مقالة منهجية

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

14.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50588

⸱

سبتمبر 13, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Chemical Biology and Signal Transduction, The Rockefeller University

في هذه المقالة

ملخص

نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواقع محددة من التعديل bioorthogonal GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو التحقيق الفلورسنت.

الملخص

لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للG-البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) يشير المجمعات، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتقديم تحقيقات إعلامية أو التسميات في المستقبلات التي أعرب عنها التي لا التشويش على وظيفة مستقبلات. كنا العنبر التكنولوجيا رامزة لقمع وراثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في العديد من المناصب المستهدفة في GPCRs أعرب heterologously في خلايا الثدييات. ويتضح براعة المجموعة azido هنا في التطبيقات المختلفة لدراسة GPCRs في البيئة الخلوية المحلية أو في ظل ظروف solubilized المنظفات. الأولى، ونحن يبرهن على وجود خلية مقرها استهداف التكنولوجيا photocrosslinking لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من حيث النوع من الاختزال crosslinked صغيرة جزيء يجند المسمى التريتيوم لترميز وراثيا حمض azido الأمينية. نحن ثم إثبات التعديل في مواقع محددة من GPCRs من قبل bioorthogonal شتاودينغر-Bertozzi ربط REACنشوئها يستهدف مجموعة azido باستخدام المشتقات الفوسفين. نناقش استراتيجية عامة لاستهداف علامات الببتيد حاتمة للبروتينات غشاء أعرب في الثقافة والكشف عنها باستخدام نهج يستند ELISA خلية كاملة. أخيرا، وتبين لنا أن AZF-GPCRs يمكن الموسومة بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. المنهجيات التي تمت مناقشتها هي عامة، في أن يتمكنوا من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي موقف الأحماض الأمينية في أي أعربت النوع من الاختزال لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.

المقدمة

تشمل Heptahelical G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) والفصيلة من البروتينات الغشاء ديناميكية للغاية التي تتوسط إشارات خارج الخلية الهامة والمتنوعة. في النموذج الكلاسيكي، ويقترن تنشيط مستقبلات مع التغيرات متعلق بتكوين التي يسببها يجند. 1، 2 وقد وفرت التطورات الأخيرة في علم الأحياء الهيكلي للGPCRs البصيرة كبير على الآليات الجزيئية للإشارات عبر الغشاء. 3-5 ومع ذلك، ولكي نفهم بدقة أكبر الكيميائية آلية الوظيفية والهيكلية للديناميات النوع من الاختزال الإشارات، لا بد من أدوات نهج لدمج تحقيقات الجزيئية والكيميائية بالمعلومات لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.

تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تكييفها طريقة لموقع تحديدا إدخال غير الحكومية أو الحد الأدنى تحقيقات إقلاق إلى المستقبلات التي أعرب عنها على أساس الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAA) الطفرات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع رائدة من قبل شولتز وجoworkers. 6 ونحن الأمثل منهجية الطفرات UAA لتحقيق التعبير ذات الإنتاجية العالية ونظام الطفرات للبروتينات مثل GPCRs، التي يصعب التعبير عنها في أكثر الأنظمة الأخرى مغاير من خلايا الثدييات. باستخدام القامع المهندسة متعامد الحمض الريبي النووي النقال وتطورت أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال الزوج مخلقة لUAA محددة، قدمنا ​​موقع UAAs تحديدا في GPCRs الهدف التعبير عنها. إدماج الناجح لUAAs، ف الاسيتيل-L-ألانين (ACF)، فقد ثبت ف بيروكسايد-L-ألانين (BzF)، وف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في GPCRs نموذجنا - رودوبسين والبشرية CC مستقبلات chemokine، CCR5. 7، 8

من حيث المبدأ، وهي UAA يمكن ترميز وراثيا في أي موقف داخل تسلسل البروتين وهذه الخاصية هي أداة لا تقدر بثمن البيوكيميائية، لأنها تتيح احد كودون مسح وGPCR الهدف. ونحن نركز هنا على وجه التحديد على براعة من UAA، ايه زد اف، التي لديها رد الفعل عزيالقيام شاردة. بالإضافة إلى بمثابة الأشعة تحت الحمراء (IR) التحقيق فريدة من نوعها، 8، 9 ايه زد اف يمكن أيضا أن تكون بمثابة photoactivatable عبر رابط نتيجة للتفاعل مع الأمينات الأولية المجاورة أو الهيدروجين الأليفاتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجموعة azido خاملة بيولوجيا المشاركة بصفة انتقائية مقبض الكيميائية في التفاعلات وضع العلامات bioorthogonal. نحن هنا تقديم أمثلة توضح التطبيقات المفيدة التأسيس في مواقع محددة من AZF في GPCRs، مثل photocrosslinking تستهدف فخ مجمع مستقبلات يجند، وتعديل GPCRs بواسطة bioorthogonal علامات حاتمة واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية.

