS، وتعطى بروتوكول لعزل الآلي ASCS باستخدام نظام Celution أيضا في مقال مصاحب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بروتوكول المعروضة هنا يصف العزلة دليل ASCS من lipoaspirates الحصول عليها من خلال العمليات التجميلية باستخدام الهضم الأنزيمي والتفاضلية الطرد المركزي. تم نشر هذا البروتوكول لأول مرة في مجلة هندسة الأنسجة في عام 2001 1، حيث كانت تسمى الخلايا الناتجة خلايا Lipoaspirate المصنعة أو خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى بسبب عزلتهم من lipoaspirates. ومع ذلك، فقد تم استبدال الآن الخلية جيش التحرير الشعبى الصينى الأمد مع الأجل المستمدة الدهنية الخلايا الجذعية أو ASCS لإعطاء المجال نوعا من المطابقة من حيث التسمية. وقد تبين أن الخلايا المعزولة من خلال هذا البروتوكول من قبل العديد من لامتلاك إمكانات أرومية متوسطة سواء في التجارب المختبرية والحية (انظر للمراجعة 4). بالإضافة إلى ذلك، تم أيضا استكشاف الأدمة والأديم الباطن إمكانات ASC 4. تقنية العزل هو بسيط ومباشر ويتطلب ما يقرب من ساعة واحدة لإكمال. الخلية الناتجةيتم تربيتها و في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية. مع مرور الوقت والثقافة، ويصبح السكان ASC أكثر تجانسا، تتألف من خلايا ليفية التي توسع بسهولة وتظهر قابلية جيدة على المدى الطويل في الثقافة.

ملاحظة: يتم سرد القطع التالية من المعدات المطلوبة في نهاية هذه المقالة. ويجب تعقيم جميع الأواني الزجاجية، وسائل الإعلام والكواشف من خلال التعقيم أو تصفيتها من خلال 0.22 ميكرون مرشحات. وينبغي اتباع العقيم تقنيات زراعة الأنسجة في جميع الأوقات. لضمان ذلك، وجميع المواد وضعت في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية يجب تعقيم عن طريق الرش بمحلول الإيثانول 70٪ والمسح مع مناشف ورقية نظيفة.

1. قبل الحصاد، تحضير التالية:

  1. العقيمة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لغسل lipoaspirates. إعداد حوالي 1 لتر من برنامج تلفزيوني 1X مقابل كل 100 مل من lipoaspirate. الأوتوكلاف برنامج تلفزيوني وجميعآه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. كخيار، ويمكن إضافة المضادات الحيوية / مضاد فطري إلى تركيز النهائي من: 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 2.50 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B مرة واحدة قد بردت في برنامج تلفزيوني.
  2. العقيمة 0،075-0،1٪ نوع كولاجيناز IA (من نسج كلوستريديوم) لالأنزيمية الهضم من lipoaspirate. سوف تركيز تعتمد على نوعية ومصدر هذه كولاجيناز - أي مقابل الخام المنقى. أنواع كولاجيناز أخرى يمكن استخدامها (على سبيل المثال نوع كولاجيناز الثاني أو الرابع) بتركيزات مماثلة. إعداد في برنامج تلفزيوني 1X وتصفية العقيمة باستخدام نظام الترشيح 1،000 مل مع مرشح 0.22 ميكرون (الشكل 1A). ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام الزجاجات المعقمة مزودة أعلى مرشح زجاجة. إعداد واستخدام في درجة حرارة الغرفة. قد يتم تخزين حلول كولاجيناز على المدى القصير عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. لا تجميد الحل كولاجيناز لأنه قد يقلل من نشاطه.
  3. العقيمة تحكم متوسط ​​(CM) لتعطيل كولاجيناز وزراعة السكان ASC. ل500 مل من سم، والجمع بين ما يلي: 500 مل DMEM (4.5 غرام / لتر الجلوكوز، مع L-الجلوتامين)، 50 مل مصل بقري جنيني (الحرارة المعطل)، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين). كخيار، ويمكن أن يضاف أيضا 5 مل الأمفوتريسين B (250 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B). مطلوب الترشيح العقيمة من هذه الوسائط إذا تم استخدام الكواشف غير معقمة. وضع سم في 37 ° C حمام الماء 30 دقيقة قبل استخدامها لتدفئة المتوسط.
  4. الأواني الزجاجية وبلستيكور معقمة لعزل. الأوتوكلاف كوب 1،000 مل كوب ويترك ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، لديهم استعداد بلستيكور التالية: ماصات المصلية العقيم (5 مل، 10 مل و 25 مل)، و 50 مل أنابيب الطرد المركزي، والأطباق ثقافة تعامل زراعة الأنسجة.

