نحن تصف بروتوكول لعزل وتنقية العدلات من نخاع العظم الماوس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة والعدلة لوضع العلامات باستخدام الأصباغ CellTracker. وهذا يمثل طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه واقتصادية من أجل الحصول على أعداد كبيرة من العدلات للدراسات وظيفية المصب أو نقل وتتبع التجارب بالتبني.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العدلات هي خلايا المستجيب الحرجة من نظام المناعة الفطرية. يتم تجنيدهم بسرعة في مواقع الالتهاب الحاد وبذل آثار وقائية أو المسببة للأمراض اعتمادا على الوسط التهابات. ومع ذلك، على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في الحصانة، فهم مفصل من العوامل الجزيئية التي تتوسط الآثار العدلات 'المستجيب وimmunopathogenic في الأمراض المعدية المختلفة والحالات الالتهابية لا يزال غير موجود، وذلك جزئيا بسبب وضعهم قصيرة نصف الحياة، وصعوبات في التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق بها للحصول على أعداد كافية من العدلات للدراسات وظيفية المصب وتجارب نقل بالتبني. ولذلك، طرق بسيطة وسريعة واقتصادية وموثوق بها، مطلوبة بكثرة لحصاد أعداد كافية من العدلات الماوس لتقييم وظائف مثل البلعمة والقتل، خلوى الإنتاج، وتحبب والاتجار بها. وتحقيقا لهذه الغاية،نقدم كثافة بروتوكول التدرج استنساخه القائم على الطرد المركزي، والتي يمكن تكييفها في أي مختبر لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وقدرتها على البقاء. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم بروتوكول بسيط يستخدم الأصباغ CellTracker لتسمية العدلات المعزولة، والتي يمكن بعد ذلك يتم نقل adoptively في الفئران المتلقية وتعقبها في العديد من الأنسجة لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل باستخدام التدفق الخلوي. باستخدام هذا النهج، ووضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص مع الأصباغ CellTracker مختلفة يمكن استخدامها بنجاح لإجراء دراسات إعادة تعمير تنافسية لتقييم الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الأنسجة المستهدفة في الجسم الحي .
المقدمة
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر. هم المكون الرئيسي الخلوية في الجهاز المناعي الفطري ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة ونقص المناعة الأولية التي تؤثر على أعداد العدلات و / أو وظيفة تطوير التهابات الغازية التي تهدد الحياة البكتيرية والفطرية، وتسليط الضوء على أهمية هذه الخلايا في الدفاع المضيف 1. الاعتراف المناعي للغزو مسببات الأمراض في موقع الإصابة بهم وما شابه ذلك نمط الاعتراف مستقبلات النتائج في الاستقراء لمدبرة الاستجابة المناعية الفطرية، الأمر الذي يؤدي إلى إفراز chemoattractants التي تولد التدرج الكيميائي قادرة على تجنيد العدلات من....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. العزلة من الفأر نخاع العظم والخلايا
- الموت ببطء الفئران باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان المؤسسة اللجنة وافقت عليها وترش على سطح الحيوان مع الايثانول 70٪.
- إجراء شق في الجلد في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء القاصي من الفأرة بما في ذلك الجلد الذي يغطي السفلية.
- قطع العضلات من السفلية باستخدام مقص وخلخل بعناية لحق من مفصل الورك، مع تجنب كسر عظم الفخذ رئيس.
- إزالة العضلات المتبقية من عظم الفخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هو الأمثل هذا البروتوكول بالنسبة للمحصول من خلايا نخاع العظام من الفئران وفصل لاحق من العدلات من هذه الخلايا بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام المتاحة تجاريا وسائل الاعلام فصل الخلية Histopaque. عزل العدلات باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من المصب دراسات وظيفية خارج الحي وللتجارب نقل بالتبني في الفئران المتلقية.
العائد نموذجي من مجموعة من خلايا نخاع العظام من عظام الفخذ وال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم بروتوكول موثوق بها، بسيطة، سريعة واقتصادية لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وجدوى استخدام نهج الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، يمكن استردادها ~ 6-12 × 10 6 العدلات من الماوس المعافين وما يصل الى ~ 30-40 × 10 6 العدلات قد تكون معزولة عن ماوس بعد الإصابة 6. العدلات معزولة هي 80-95٪ نقية و> 95٪ قابلة للحياة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل شعبة بحوث جماعية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID)، المعهد الوطني للصحة (NIH)، الولايات المتحدة الأمريكية.