وقد استخدمت الكواشف Photoactivatable لدراسة النظم البيولوجية منذ 1960s. (10) وفي هذه الفترة، تم الإبلاغ عن وفرة من التجارب يشابك مستقبلات يجند لدراسة المجمعات النوع من الاختزال، ومعظمها ينطوي على استخدام بروابط photoaffinity 11، 12 ومع ذلك، فإن هذه تطبيقات تقتصر من الناحية الفنية، لأنها تحتاج اليهاالتوليف (ه) من بروابط تحمل مجموعة يشابك. 13-15 وعلاوة على ذلك، مع شاردة crosslinker في يجند، فإنه يمثل تحديا لتحديد موقع تشعبي على النوع من الاختزال. إدخال موقع تحديدا الجماعات photocrosslinking كما UAAs إلى بروتينات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع هو النهوض قيمة 16، 17 طورنا تقنية photocrosslinking التعرف على واجهة ملزمة للمستقبلات التي تشارك في تشكيل مجمع مستقبلات يجند في الخلايا الحية من خلال إدخال مجموعات عطوب بالضوء في GPCRs 18، 19 نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي وطريقة تحليل البيانات لتطبيق هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد موقع ملزمة ليجند جزيء صغير، maraviroc معالج بالتريتيوم، على CCR5. تستفيد هذه الطريقة على تقدير دقيق للمقبض المشعة على يجند، بالإضافة إلى الإبقاء على التركيبة الكيميائية الأم ليجند.

التقنيات المعتمدة مضان دعم فهم دقيق لأساس الهيكلية للتنشيط مستقبلات عن طريق التحقيق مباشرة بتكوين الدولة من مستقبلات 20، 21 ومع ذلك، وتقنيات امتلاك المرونة اللازمة لإدخال العلامات الفلورية في GPCRs هي موقع على وجه التحديد محدودة. ونحن مهتمون في توظيف استراتيجيات التعديل الكيميائي لتيسير كشف bioorthogonal واحدة جزيء (SMD) من النوع من الاختزال المجمعات الإشارة. يمكن 22 المجموعة azido المشاركة في كيمياء bioorthogonal مثل شتاودينغر-Bertozzi ربط، 23، 24 خالية من النحاس وروجت سلالة أزيد- إضافة حلقية آلكاين (SpAAC) 25 والمحفزة النحاس وأزيد آلكاين إضافة حلقية (CuAAC) 26 ونحن نركز هنا على ربط رد فعل شتاودينغر-Bertozzi التي تنطوي على ردة فعل معينة بين أزيد والفوسفين. ونحن لشرح استخدام اثنين من المشتقات الفوسفين مختلفة، مترافق إلى حاتمة الببتيد (FLAG الببتيد) أو تسمية الفلورسنت(فلوريسئين) لتحقيق تعديل في مواقع محددة من GPCRs.

نحن الأمثل سابقا الظروف لوضع العلامات الخاصة بكل موقع من رودوبسين ايه زد اف المتغيرات باستخدام التركيب البلوري للأشعة السينية والمحاكاة الديناميكية لاختيار المواقع المستهدفة التي هي المذيبات يتعرض 27، 28 ونحن أيضا يتضح جدوى لتحقيق وضع العلامات خالية من الخلفية بواسطة شتاودينغر- Bertozzi ربط 29 نظهر هنا للإجراءات العامة المستخدمة لتحقيق وضع العلامات الفلورية من مستقبلات المنظفات solubilized الذي يجمد على مصفوفة immunoaffinity وبعد ذلك تصور من قبل مضان في هلام. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن على تمديد مفيدة عن هذه الاستراتيجية ووضع العلامات لتحديد مواقف قابلة للوضع العلامات على مستقبلات الهيكل غير معروف، CCR5. ويتم ذلك من يستخدم إستراتيجية علامات الببتيد حاتمة المستهدفة التي تعتمد على تعديل bioorthogonal من AZF-النوع من الاختزال المتغيرات في شكل شبه عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا. هذا 30طريقة يستغل متعددة الخطوات خصائص الكشف عن ELISA سطح الخلية لرصد الأحداث ووضع العلامات.