2. عزل ASCS من Lipoaspirates

يتم جمع معظم lipoaspirates في وعاء الطموح (انظر الشكل 1B) ويمكن أن تتألف من ثلاث طبقات متميزة: 1) الطبقة العليا من النفط نتيجة لتحلل الخلايا الشحمية ناضجة، 2) وطبقة وسطى من الأنسجة الدهنية، و3) القاع، غمير السائلة التي تحتوي على المياه المالحة والملوثة أنواع الخلايا مثل خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). طبقة النفط أعلى قد لا تكون موجودة بكميات كبيرة. إذا كان موجودا، وينبغي أن يستنشق أنها التلوث النفطي للثقافة ASC الناتجة يمكن أن تؤثر على بقاء الثقافة. يجب إزالة غمير السفلي قبل تجهيزها للحد من التلوث من الثقافات ASC مع كرات الدم الحمراء. هذا وسوف يغادر الوسط، طبقة الأنسجة الدهنية، والتي سوف ثم غسلها وهضمها لتحرير الخلوية، جزء الأوعية الدموية في انسجة (صندوق التبرعات الخاص) إنزيمي.

  1. غسل lipoaspirate: فتح الحاوية lipoaspirate في زراعة الأنسجة حالعود وصب بعناية lipoaspirate الى العقيمة 1 L زجاج الدورق. السماح للطبقات lipoaspirate لفصل حتى يتم فصل طبقة الأنسجة الدهنية بشكل جيد (الشكل 1B).
    1. نضح قبالة طبقة النفط (إذا كان موجودا) باستخدام معقم، ماصة الزجاج والمالحة غمير السفلي باستخدام 10 مل ماصة المصلية. سيؤدي ذلك إلى إزالة الغالبية العظمى من تلويث خلايا الدم الحمراء والمالحة.
    2. تقييم حجم طبقة الأنسجة الدهنية الناتجة وإضافة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X في حجم مساو. تحريك نضح مع ماصة تستخدم لطموح من أجل خلط lipoaspirate مع برنامج تلفزيوني. تسمح طبقتين لتسوية. كما ذكر أعلاه، فإن برنامج تلفزيوني 1X يمكن أن تستكمل مع المضادات الحيوية / antimycotics.
    3. نضح غمير باستخدام 10 مل ماصة المصلية.
    4. الاستمرار في غسل جزء الأنسجة الدهنية على النحو المبين في الخطوات 2.1.2. و2.1.3. حتى الطبقة الدهنية لديه أصفر / لون الذهب. ال نضحه غمير الماضي مرة واحدة، وترك جزء الأنسجة الدهنية في الدورق الزجاجي. لضمان إزالة كافية من غمير، والسماح للطبقات lipoaspirate لتسوية لمدة 5 دقائق بعد غسل الماضي وقبل تطلع النهائي.
  2. الأنزيمية الهضم من lipoaspirate: تحضير محلول معقم كولاجيناز 1A على النحو المبين أعلاه في وحدة التصفية. إعداد حجم مساوية لجزء الدهنية وتصفية العقيمة.
    1. بعد الترشيح من الحل كولاجيناز، تجاهل وحدة تصفية العلوي، صب بعناية الكسر الدهنية غسلها في حل كولاجيناز ويغلق بإحكام الزجاجة.
    2. وضع خليط كولاجيناز / الدهنية في 37 ° C حمام الماء وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. دوامة بلطف الخليط كولاجيناز / الدهنية كل 5-10 دقيقة ووضع مرة أخرى في حمام مائي. طبقة الأنسجة الدهنية يجب أن تأخذ على "سلاسة" مظهر (الارقام ..ه 1B) أثناء سير عملية الهضم. مرات الهضم إضافية (أي ما يصل الى 2 ساعة) يمكن أن تستخدم إذا كانت طبقة الأنسجة الدهنية لا يزال يبدو أن القطع الصلبة من الدهون داخله.