تم الحفاظ على جميع الفئران في رابطة الأمريكية لاعتماد المختبرات العناية المعتمدة مرفق الحيوان الحيوان في المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) ويضم وفقا للإجراءات المبينة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية تحت رعاية بروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من المعدية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>الكواشف < / strong> | |||
| RPMI 1640 1X مع L-glutamine و 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | & nbsp ؛ |
| مصل الأبقار الجنيني (معطل حراريا) | GemCell | 100500 | |
| البنسلين / الستربتومايسين (10,000 وحدة البنسلين / 10,000 مجم / مل البكتيريا) | GIBCO | 15140 | ؛ |
| 0.5 م EDTA | الجودة البيولوجية | 351-027-101 | |
| 0.2٪ و 1.6٪ كلوريد الصوديوم | JT Baker | 3624 | محاليل كلوريد الصوديوم المحضرة باستخدام الماء المقطر والمصفى المعقم |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 يجب إحضاره إلى 18-26 درجة ؛ C قبل الاستخدام |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 إلى 18-26 درجة ؛ C قبل الاستخدام |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم | Cellgro | 210-40-CV | & nbsp ؛ |
| الكحول الإيثيلي (200 برهان) | شركة وارنر جراهام | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA ، 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | صنع حلول مخزون من 10 ملي مولار في DMSO ، وتخزينها عند -80 درجة ؛ C |
| CellTracker Orange (CMTMR ، 5- (و 6) -4-كلورو ميثيل بنزويل أمينو تتراميثيلرودامين) | Invitrogen | C-2927 | صنع محاليل مخزون من 10 ملي مولار في DMSO ، aliquot وتخزينها عند -80 درجة ؛ C |
| مكافحة الفأر CD45 (استنساخ 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| مضاد للفأر Ly6G (استنساخ 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| مضاد للفأر Ly6G (استنساخ 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| مكافحة الفأر CD11b (استنساخ M1 / 70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| مضاد للفأر CD16 / CD32 (كتلة الماوس BD FC) BD | Pharmingen | 553141 | الاستخدام عند 1: 100 التخفيف |
| LIVE / DEAD Fixable Blue Dead Dead Stain | Kit المجسات الجزيئية | L-23105 | استخدم عند 1: 1000 تخفيف |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | ؛ |
| محلول بارافورمالدهايد ، 4٪ في PBS | USB Corporation | 19943 | ؛ |
| <قوي>الجدول 1. الكواشف لعزل ووضع العلامات وتتبع العدلات المنقولة بالتبني. | |||
| Materials | |||
| C57BL / 6 فئران | Taconic | ||
| أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل Corning | 430053 | ||
| الطرد المركزي سعة 50 مل | BD Falcon | 352070 | |
| 25 مل ماصات مصلية | Celltreat | 229225B | |
| 10 مل ماصات مصلية | Celltreat | 229210B | |
| 5 مل ماصات مصلية | Celltreat | 229205B | |
| ماصات باستور (3 مل) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 مل محاقن | كيندال مونوجيكت | 512878 | |
| 25 جم × 5/8 بوصة. الإبر (إبر انزلاق دقيقة) | BD | 305122 | |
| مصافي خلية 100 مم | BD Falcon | 352360 | ؛ |
| أطباق بتري مبيد للجراثيم | BD Falcon | 351029 | |
| كومبيتبس بلس بيوبور | إيبندورف | 2249608-5 | |
| أدوات تشريح الفأر (مقص ، ملقط ، مشرط) أدوات | البحوث الطبية الحيوية | 10-2300 ، 10-2165 ، 25-1200 ، 26-1000 | أدوات معقمة قبل الاستخدام |
| ؛ | <قوي > المعدات < / قوي > | ||
| غطاء ثقافة الأنسجة | شركة بيكر | SG403 | ؛ |
| أجهزة الطرد المركزي المبردة | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 درجة ؛ C يهتز حمام الماء | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| <قوي>الجدول 2. قائمة المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. |
المراجع
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