المنهجيات نناقش هنا هي عامة ومن حيث المبدأ يمكن تطبيقه على أي النوع من الاختزال تدمج مع ايه زد اف باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. في البروتوكولات المعروضة هنا نحن بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير خلايا الثدييات مستقبلات تدمج مع UAAs مثل ايه زد اف باستخدام طريقة غير طبيعية من الأحماض الأمينية الطفرات وتطبيقاتها اللاحقة لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للGPCRs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التأسيس الوراثية موقع معين من الأحماض الأمينية غير طبيعي في GPCRs

  1. الحفاظ على خلايا HEK293T في DMEM (4.5 غرام / لتر من الجلوكوز، 2 مم الجلوتامين) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  2. بالنقل الخلايا نمت لالتقاء 60-80٪ في لوحة 10 سم باستخدام Lipofectamine زائد كاشف.
    1. إلى 750 ميكرولتر DMEM، إضافة 10 ميكرولتر كاشف زائد، 3.5 ميكروغرام من [كدنا] النوع من الاختزال (pMT4. رو أو pcDNA 3.1. CCR5) التي تحتوي على العنبر وقف رامزة في الموضع المطلوب، 3.5 ميكروغرام من الحمض الريبي النووي النقال القامع كدنا] (pSVB.Yam) و 0.35 ميكروغرام من متحولة الأمينية أسيل الحمض الريبي النووي النقال مخلقة [كدنا] لف azido-L-ألانين (pcDNA.RS). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أداء أيضا ترنسفكأيشن مماثلة باستخدام وزن النوع من الاختزال كدنا] (لا تحتوي على وقف كودون العنبر) لتكون بمثابة السيطرة. إضافة هذا الخليط إلى 750 ميكرولتر من DMEM مع 17 ميكرولتر Lipofectamine. بعد توازنه 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجلبالحجم الإجمالي إلى 4 مل.
    2. تطبيق وسائل الاعلام نضح في 10 سم لوحة، وخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا، والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. بعد 4-6 ساعة، تكملة الخلايا مع 4 مل DMEM تحتوي على 20٪ FBS و 1 ملي ايه زد اف.
  3. في اليوم التالي، واستبدال وسائط النمو مع DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف.
  4. خلايا الحصاد 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لتحليل التعبير أو الشروع في إجراءات photocrosslinking أو وضع العلامات الموضحة في المقاطع التالية.
    1. تأكيد التعبير عن العنبر متحولة النوع من الاختزال في وجود UAA في وسائل الإعلام النمو. ونحن نفعل ذلك من خلال الكشف طخة مناعية الغربية. ليز بيليه خلية في 1٪ (ث / ت) دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 XG وطاف حل في إطار الحد من الظروف التي كتبها SDS-PAGE. نقل إلى غشاء PVDF وإجراء تحليل لطخة مناعية للكشف عن كامل طول مستقبلات التعبير باستخدام ال31 ه 1D4 خريطة موقع (مركز زراعة الخلايا الوطني)، الذي يعترف حاتمة هندسيا في C-محطة من مستقبلات.