  3. عزل ASCS: ضع خليط هضمها كولاجيناز / الدهنية مرة أخرى إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تأكد من تعقيم وحدة التصفية مع الايثانول 70٪ قبل وضعها مرة أخرى في مجلس الوزراء.
    1. ماصة 25 مل مأخوذة من غمير تحتوي على صندوق التبرعات الخاص في أنابيب معقمة 50 مل الطرد المركزي.
    2. إضافة 25 مل من CM إلى كل أنبوب. السماح للCM لإبطال نشاط كولاجيناز التي يحتضنها في درجة حرارة الغرفة في مجلس الوزراء لمدة 5 دقائق.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1،200 x ج لجمع صندوق التبرعات الخاص باعتباره بيليه.
    4. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، ونضح طاف من كل أنبوب. ضمان أعلى طبقة النفط ويستنشق أي الخلايا الشحمية العائمة مع هذا طاف ( الشكل 1B).
    5. الجمع بين الكريات صندوق التبرعات الخاص في واحدة باستخدام أنبوب الطرد المركزي 30 مل سم ويقسم بالتساوي على اثنين من جديد 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3.3. ونضح supernatants من اثنين من الكريات صندوق التبرعات الخاص (لا يظهر في الشكل).
      اختياري: إذا كان المطلوب RBC تحلل، في resuspend كل بيليه صندوق التبرعات الخاص في 10 مل من العازلة تحلل RBC (160 ملي NH 4 الكلورين) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3.3. ونضح supernatants لانتاج الكريات صندوق التبرعات الخاص (لا يظهر في الشكل).
    6. الجمع بين اثنين من الكريات صندوق التبرعات الخاص في واحدة أنبوب الطرد المركزي الجديدة باستخدام 5-10 مل سم (الشكل 1B).
    7. لتصفية جزيئات الأنسجة أكبر، ماصة للصندوق التبرعات الخاص بيليه معلق على مرشح شبكة 100 ميكرون وضعت على رأس من جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي والسماح للتصفية حسب تدفق الجاذبية.
    8. ماصة مأخوذة من معلق(وتصفيتها) صندوق التبرعات الخاص بيليه الذي يحتوي على ASCS على الأنسجة ثقافة الأطباق ثقافة المعالجة. تكملة كل طبق مع حجم مناسب من CM.
    9. ثقافة الخلايا في CM لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 دون تغيير من وسائل الإعلام.

بعد هذه الفترة الثقافة الأولية، وسائل الإعلام والثقافة يمكن أن يستنشق وأي تلويث خلايا الدم الحمراء إزالة بلطف بواسطة الغسيل مع 1XPBS العقيمة. استبدال CM ومواصلة ثقافة ASCS حسب الحاجة. سوف نوع الطبق زراعة الأنسجة المستخدمة وكيف يتم تقسيم صندوق التبرعات الخاص بيليه معلق بين هذه الأطباق تعتمد على عدد الخلايا المطلوب التالية زراعة الأنسجة التقليدية.

3. توصيف للسكان ASC: التدفق الخلوي والتمايز Multilineage

مرة واحدة معزولة، يجب أن يتم تنفيذ توصيف السكان ASC. النهج التقليدي لهذا التدفق الخلوي تشملمترى لتوصيف سطح الخلية الشخصي مستضد CD من الخلايا والتمايز في المختبر للتأكد من قدرتها التمايز multilineage. في حين الأنساب متعددة يمكن تقييمها في ASCS، يحدد هذا البروتوكول تمايز ASCS إلى خلايا مكون الشحم، المكونة للعظم والأنساب مكون للغضروف كوسيلة لتأكيد إمكانات أرومية متوسطة multilineage 5.

