نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواقع محددة من التعديل bioorthogonal GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو التحقيق الفلورسنت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للG-البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) يشير المجمعات، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتقديم تحقيقات إعلامية أو التسميات في المستقبلات التي أعرب عنها التي لا التشويش على وظيفة مستقبلات. كنا العنبر التكنولوجيا رامزة لقمع وراثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في العديد من المناصب المستهدفة في GPCRs أعرب heterologously في خلايا الثدييات. ويتضح براعة المجموعة azido هنا في التطبيقات المختلفة لدراسة GPCRs في البيئة الخلوية المحلية أو في ظل ظروف solubilized المنظفات. الأولى، ونحن يبرهن على وجود خلية مقرها استهداف التكنولوجيا photocrosslinking لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من حيث النوع من الاختزال crosslinked صغيرة جزيء يجند المسمى التريتيوم لترميز وراثيا حمض azido الأمينية. نحن ثم إثبات التعديل في مواقع محددة من GPCRs من قبل bioorthogonal شتاودينغر-Bertozzi ربط REACنشوئها يستهدف مجموعة azido باستخدام المشتقات الفوسفين. نناقش استراتيجية عامة لاستهداف علامات الببتيد حاتمة للبروتينات غشاء أعرب في الثقافة والكشف عنها باستخدام نهج يستند ELISA خلية كاملة. أخيرا، وتبين لنا أن AZF-GPCRs يمكن الموسومة بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. المنهجيات التي تمت مناقشتها هي عامة، في أن يتمكنوا من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي موقف الأحماض الأمينية في أي أعربت النوع من الاختزال لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.
المقدمة
تشمل Heptahelical G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) والفصيلة من البروتينات الغشاء ديناميكية للغاية التي تتوسط إشارات خارج الخلية الهامة والمتنوعة. في النموذج الكلاسيكي، ويقترن تنشيط مستقبلات مع التغيرات متعلق بتكوين التي يسببها يجند. 1، 2 وقد وفرت التطورات الأخيرة في علم الأحياء الهيكلي للGPCRs البصيرة كبير على الآليات الجزيئية للإشارات عبر الغشاء. 3-5 ومع ذلك، ولكي نفهم بدقة أكبر الكيميائية آلية الوظيفية والهيكلية للديناميات النوع من الاختزال الإشارات، لا بد من أدوات نهج لدمج تحقيقات الجزيئية والكيميائية بالمعلومات لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التأسيس الوراثية موقع معين من الأحماض الأمينية غير طبيعي في GPCRs
- الحفاظ على خلايا HEK293T في DMEM (4.5 غرام / لتر من الجلوكوز، 2 مم الجلوتامين) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- بالنقل الخلايا نمت لالتقاء 60-80٪ في لوحة 10 سم باستخدام Lipofectamine زائد كاشف.
- إلى 750 ميكرولتر DMEM، إضافة 10 ميكرولتر كاشف زائد، 3.5 ميكروغرام من [كدنا] النوع من ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدمنا منهجية الطفرات الأحماض الأمينية غير طبيعي للموقع تحديدا تقديم تحقيقات الجزيئية إلى النوع من الاختزال باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. المخطط في الشكل 1 يحدد الخطوات البارزة لمنهجية وتطبيقات مختلفة من دمج UAA تنوعا، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف)، في GPCRs. التعبير عن AZF-GPCRs في خلايا الثدييات تمكن استهدفت photocrosslinking إلى بروابط، وتستهدف وضع علامات الببتيد حاتمة أو تعديلات لفلوري النوع من الاختزال كيمياء عبر وضع العلامات bioor.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا وصف منهجية قوية لإدراجها في مواقع محددة من التحقيق على رد الفعل، ايه زد اف، في GPCRs وإظهار ثلاثة تطبيقات مفيدة من هذه الأداة لدراسة بنية وديناميات GPCRs. لدينا وسيلة لموقع تحديدا دمج UAAs تلتف مشكلة أساسية مع استراتيجية بديلة تقوم على وصفها كيميائيا 32، 33 أو ربط photocrosslinkers 34 إلى واحد يمكن الوصول إليها متحولة السيستين. وعلى الرغم من كيمياء التي تستهدف مجموعات ثيول السيستين استخدمت لنعلق تحقيقات الفلورسنت، ومثل هذه الاستراتيجية يتطلب توليد خلف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر الدعم السخي من العديد من المؤسسات والجهات المانحة الخيرية (انظر SakmarLab.org).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البلازميد pSVB. يام | (Ye et al< / em>.، 2008) | ||