2. تعيين موقع ملزم يجند طريق المستهدفة Photocrosslinking

  1. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ووسائل الإعلام نضح من الخلايا واستبدالها مع 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). العودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. resuspend الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى أنبوب فالكون. أجهزة الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة لخلايا بيليه ونضح طاف.
  3. resuspend الكرية خلية في التخزين المؤقت محلول الملح 1X هانك تحتوي على 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 0.2٪ BSA ويجند معالج بالتريتيوم في تشبع تركيز ملزمة لطول المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لضمان تشكيل مستقبلات يجند المعقدة.
  4. نقل تعليق خلية إلى 24 أو 96 جيدا جيدا لوحة لتنشيط ضوئي من 365 نانومتر في ايه زد اف (مثل استخدام الأشعة فوق البنفسجية مصباح) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. Maintaiن لوحة على الجليد لتجنب التدفئة العينة وتحلل الخلية.
  5. نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف، أجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه، وإزالة طاف، والشروع في التحليل. ويمكن تخزين الكريات في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  6. resuspend والكريات خلية في تحلل العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DDM، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 ومثبطات الأنزيم البروتيني. بعد حضانة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي المحللة خلية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج، ونقل طاف لأنبوب جديد.
  7. إضافة خريطة موقع 1D4-2B sepharose و الراتنج لطاف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لimmunopurify النوع من الاختزال باستخدام المهندسة C-محطة 1D4 خريطة موقع حاتمة. اليوم التالي تغسل حبات عدة مرات مع العازلة تحلل. عينات أزل مع 1٪ SDS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع اهتزاز.
  8. نقل جزء من شاطف إلى 15 مل قارورة تحتوي على السائل التلألؤ والاعتماد على عداد التلألؤ بيتا لقياس كمية ملزمة محددة من يجند معالج بالتريتيوم إلى عشرةه مستقبلات.
  9. حل المتبقية 1D4 ماب شاطف تنقيته بواسطة معيار الكهربائي للهلام. نستخدم 4-12٪ هلام SDS-PAGE ثم نقل شبه جافة لغشاء PVDF لimmunoblotting. نحن تشمل أيضا حارة مع معيار البروتين سلم لتوجيه التقريب البصري من الوزن الجزيئي.
    1. منع غشاء PVDF مع الحليب 5٪ في المخزن TBS تحتوي على 0.05٪ توين 20. بحث الغشاء لتأكيد كامل طول مستقبلات التعبير مع 1D4 ماب تليها HRP، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية.
    2. علاج مع تعزيز لمعان كيميائي (ECL) كاشف وفضح غشاء لتصوير الإشعاع الذاتي لتصور فيلم العصابات.
  10. قطع الغشاء بشفرة حلاقة لفصل كل حارة العينة، تليها قطع عند علامات محددة الوزن الجزيئي. نقل شرائح الغشاء إلى قارورة تحتوي على السائل التلألؤ. تحديد كمية التريتيوم في كل جزء الغشاء عن طريق عد على عداد بيتا التلألؤ.
  11. تحديد إيجابيةphotocrosslink مع الكشف عن التريتيوم في الكتلة الجزيئية واضح يساوي مجموع تلك من النوع من الاختزال ويجند.

3. استهدفت توصيف حاتمة وخلية السطح انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)

  1. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع 1 مل برنامج تلفزيوني 1X ويعرض للتريبسين مع 1 مل 0.25٪ التربسين لمدة 3 دقائق. تكملة مع 9 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف. الخلايا resuspend وحساب كثافة الخلية. نستخدم عدادة الكريات القياسية.
  2. قبل علاج، واضحة من أسفل لوحة 96 جيدا عالية ملزم مع 100 مل من 0.01 ملغ / مل بولي-D-يسين لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرارا مع برنامج تلفزيوني 1X والهواء الجاف.
  3. لوحة 200 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في مناطق ذات كثافة من 6 × 04 حتي 08 أكتوبر × 10 4 خلية / جيدا لوحة 96 جيدا والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  4. اليوم التالي إعداد الخلايا لوصفها. بلطف يغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / جيد برنامج تلفزيوني 1X رس إزالة أي ايه زد اف تحتوي على وسائط النمو. ضمان بقاء الخلايا الالتزام، على سبيل المثال، باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم 2 + 2 + والمغنيسيوم.
  5. إعداد 50-200 ميكرومتر FLAG-triarylphosphine وضع العلامات الكاشف في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني من مخزون الحفاظ على 5-20 ملم في برنامج تلفزيوني. تطبيق 60 مل إلى كل بئر (في ثلاث نسخ لكل متحولة العنبر) والعودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات. الحفاظ على مجموعة من الآبار دون علاج التسمية في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني. وتشمل أيضا التحكم بالوزن النوع من الاختزال للمقارنة مع المتغيرات AZF-النوع من الاختزال.
  6. غسل الخلايا 3 مرات مع 100 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة، BB (1X PBS، 0.5٪ BSA)، لإزالة التسمية غير المتفاعل تماما.
  7. تطبيق 100 ميكرولتر / جيد من 4٪ بارافورمالدهيد (أعدت من الأسهم 16٪ في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات مع BB.
  8. تنفيذ معيار بروتوكول ELISA سطح الخلية للكشف عن مستقبلات مستقبلات صفت والتعبير. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ل1.5 ساعة على الجليد تليها الثانويةالحضانة tibody في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة FLAG M2 الأجسام المضادة (مثل 1:2،000 التخفيف من الأجسام المضادة المحرز في BB) للكشف عن FLAG الببتيد حاتمة من FLAG-triarylphosphine وضع العلامات كاشف. كما بحث غير تسمية الآبار تعامل على أنها سيطرة سلبية. إضافة لمكافحة CCR5 2D7 (نستخدم 1:500 تمييع) الأجسام المضادة لمجموعة منفصلة من الآبار لتحديد وزن أو AZF-النوع من الاختزال التعبير سطح الخلية.
    2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع BB، واحتضان مع 100 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية (1:2،000 التخفيف).
    3. غسل خلايا بعناية خمس مرات مع BB. إضافة 50 ميكرولتر العازلة الكشف: Amplex الأحمر، 20 ملي H 2 O 2، برنامج تلفزيوني 1X (نسبة 1:10:90)، واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع البيانات الطيفية على مضان متعددة كذلك قارئ لوحة في السابق λ = 530 م وλ = 590.