في المختبر التمايز المتعدد النسب من ASCS

  1. التمايز المكونة للعظم من ASCS: قبل الاستقراء، وإعداد المكونة للعظم متوسطة (OM) على النحو التالي: لواحد زجاجة 500 مل من DMEM (4.5 جم / مل الجلوكوز) إضافة 25.0 مل من FBS (5.0٪ تركيز النهائي) و 5.0 مل من البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية / مل و 10،000 ملغ / مل تركيز النهائي، على التوالي). إلى ذلك، إضافة وكلاء الاستقراء المكونة للعظم التالية لإعطاء تركيزات النهائي المبين: ديكساميثازون (0.1 ميكرومتر النهائي)، L-حمض الاسكوربيك 2 فوسفات (50.0 ميكرومتر النهائي) وβ-جليسروفوسفات (10.0 ملي النهائي).
    1. قبل الاستقراء، والحصاد لوحة للASCS مثقف في طبق زراعة الأنسجة المطلوب بحيث يتم التوصل إلى confluency ما يقرب من 50٪. لكل طبق التجريبية مطلي، لوحة طبق إضافي لعنصر تحكم غير التي يسببها. الثقافة بين عشية وضحاها في CM.
      ملاحظة: ينصح 50٪ confluency من أجل السماح لاستمرار انتشار التي قد تحدث على مدار الاستقراء
    2. في اليوم التعريفي، وإزالة المتوسطة وإضافة ما يلي: OM إلى الآبار التجريبية المكونة للعظم المطلوب وسم إلى آبار المراقبة. فإن حجم الوسائط المستخدمة تعتمد على حجم الطبق زراعة الأنسجة. لمدة 12 الأطباق جيدا، 1.0 مل من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. لمدة 6 أطباق جيدا، 2.0 مل من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. ل100 ملم الأطباق، وينبغي أن تستخدم 10.0 مل من وسائل الإعلام في الطبق.
    3. ثقافة الخلايا مدة لا تقل عن 14 يوما مع التغيرات في المتوسط ​​كل مناسبة 3-4أيام. قد تظهر السكان ASC المكونة للعظم غاية علامات ترسب المعادن خارج الخلية في وقت مبكر من 7 أيام الاستقراء.
    4. قد يتم تأكيد التمايز المكونة للعظم (أي ترسب المعادن خارج الخلية) باستخدام نسيجية وصمة عار فون كوسا للفوسفات الكالسيوم. وهذا وصمة عار تنتج راسب أسود اللون البني تحديد وجود فوسفات الكالسيوم خارج الخلية (انظر الشكل 2).
      وصمة عار مع فون كوسا كاشف:
      1. إزالة OM من الخلايا التجريبية وCM من الخلايا السيطرة
      2. إصلاح الخلايا لمدة 60 دقيقة في بارافورمالدهيد 4.0٪ أعدت في برنامج تلفزيوني 1X.
      3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
      4. احتضان الخلايا مع نترات الفضة 2.0٪ (المعد في الماء) في الظلام لمدة 30 دقيقة.
      5. إزالة نترات الفضة، ويغسل مرتين مع الماء المقطر والهواء الجاف الخلايا.
      6. تعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة لتطوير كالcium راسب الفوسفات.
      7. غسل الخلايا عدة مرات مع 1XPBS.
      8. مباين الخلية مع الهيماتوكسيلين اذا شئت.