| البلازميد pcDNA.RS ل azF | (Ye et al.< / em> ، 2009) | ||
| البلازميدات pMT4.Rho و pcDNA 3.1.CCR5 | تحتوي اختياريا على كودون الإيقاف الكهرماني (TAG) في الموضع المطلوب | ||
| خلايا | الخلايا الملتصقة | ||
| وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| فوسفات مخزن محلول ملحي | Gibco | 14200 | ؛ |
| مصل الأبقار | الجنين الجوزاء المنتجات الحيوية | 100-106 | ؛ |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 | |
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| <قوي>الجدول 1.< / قوي> الدمج الجيني الخاص بالموقع للأحماض الأمينية غير الطبيعية في مواد GPCRs | |||
| يتم تنشيط مصباح Maxima ML-3500S UV-A | Spectronics Corporation | azF بواسطة محلول | |
| الملح المخزن هانك (HBSS) | Gibco | 14065 | & nbsp ؛ |
| هيبس | إيرفين العلمية | 9319 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Roche | 3117405001 | |
| المسمى التريتيوم | من المتعاون (Grunbeck et al.< / em> ، 2012) | ||
| 1٪ (وزن / حجم) n-dodecyl-& beta ؛ -D-maltoside | Anatrace | D310LA& | nbsp ؛ |
| 1D4-sepharose | 1D4 mAb يجمد على راتنج السيفاروز المنشط CNBr 2B | ||
| 1٪ (وزن / حجم) كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | فيشر Scientific | BP166 | ؛ |
| NuPAGE Novex 4 - 12٪ من المواد الهلامية SDS | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE التي تم إجراؤها على جهاز NuPAGE |
| Trans-Blot SD | Biorad | للنقل شبه الجاف | |
| غشاء Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | |
| الحليب الخالي من الدسم | فيشر Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | التلألؤ السائل |
| التلألؤ | فيشر Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta عداد التلألؤ السائل | Perkin Elmer | عداد بيتا التلألؤ | |
| المضاد للرودوبسين 1D4 mAb | المركز الوطني لثقافة الخلايا | مخصص | |
| بيروكسيداز الفجل (HRP) المترافق المضاد للفأر IgG | KPL، Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR فيلم | Denville | E3018 | |
| <قوي>الجدول 2. مواد التشابك الضوئي المستهدفة | |||
| 0.25٪ Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| مضاد CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| بولي د-ليسين | سيجما | P6407 | ؛ |
| 96-بئر لوحة | كوستار | 3601 | قاع واضح, عالية الارتباط EIA / RIA |
| الفوسفات مخزن المحلول الملحي (الكالسيوم, المغنيسيوم) | Gibco | 14040 | |
| 16٪ بارافورمالدهيد | EMS | 28908 | ؛ |
| KPL | المترافقة ب HRP | 474-1516 | |
| مكافحة الأرانب IgG | KPL، Inc. | 474-1516 | |
| Amplex الأحمر | Invitrogen | A12222& | nbsp; |
| بيروكسيد الهيدروجين | DE منتجات الرعاية الصحية | 97-93399 | ؛ |
| قارئ لوحة متعدد الآبار CytoFluor II | Perseptive Biosystems | ||
| <قوي>الجدول 3.< / قوي> وضع علامات الببتيد والحاتمة المستهدفة ومواد ELISA سطح الخلية | |||
| الفلورسين الفوسفين | (Huber et al.< / em> ، تم تقديمه 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 الببتيد) | AnaSpec | 62190 | الببتيد الذي يحاكي 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1٪ (وزن / حجم) n-dodecyl-& beta ؛ -D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose | 1D4 mAb يجمد على راتنج السيفاروز 2B المنشط CNBr | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12٪ المواد الهلامية SDS | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE التي تم إجراؤها على جهاز NuPAGE |
| ماسح ضوئي مضان Confocal Typhoon 9400 | الماسح الضوئي GE Healthcare | مع ليزر بطول موجي 488 نانومتر | |
| ؛ | <قوي>الجدول 4. مواد وضع العلامات < / قوية > الفلورسنت |
المراجع
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