4. Bioorthogonal الفلورسنت وصفها من GPCR

  1. ليز10 7 خلايا تحصد معربا عن بالوزن أو AZF-رودوبسين المتغيرات في 1 مل الانحلالية العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DM، 50 ملي HEPES أو تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 مم CaCl 2 ومثبطات الأنزيم البروتيني ل1 ساعة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة، وجمع الكسر طاف.
  2. إضافة 100 ميكرولتر 1D4-MAB الراتنج sepharose و 2B لالتقاط مستقبلات باستخدام المهندسة C محطة 1D4 حاتمة. احتضان لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل الراتنج ثلاث مرات مع 0.1٪ (ث / ت) في DDM 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.3.
  3. إضافة 0.1 ملي فلوريسئين-الفوسفين في إجمالي حجم 0،3-0،5 مل لتسمية مستقبلات يجمد على مصفوفة immunoaffinity (1D4-MAB sepharose و 2B). احتضان لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي وإزالة طاف. غسل الراتنج لإزالة التسمية غير المتفاعل.
  4. أزل مستقبلات المسمى مع العازلة 100 مل شطف تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) DDM و 0.33 ملغ / مل ببتيد تساعي (C9 الببتيد ضد حاتمة 1D4)في 2 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.0 قبل الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة.
  5. لحل عينات صفت من قبل SDS-PAGE تحت ظروف الحد. غسل المواد الهلامية لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ومن ثم تصور وسم ايه زد اف-النوع من الاختزال بواسطة مضان في هلام. على سبيل المثال، استخدام الماسح الضوئي مضان مبائر مع 488 نانومتر طول الموجة الليزر للكشف عن مستقبلات تعديل مع فلوريسئين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمنا منهجية الطفرات الأحماض الأمينية غير طبيعي للموقع تحديدا تقديم تحقيقات الجزيئية إلى النوع من الاختزال باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. المخطط في الشكل 1 يحدد الخطوات البارزة لمنهجية وتطبيقات مختلفة من دمج UAA تنوعا، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف)، في GPCRs. التعبير عن AZF-GPCRs في خلايا الثدييات تمكن استهدفت photocrosslinking إلى بروابط، وتستهدف وضع علامات الببتيد حاتمة أو تعديلات لفلوري النوع من الاختزال كيمياء عبر وضع العلامات bioor...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا وصف منهجية قوية لإدراجها في مواقع محددة من التحقيق على رد الفعل، ايه زد اف، في GPCRs وإظهار ثلاثة تطبيقات مفيدة من هذه الأداة لدراسة بنية وديناميات GPCRs. لدينا وسيلة لموقع تحديدا دمج UAAs تلتف مشكلة أساسية مع استراتيجية بديلة تقوم على وصفها كيميائيا 32، 33 أو ربط photocrosslinkers 34 إلى واحد يمكن الوصول إليها متحولة السيستين. وعلى الرغم من كيمياء التي تستهدف مجموعات ثيول السيستين استخدمت لنعلق تحقيقات الفلورسنت، ومثل هذه الاستراتيجية يتطلب توليد خلف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر الدعم السخي من العديد من المؤسسات والجهات المانحة الخيرية (انظر SakmarLab.org).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
البلازميد pSVB. يام(Ye et al< / em>.، 2008)
البلازميد pcDNA.RS ل azF(Ye et al.< / em> ، 2009)
البلازميدات pMT4.Rho و pcDNA 3.1.CCR5تحتوي اختياريا على كودون الإيقاف الكهرماني (TAG) في الموضع المطلوب
خلاياالخلايا الملتصقة
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)Gibco10566 
فوسفات مخزن محلول ملحيGibco14200  ؛
مصل الأبقارالجنين الجوزاء المنتجات الحيوية100-106  ؛
Lipofectamine PlusInvitrogenLipofectamine: 18324-012
Plus: 11514-015		 
p-azido-L-phenylalanineChem-Impex International6162 
 <قوي>الجدول 1.< / قوي> الدمج الجيني الخاص بالموقع للأحماض الأمينية غير الطبيعية في مواد GPCRs
يتم تنشيط مصباح Maxima ML-3500S UV-ASpectronics CorporationazF بواسطة محلول
الملح المخزن هانك (HBSS)Gibco14065& nbsp ؛
هيبسإيرفين العلمية9319 
ألبومين مصل الأبقارRoche3117405001 
المسمى التريتيوممن المتعاون (Grunbeck et al.< / em> ، 2012)
1٪ (وزن / حجم) n-dodecyl-& beta ؛ -D-maltosideAnatraceD310LA&nbsp ؛
1D4-sepharose1D4 mAb يجمد على راتنج السيفاروز المنشط CNBr 2B
1٪ (وزن / حجم) كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)فيشر ScientificBP166  ؛
NuPAGE Novex 4 - 12٪ من المواد الهلامية SDSInvitrogenNP0322BOXSDS-PAGE التي تم إجراؤها على جهاز NuPAGE
Trans-Blot SDBioradللنقل شبه الجاف