  1. التمايز مكون الشحم من ASCS: قبل الاستقراء، وإعداد مكون الشحم المتوسطة (AM) على النحو التالي: لواحد زجاجة 500 مل من DMEM (4.5 جم / مل الجلوكوز) إضافة 50.0 مل من FBS (10.0٪ تركيز النهائي) و 5.0 مل من البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية / مل و 10،000 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي). إلى ذلك، إضافة وكلاء الاستقراء مكون الشحم التالية لإعطاء تركيزات النهائي المبين: ديكساميثازون (1.0 ميكرومتر النهائي)، 3 الاستيوفينون-1-الميثيل (IBMX - 0.5 ملي النهائي)، اندوميثاسين (0.2 ملي النهائي) والانسولين (10.0 ميكرومتر النهائي ).
    1. قبل الاستقراء، والحصاد لوحة للASCS مثقف في طبق زراعة الأنسجة المطلوب بحيث يتم التوصل إلى confluency ما يقرب من 80٪. لكل طبق التجريبية مطلي، إضافة لوحةطبق القاعدة في عنصر تحكم غير التي يسببها. . التمايز مكون الشحم من ASCS يبدو لتكون أكثر كفاءة مع زيادة confluency: الثقافة بين عشية وضحاها في ملاحظة CM.
    2. في اليوم التعريفي، وإزالة المتوسطة وإضافة ما يلي: AM إلى الآبار التجريبية المكونة للعظم المطلوب وسم إلى آبار المراقبة. فإن حجم الوسائط المستخدمة تعتمد على حجم الطبق زراعة الأنسجة. لمدة 12 الأطباق جيدا، 1.0.ml من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. لمدة 6 أطباق جيدا، 2.0 مل من وسائل الإعلام لكل بئر كافية. ل100 ملم الأطباق، وينبغي أن تستخدم 10.0 مل من وسائل الإعلام في الطبق.
    3. ثقافة الخلايا مدة لا تقل عن 14 يوما مع التغييرات المناسبة من المتوسطة كل 3-4 أيام. قد تظهر السكان ASC مكون الشحم غاية بوادر تشكيل فجوة الدهون في وقت مبكر من 7 أيام الاستقراء.
    4. سوف تمر ASCS التمايز مكون الشحم تطوير فجوات الدهون المتعددة التي يمكن تصور بسهولة تحت المجهر الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك، قد تمايز مكون الشحموأكد أن استخدام النفط وصمة عار نسيجية الأحمر O التي سوف تتراكم داخل هذه الفجوات (انظر الشكل 2).
      وصمة عار مع زيت الأحمر O:
      1. إزالة وسائل الإعلام من الخلايا التجريبية والضابطة واصلاحها لمدة 60 دقيقة باستخدام 10٪ تثبيتي الكالسيوم رسمية. لإعداد هذا تثبيتي، والجمع بين ما يلي: 1.0 غرام من الماء و CaCl 2، 25.0 مل 16٪ بارافورمالدهيد (النهائية 4.0٪) و75.0 مل المقطر.
      2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
      3. غسل الخلايا لفترة وجيزة مع الايثانول 70٪.
      4. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع الحل النفط الأحمر O. لإعداد الحل النفط الأحمر O، حل 2.0 غرام زيت الأحمر O مسحوق في 50.0 مل 70٪ من الإيثانول والأسيتون 50.0 مل.
      5. غسل الخلايا مع الايثانول 70٪ وبعد ذلك مع مياه الحنفية.
      6. تصور الخلايا قريبا بعد تلطيخ بسبب يتلاشى من وصمة عار مع مرور الوقت.
  1. التمايز مكون للغضروف من ASCS: ويتحقق التمايز مكون للغضروف من خلال تقنية ثقافة عالية الكثافة ويشار إلى "ثقافة MICROMASS". قبل الثقافة، وإعداد مكون للغضروف متوسطة (CHM) على النحو التالي: لواحد زجاجة 500 مل من DMEM (4.5 جم / مل الجلوكوز) إضافة 5.0 مل من FBS (1٪ تركيز النهائي) و 5.0 مل من البنسلين / الستربتوميسين (10،000 وحدة دولية / مل و10،000 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، على التوالي). إلى ذلك، إضافة وكلاء الاستقراء مكون للغضروف التالية لإعطاء تركيزات النهائي المبين: L-الاسكوربيك-2-الفوسفات (50.0 ميكروغرام / مل النهائي)، الأنسولين (6.25 ميكروغرام / مل النهائي)، ترانسفيرين (6.25 ميكروغرام / مل النهائي) وTGFβ1 (10.0 نانوغرام / مل).
    1. حصاد ASCS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج لخلايا بيليه. عد الخلايا لتحديد كثافة الخلية تعليق.
    2. لإعداد الكريات MICROMASS، وإعداد تعليق خلية اثنين: واحد وقف التجريبية في إعداد آلية تبادل المعلومات في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خليةق / مل واحد وقف السيطرة أعد سم في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل.
      1. وضع 10.0 ميكرولتر "قطرات" لتعليق الخلوية في الآبار الفردية من طبق متعددة جيدا. تسمح الالتزام لمدة 2-3 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      2. تراكب بلطف قطرات مطلية إما آلية تبادل المعلومات أو سم والحرص على عدم فصل الخلايا.
      3. ثقافة الخلايا لمدة تصل إلى 14 يوما في آلية تبادل المعلومات أو سم مع التغيرات في المتوسط ​​كل 3-4 أيام. والخلايا المستزرعة في آلية تبادل المعلومات تتكثف أكثر من هذا الوقت لتشكيل MICROMASS بيليه عالية الكثافة مع قليل من دون الخلايا في أحادي الطبقة المحيطة بها. سوف الخلايا السيطرة مثقف لا الخضوع لهذا التكثيف والعديد من سيتم العثور على أنه أحادي الطبقة.
      4. لتأكيد تكون الغضروف، وتحديد الكريات لمدة 15 دقيقة في بارافورمالدهيد 4.0٪ (المعد في برنامج تلفزيوني 1X) في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار لوجود البروتيوغليكان مكبرت باستخدام الأزرق نسيجية الألسيان صمة عار.
        وصمة عار باستخدام الألسيان الأزرق:
        1. غسل السلطة الفلسطينيةالكريات الثابتة raformaldehyde مرة واحدة في برنامج تلفزيوني 1X.
        2. احتضان الكريات في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 1.0) لمدة 5 دقائق لخفض درجة الحموضة بهم.
        3. إزالة حمض الهيدروكلوريك وإضافة 1٪ كاشف الأزرق الألسيان (المعد في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 1.0). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        4. إزالة كاشف الأزرق الألسيان وغسل الكريات مع حمض الهيدروكلوريك 0.1 N (الرقم الهيدروجيني 1.0) لإزالة وصمة عار الزائدة.
        5. يغسل إضافية باستخدام ماء الصنبور يمكن استخدامها للحد من تلوين الخلفية.
        6. كبديل، يمكن أن تحصد الكريات MICROMASS ثابتة بين عشية وضحاها في 10٪ من الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين والمقاطع الملون لالألسيان الأزرق.

4. تدفق Cytometric توصيف ASCS

توصيف سطح الخلية الشخصي مستضد CD يمكن تحقيقه من خلال التدفق الخلوي التقليدية.

  1. إعداد ASCS عن التدفق الخلوي: قبللتحليل، وإعداد التدفق الخلوي العازلة (FCB) تتألف مما يلي: 1.0٪ BSA، 2.0٪ FBS و0.025٪ سابونين أعدت في برنامج تلفزيوني 1X.
    1. حصاد ASCS وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 1،200 x ج لإنتاج بيليه.
    2. resuspend الخلايا في العقيمة 1XPBS وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تحديد كثافة الخلية من التعليق.
    3. تقسيم التعليق يصل الى aliquots من 5 × 10 5 خلايا الكلي وأجهزة الطرد المركزي لبيليه.
    4. إزالة طاف PBS وإصلاح الخلايا لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مع وجود فائض من الجليد الباردة الايثانول 70٪. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين هذه الخلايا في هذا الايثانول 70٪ في الفريزر -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
    5. بعد التثبيت، نضح بعناية الإيثانول وغسل بلطف بيليه مرتين مع وجود فائض من FCB. لغسل:
      1. إضافة جود فائض من FCB و resuspend بلطف بيليه.
      2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1،200 x ج لجمع خلاياسا بيليه.
      3. نضح بعناية طاف FCB.
      4. تكرار.
    6. إزالة طاف النهائي غسل FCB من كل قسامة وresuspend في 100 ميكرولتر من FCB. إضافة الأجسام المضادة الأولية المطلوب ملون تألقي مترافق باستخدام اقترح التخفيف الشركة المصنعة. احتضان الخلايا على الجليد مع الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: إذا الأجسام المضادة الأولية تألقي مترافق غير متوفرة، ويمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية غير مترافق.
    7. لكل تألقي المستخدمة (مثل FITC، PE)، واحتضان قسامة من الخلايا مع 100 مل تحتوي على الجماعات الحكومية الدولية FCB مطابقة نمط إسوي كعنصر تحكم السلبية.
    8. احتضان قسامة واحدة في 100 مل FCB لا تحتوي على الأجسام المضادة كعنصر تحكم إضافية.
    9. يغسل كل قسامة من الخلايا مرتين مع FCB على النحو المفصل في الخطوة 4.1.5. بعد غسل الماضي، resuspend ومأخوذة في 100 مل من FCB والمضي قدما في تحليل التدفق.
      ملاحظة: إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية غير مترافق: وبعد هذه الخطوة غسل احتضان مأخوذة على الجليد لمدة 20 دقيقة مع FCB تستكمل مع ملون تألقي مترافق الضد الثانوية المناسبة باستخدام اقترح التخفيف الشركة المصنعة. يغسل مرتين على النحو المبين في الخطوة 4.1.5.
  2. تدفق تحليل ASCS: لتحليل تدفق، ينبغي أن يحسب الحد الأدنى من 10،000 الأحداث. الضوابط غير ملوثين ومطابقة نمط إسوي ينبغي أن تستخدم لضبط بوابات بواسطة مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). لذلك، فإن عدم وجود ضوابط الأجسام المضادة (أي غير ملوثين) الخطوة 4.1.8 وينبغي أن تستخدم من أجل القضاء على الحطام وASCS القتلى. الضوابط مفتش مطابقة نمط إسوي الخطوة 4.1.7. وينبغي أن تستخدم لإنشاء مناطق مضان إيجابية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مخطط بروتوكول أعلاه يصف، طريقة الأنزيمية دليل للعزلة من صندوق التبرعات الخاص من عينة كبيرة الحجم lipoaspirate. في هذا SVF العديد من سكان الخلية، بما في ذلك ASC. العديد من الدراسات تقترح أن زراعة هذا صندوق التبرعات الخاص في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية سنختار السكان الليفية تمسكا المرجح أن تتكون أساسا من نوع ASC. واتساقا مع ذلك، لقد أظهرنا، وذلك باستخدام التدفق الخلوي والمناعي، أن الكريات صندوق التبرعات الخاص مثقف تصبح خالية أساسا من الخلايا الكبرى تلويث أنواع، وهي كرات الدم الحم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأنسجة الدهنية لعزل ASCS يمكن أن يأتي في أشكال كثيرة: من قطعة صلبة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من خلال استئصال أو رأب الشحم إلى قطع أصغر الحصول عليها عن طريق إما استخراج حقنة أو بمساعدة شفط رأب الشحم (أي شفط الدهون). ما إذا كان المزيد من الخلايا صندوق التبرعات الخاص (وبالتالي ASCS) يمكن الحصول عليها من العينات الدهنية مقطوعة أو يستنشق غير واضح كما تم عرض الدراسات المتضاربة 16، 17. فمن الممكن أن إما شكل الأنسجة الدهنية أكثر من مناسبة لعزل الخلايا صندوق التب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

واضعو هذه المخطوطة هي المخترعين المشارك على براءة اختراع تمتلكها الحكام من جامعة كاليفورنيا ومرخصة لCytori التداوي.

شكر وتقدير

الكتاب أود أن تقر وأشكر هؤلاء الأفراد البحوث الإضافية التي ساهمت في تطوير بروتوكول صفها وعزلتها من ASCS، بما في ذلك: الدكتور H. بيتر لورنز، دكتوراه في الطب، الدكتور هيروشي Muzuno، دكتوراه في الطب، الدكتور جيري هوانغ، MD الدكتور آدم كاتز، دكتوراه في الطب، والدكتور وليام Futrell، دكتوراه في الطب، الدكتور رونغ تشانغ، DDS، دكتوراه، والدكتور لاريسا رودريجيز، دكتوراه في الطب، الدكتور زيني ألفونسو، دكتوراه، والدكتور جون فريزر، دكتوراه. وقد مولت النتائج المقدمة، في جزء منه، من خلال المنح البحثية المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، بما في ذلك NIAMS ومعاهد NIDCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Reagent
DMEM (Dulbecco&# 8217; s تعديل النسر &# 8217 ؛ s متوسط)Mediatech Cellgro10-013-CVمع 4.5 جم / مل جلوكوز ، L-جلوتامين ، بيروفات الصوديوم
البنسلين / الستربتومايسينMediatech Cellgro30-002-CI10,000 وحدة دولية / مل البنسلين / 10,000 & # 956 ؛ جم / مل ستربتومايسين
أمفوتريسين بميدياتك سيلجرو30-003-CF250 &# 956 ؛ جم / مل أمفوتريسين B
10X PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفو)Mediatech Cellgro25-053-CIبدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم
Trypsin / EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0.25٪ تريبسين / 2.21 ملي مولار EDTA
نوع الكولاجيناز IA (من المطثية هيستوليتيكوم) تحضيرخام سيجماC2674؛ 125 وحدة هضم الكولاجين / ملغ صلب
FBS (مصل الأبقار الجنينية) معطل حرارياGemini Bioproducts100106مصدر وزارة الزراعة الأمريكية ، معطل بالحرارة
10 مل ماصات مصليةGenesee Scientific12-104
25 مل ماصات مصليةGenesee Scientific12-106
50 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلينGenesee Scientific21-106
أطباق زراعة الأنسجة 100 ممGenesee Scientific25-202
أطباق زراعة الأنسجة 150 ممGenesee Scientific25-203
500 مل Stericup Filter UnitsMilliporeSCGPU05REPES غشاء ، 0.22 & # 956 ؛ م
مصافي خليةالمسام FisherBrand22-363-549100 &# 956 ؛ م شبكة نايلون
ديكساميثازون - قابل للذوبان في الماءسيجماD-2915
L-حمض الأسكوربيك 2 فوسفاتسيجماA-8960
& # 946 ؛ - ملح ثنائي الصوديوم جليسيروفوسفات SigmaG-9422المعروف أيضا باسم الأنسولين الجليسرفوسفات
SigmaI-6634المصنوع من البنكرياس البقري
إندوميتاسينSigmaI-7378
apo-transferrinSigmaT-4382
TGF &# 946 ; 1R& D Systems240-B-002بشري مؤتلف
أحمر OSigmaO-0625
Alcian BlueSigmaA-5268
نترات الفضةSigmaS-0319
حمض الهيدروكلوريكفيشر ScientificA144
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4يتم توفيره كمخزون
[header]
شفاط السلامة الحيوية من الفئة الثانية A / Bيضمن غطاءأن غطاء المحرك يحتوي على خطوط فراغ للشفط
الطرد المركزيHermle LabnetZ383الدوار المتأرجح للخارج لأنابيب 50 مل المطلوبة ، قادر على 1200 جرام
حمام مائي فيشر Scientific IsotempS52602Qسعة 5-10 لتر ، قادر على 37 درجة مئوية
مساعدات الماصات الآليةDrummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2< / sub> حاضنةThermo ScientificForma 310حرارة مباشرة أو مغلفة بالماء
زيت بنسبة 16٪< td colspan = "4" ><قوي>المعدات المطلوبة< / قوية> المحرك الحراري العلمي جهاز

المراجع

  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537(2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.