غشاء Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF)MilliporeIPVH00010 
الحليب الخالي من الدسمفيشر ScientificNC9934262 
Tween-20Aldrich274348 
Ecoscint ANational DiagnosticsLS-273التلألؤ السائل
التلألؤفيشر Scientific333726 
LKB Wallac 1209 Rackbeta عداد التلألؤ السائلPerkin Elmerعداد بيتا التلألؤ
المضاد للرودوبسين 1D4 mAbالمركز الوطني لثقافة الخلايامخصص 
بيروكسيداز الفجل (HRP) المترافق المضاد للفأر IgGKPL، Inc.474-1806 
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34080 
Hyblot CL AR فيلمDenvilleE3018 
 <قوي>الجدول 2. مواد التشابك الضوئي المستهدفة
0.25٪ TrypsinInvitrogen15050065 
FLAG-triarylphosphineSigmaGPHOS1 
M2 FLAG mAbSigmaF1804 
مضاد CCR5 2D7 mAbBD Biosciences555990 
بولي د-ليسينسيجماP6407  ؛
96-بئر لوحةكوستار3601قاع واضح, عالية الارتباط EIA / RIA
الفوسفات مخزن المحلول الملحي (الكالسيوم, المغنيسيوم)Gibco14040 
16٪ بارافورمالدهيدEMS28908  ؛
KPLالمترافقة ب HRP474-1516 
مكافحة الأرانب IgGKPL، Inc.474-1516 
Amplex الأحمرInvitrogenA12222&nbsp;
بيروكسيد الهيدروجينDE منتجات الرعاية الصحية97-93399  ؛
قارئ لوحة متعدد الآبار CytoFluor IIPerseptive Biosystems 
 <قوي>الجدول 3.< / قوي> وضع علامات الببتيد والحاتمة المستهدفة ومواد ELISA سطح الخلية
الفلورسين الفوسفين(Huber et al.< / em> ، تم تقديمه 2012)
Nonapeptide (C9 الببتيد)AnaSpec62190الببتيد الذي يحاكي 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1٪ (وزن / حجم) n-dodecyl-& beta ؛ -D-maltosideAnatraceD310LA 
1D4-sepharose1D4 mAb يجمد على راتنج السيفاروز 2B المنشط CNBr
NuPAGE Novex 4 - 12٪ المواد الهلامية SDSInvitrogenNP0322BOXSDS-PAGE التي تم إجراؤها على جهاز NuPAGE
ماسح ضوئي مضان Confocal Typhoon 9400الماسح الضوئي GE Healthcareمع ليزر بطول موجي 488 نانومتر
  ؛<قوي>الجدول 4. مواد وضع العلامات < / قوية > الفلورسنت
HEK 293T الترابط راتنج جهاز جهاز قوارير شركة راتنج توقف

المراجع

  1. Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
  2. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
  3. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  4. Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  5. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  6. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
  7. Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
  8. Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
  9. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
  10. Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
  11. Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
  12. Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
  13. Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
  14. Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
  15. Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
  16. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
  17. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
  18. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
  19. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
  20. Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
  21. Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
  22. Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
  23. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  24. Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
  26. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
  27. Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
  28. Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
  29. Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
  30. Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
  31. Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
  32. Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
  33. Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
  34. Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
  35. Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
  36. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  37. Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
  38. Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة