مقالة منهجية

التحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد لعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم للاستقطاب في إصابات الدماغ التجريبية

DOI:

10.3791/50605

⸱

سبتمبر 4, 2013

 ,  , 
1Department of Neuroscience, IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم طريقة لاكتساب رؤى جديدة حول تعقيد الاستجابة الالتهابية للدماغ. نصف البروتوكولات القائمة على التألق المناعي متبوعة بتحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد للتحقيق في نمط التعبير المشترك لعلامات النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم في نموذج فأر لنقص التروية البؤري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد السكتة الدماغية ، تخضع الخلايا الدبقية الصغيرة / الضامة (M / M) لتنشيط سريع مع تغيرات مورفولوجية ونمطية دراماتيكية تشمل التعبير عن مستضدات سطحية جديدة وإنتاج وسطاء يبني ويحافظون على الاستجابة الالتهابية. تشير الأدلة الناشئة إلى أن M / M عبارة عن خلايا بلاستيكية للغاية يمكن أن تفترض التنشيط الكلاسيكي المؤيد للالتهابات (M1) أو البديل المضاد للالتهابات (M2) بعد إصابة الدماغ الحادة. ومع ذلك ، لا يزال التوصيف الكامل لتعبير علامة النمط الظاهري M / M ، وتحديد موقعها وتطورها الزمني في الدماغ المصاب مفقودا. يمكن إجراء بروتوكولات التألق المناعي

التي تلطخ على وجه التحديد العلامات ذات الصلة بتنشيط M / M في الدماغ الإقفاري. نقدم هنا بروتوكولات قائمة على التألق المناعي متبوعة بتحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد كنهج قوي للتحقيق في نمط التوطين والتعبير المشترك لعلامات النمط الظاهري M / M مثل CD11b و CD68 و Ym1 ، في نموذج الفأر لنقص التروية البؤري الناجم عن الانسداد الدائم للشريان الدماغي الأوسط (pMCAO). يكشف التحليل ثنائي الأبعاد للمنطقة الملطخة أن كل علامة مرتبطة بمورفولوجيا M / M محددة ولها توطين معين في الآفة الإقفارية. يمكن تقييم أنماط التعبير المشترك لعلامة النمط الظاهري M / M عن طريق التصوير متحد البؤر ثلاثي الأبعاد في المنطقة الإقفارية. يمكن الحصول على الصور عبر حجم محدد (10 ميكرومتر من المحور z وحجم خطوة 0.23 ميكرومتر ، يتوافق مع حجم 180 × 135 × 10 ميكرومتر) مع وضع مسح متسلسل لتقليل تأثيرات النزيف وتجنب تداخل الطول الموجي. ثم تتم معالجة الصور للحصول على عروض ثلاثية الأبعاد عن طريق برنامج Imaris. يسمح العرض القوي للعروض ثلاثية الأبعاد بتعريف تعبير العلامة في مجموعات الخلايا. نظهر أن M / M لديه القدرة على التمايز نحو العديد من الأنماط الظاهرية ، اعتمادا على الموقع في موقع الآفة والوقت بعد الإصابة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >بعد إصابة الدماغ الحادة ، يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بسرعة وتخضع لتغييرات مورفولوجية ونمطية مظهريةدراماتيكية 1-3. ترتبط هذه الاستجابة الجوهرية بتجنيد الضامة المولودة بالدم والتي تهاجر إلى حمة الدماغالمصابة 4،5. لا يزال دور الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة التي لا يمكن تمييزها من الناحية المستضدية (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم M / M) في إصابات الدماغ موضع نقاش. يشير عدد متزايد من الدراسات إلى أنه ، على غرار ما هو موصوف للبلاعم المحيطية ، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المجندة في الدماغ أن تفترض أنماطا ظاهرية مختلفة تتوافق أقصاها القصوى مع النمط الظاهري الكلاسيكي السام المؤيد للالتهابات (M1) أو النمط الظاهري الواقي المضاد للالتهابات (M2). تتميز حالات التنشيط المختلفة ، بما في ذلك إفراز العوامل المؤيدة للالتهابات أو المضادة للالتهابات ، وإطلاق الجزيئات العصبية والنشاط الليزوزومي بنمط محدد من علامات النمط الظاهري ، والتي يعتمد التعبير عنها على التطور الزمني للبيئة المحيطة. لا يزال توصيف هذه الأنماط الظاهرية M / M في الدماغ المصاب هزيلا. استخدمنا نموذج فئران راسخ ل pMCAo لتحليل تعبير M / M والتطور بعد السكتة الدماغية. تهدف البروتوكولات القائمة على التألق المناعي المعروضة هنا إلى الحصول على نظرة ثاقبة لظهور علامات النمط الظاهري M / M المحددة ، وتوطينها والتعبير الخلوي المشترك في المنطقة الإقفارية. لقد حققنا في عدد قليل من الجزيئات المرتبطة بحالة تنشيط أو نمط ظاهري مختلف ، وهي CD11b ، وهي علامة سطحية تعبر عنها الكريات البيض وعلامة مستخدمة على نطاق واسع لتنشيط / تجنيد M / M6-8 ، CD68 علامة على الجسيمات الحالة6،7 و Ym1 بروتين إفرازي يتم التعبير عنه بواسطة البلاعم المنشطة بدلا من ذلك (M2) والمرتبطة بالتعافي واستعادة الوظيفة9-10.

عندما يتم التعبير عن علامتين بواسطة نفس الخلية ، ولكن في مقصورات مختلفة تحت الخلوية ، قد لا يكون التحديد المشترك وحده مفيدا للغاية. في هذه الحالة ، يمكن إجراء تحليل التعبير المشترك باستخدام عرض المستوى الفردي والعروض ثلاثية الأبعاد. نصف هنا بروتوكولا للحصول على تحليل شامل ثلاثي الأبعاد للتعبير المشترك عن العلامة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. التألق المناعي

< p class = "jove_content">يتم تنفيذ البروتوكول التالي على عمليات الاستئصال بالتبريد في الدماغ الإكليلية التي تم الحصول عليها من الفئران المنفعة عبر القلب (20 مل من PBS ، 0.1 مول / لتر ، درجة الحموضة 7.4 ، متبوعا ب 50 مل من بارافورمالدهيد المبرد 4٪ في PBS). بعد التروية ، تتم إزالة الأدمغة بعناية ونقلها إلى 30٪ سكروز في PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل للحماية من التبريد. ثم يتم تجميد الأدمغة بسرعة عن طريق الغمر في الأيزوبنتان عند - 45 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل إغلاقها في قوارير وتخزينها عند -70 درجة مئوية حتى الاستخدام. يتم قطع عمليات القطع بالتبريد في الدماغ الإكليلي (20 ميكرومتر) بشكل متسلسل وتخضع لبروتوكول التألق المناعي 11 ، 6.

أحضر جميع الكواشف والعينات إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. يرجى ملاحظة أن التخفيفات العاملة المقدمة للأجسام المضادة والمصل نتجت عن التجارب التي أجريت من أجل الحصول على أفضل أداء. عند استخدام أجسام مضادة ومصل مختلفين ، يجب التحقق من صحة البروتوكول.

لاحظ أنه نظرا لأن كلا من الأجسام المضادة الأولية المضادة ل CD11b و CD68 مصنوعة في الفئران ، لتجنب الإشارة المتقاطعة بواسطة Alexa 546 المضاد للفئران ، استخدمنا تخفيفا عاليا ل anti-CD11b متبوعا بتضخيم إشارة الفلورسنت باستخدام مجموعة TSA (Cy5 Tyramide). لقد قمنا بإعداد التخفيف الأمثل للعمل لمضاد CD11b من خلال تنفيذ البروتوكول الموصوف باستثناء الخطوة 1.17 واستخدام ما لا يقل عن 7 تخفيفات مختلفة من مضاد CD11b كما هو مذكور في الجدول 1. نتيجة لذلك ، تم اختيار 1: 30،000 كونه التخفيف الوحيد الذي يحقق: 1) إشارة مرئية مع Cy5 عند الطول الموجي للإثارة 646 نانومتر ؛ 2) لا توجد إشارة مع Alexa 546 عند الطول الموجي للإثارة 532 نانومتر. بهذه الطريقة ، ترتبط إشارة الفلورسنت Alexa 546 بشكل انتقائي بتعبير CD68.

قد تختلف التخفيفات المثلى للأجسام المضادة ل CD11b و CD68 اعتمادا على نوع الأنسجة ويجب تحديدها قبل بدء بروتوكول وضع العلامات المشتركة.

  1. اغسل عمليات البرش بالتبريد للدماغ مرتين باستخدام PBS.
  2. احتضان عمليات القطع بالتبريد لمدة 5 دقائق في PBS التي تحتوي على 1٪ H2O2 (الخطوة المطلوبة لأن تضخيم الفلورسنت يحتاج إلى حضانة مع بيروكسيداز الفجل الحار ، ستربتافيدين-HRP ، انظر الخطوة 1.12).
  3. اغسل المقاطع بالتبريد 2x باستخدام PBS.
  4. احتضان القطع بالتبريد لمدة 60 دقيقة في PBS الذي يحتوي على 10٪ NGS و 0.3٪ تريتون.
  5. احتضان الأقسام بالتبريد عند 4 درجات مئوية طوال الليل في PBS التي تحتوي على Ab Rat الأولي المضاد ل CD11b [1: 30,000] و 10٪ NGS و 0.3٪ Triton.
  6. اغسل المقاطع بالتبريد 2x (5 دقائق) باستخدام PBS.
  7. احتضان القطع بالتبريد لمدة 60 دقيقة في PBS الذي يحتوي على البيوتينيل الثانوي المضاد للفئران Ab [1:200] و 1٪ NGS.
  8. اغسل المقاطع بالتبريد 2x باستخدام PBS.
  9. اغسل عمليات القطع بالتبريد باستخدام مادة تي إن تي (Tris-HCl ، كلوريد الصوديوم ، المراهقين: 0.1 م TRIS-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.15 م كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ توين 20).
  10. احتضان القطع بالتبريد لمدة 1.5 ساعة في TNB (المخزن المؤقت لحجب Tris-HCl-NaCl: 0.1 M TRIS-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.15 M كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ كاشف حجب من المجموعة المناسبة (انظر جدول الكواشف)).
  11. اغسل المقاطع بالتبريد 3 مرات باستخدام مادة تي إن تي.
  12. احتضان القطع بالتبريد في TNB الذي يحتوي على الستربتافيدين-HRP [1: 100].
  13. اغسل المقاطع بالتبريد 3 مرات باستخدام مادة تي إن تي.
  14. احتضان عمليات القطع بالتبريد لمدة 8 دقائق في مخفف التضخيم الذي يحتوي على السيانين 5 تيراميد [1: 300].
  15. اغسل المقاطع بالتبريد 3x باستخدام PBS.
  16. احتضان القطع بالتبريد لمدة 60 دقيقة في PBS الذي يحتوي على 10٪ NGS و 0.1٪ Triton.
  17. احتضان الأقسام بالتبريد عند 4 درجات مئوية طوال الليل في PBS التي تحتوي على Ab Rat الأولي المضاد ل CD68 [1: 200] و 3٪ NGS و 0.3٪ Triton.
  18. اغسل المقاطع بالتبريد 3x باستخدام PBS.
  19. احتضان القطع بالتبريد لمدة 60 دقيقة في PBS الذي يحتوي على الثانوية المتوافقة بالفلور Ab Alexa 546 المضادة للفئران [1: 500] و 1٪ NGS.
  20. اغسل المقاطع بالتبريد 3x باستخدام PBS.
  21. احتضان القطع بالتبريد لمدة 10 دقائق في PBS الذي يحتوي على Hoechst 1 ميكروغرام / مل.
  22. اغسل المقاطع بالتبريد 3x باستخدام PBS.
  23. تركيب المقاطع البردية في Prolong Gold.
< p class = "jove_title" >2. الحصول على صور ثلاثية الأبعاد عن طريق المجهر متحد البؤر

المجهر المستخدم هنا كان عبارة عن مجهر IX81 مزود بوحدة مسح متحد البؤر FV500 مع 3 خطوط ليزر: Ar-Kr (488 نانومتر) ، He-Ne أحمر (646 نانومتر) ، و He-Ne أخضر (532 نانومتر) وصمام ثنائي للأشعة فوق البنفسجية.

  1. حدد ليزر الإثارة اعتمادا على الأطوال الموجية للأصباغ الفلورية المراد إثارتها (He-Ne red ل Cy5 ، CD11b ؛ He-Ne أخضر ل Alexa546 و CD68 والصمام الثنائي للأشعة فوق البنفسجية ل Hoechst ، النوى).
  2. حدد أفضل مجموعة مرآة ثنائية اللون لجمع إشارات الضوء.
  3. قم بإعداد دقة الصورة بحد أدنى 800 × 600 بكسل.
  4. حدد مجال الاهتمام باستخدام التألق epi وقم بزيادة التكبير تدريجيا إلى هدف 40X.
  5. قم بالتبديل إلى طريقة الفحص المجهري بالمسح الضوئي بالليزر (LSM).
  6. قم بإجراء عمليات مسح متكررة لضبط مضاعف الضوء (PMT) والكسب لكل قناة. يمكن تشغيل الليزر بشكل فردي لتسهيل الإعداد. حافظ على الكسب منخفضا قدر الإمكان لتجنب الإشارات غير المرغوب فيها غير المحددة.
  7. أثناء تشغيل المسح المتكرر، حرك عنصر التحكم في التركيز البؤري لتحديد الأطراف السفلية والعلوية للمحور z (إجمالي طول المحور z = 10 ميكرومتر).
  8. أوقف الفحص المتكرر.
  9. تحديد حجم الخطوة. يجب أن يكون أقرب ما يمكن إلى حجم البكسل (0.225 ميكرومتر) للحصول على نسبة حجم قياسية 1: 1 على المحور z.
  10. قم بتنشيط مرشح كالمان 2 مرات على الأقل.
  11. قم بتنشيط وضع المسح المتسلسل لتجنب تأثيرات النزيف.
  12. اذهب إلى منتصف الطريق على طول المحور z وقم بإجراء مسح تسلسلي xy. تحقق من إعداد PMT والكسب (نسبة إشارة / ضوضاء جيدة). إذا لم تكن مرضية، كرر الخطوة 2.6.
  13. قم بتشغيل الاستحواذ على xyz.
  14. تصدير البيانات كملف متعدد التوصيل. يحتوي كل ملف متعدد الصلصات عادة على 3 قنوات ألوان (أزرق وأخضر وأحمر) و 44 مستوى بؤري.
< p class = "jove_title" >3. عرض ثلاثي الأبعاد للاستحواذ متحد البؤر والعرض ثلاثي الأبعاد

تحميل ملفات متعددة الtiff إلى برنامج Imaris ومعالجتها على النحو التالي:

  1. افتح البرنامج.
  2. حدد عرض التجاوز.
  3. قم بتحميل الملف المتعدد.
  4. حدد اللون المطلوب لكل قناة.
  5. قم بإزالة التشويش من الخلفية عن طريق زيادة الحد الأدنى للقيمة على لوحة ضبط الشاشة. اضبط كل قناة على حدة.
  6. انتقل إلى عرض القسم. تحرك على طول المحور z بحثا عن الترجمة المشتركة (وحدات البكسل الصفراء).
  7. انقر فوق منطقة صفراء لمعرفة ما إذا كان التموضع المشترك موجودا على طول المحور z (أي ينتمي إلى جسم صلب). تظهر إسقاطات المحور Z في الجزء الأيمن والسفلي من الشكل.
  8. التقط لقطة.
  9. ارجع لتجاوز العرض.
  10. اقتصاص 3D لعزل خلية أو مجموعة من الخلايا.
  11. حدد قناة واحدة في لوحة ضبط الشاشة.
  12. حدد منشئ خوارزمية التجاوز/الأسطح. خطوات الخوارزمية:
    1. حدد القناة.
    2. حدد الحد (استخدم نفس الحد الأدنى للقيمة في لوحة ضبط العرض).
    3. تحديد تغيير الحجم.
    4. تعريف التنعيم (الأفضل = 0.200).
    5. تحديد مظهر اللون.
    6. خوارزمية النهاية.
  13. كرر الخطوة 3.12 لكل قناة.
  14. قم بإلغاء تحديد قنوات التألق على لوحة ضبط الشاشة وحدد جميع الأسطح الثلاثة.
  15. حرك مستوى الصوت للعثور على أفضل طريقة عرض.
  16. التقط لقطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثال على النتائج التي تم الحصول عليها عند تنفيذ بروتوكولات وضع العلامات والاكتساب متحد البؤر في المنطقة الإقفارية موضح في الشكلين 1 أ و 1 ب. تظهر نظرة ثنائية الأبعاد للصور المكتسبة أنه بعد أربع وعشرين ساعة من نقص التروية (A) ، يتم التعبير عن العلامة الليزوزومية CD68 (الأخضر) في خلايا CD11b الأميبية الضخامية (الحمراء) الموجودة في النواة الإقفارية. في المنطقة الحدودية (B) ، تعرض الخلايا الموجبة CD11b أجساما خلوية مستديرة وعمليات متشعبة موجبة ل CD68. تسمح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولات قائمة على التألق المناعي متبوعة بتحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد كنهج قوي للتحقيق في التوطين والتعبير المشترك عن علامات النمط الظاهري M / M في المنطقة الإقفارية (للحصول على تحليل أكثر تفصيلا ، انظر المرجع 6). تجمع هذه الطريقة بين تلطيخ محدد للعلامة ذات الصلة لتنشيط M / M والتصوير متحد البؤر ثلاثي الأبعاد. يسمح الضبط الدقيق للأجسام المضادة والمصل وتخفيفات العمل المترافقة بالفلور بتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للعلامات التي تم فحصها. تسمح معالجة الصور للحصول على عروض ثلاثية الأبعاد بتح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ستيفانو فوماجالي زميل في مؤسسة مونزينو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات

Materials< / strong>
Rat Anti-mouse CD11bيرجى تقديم الدكتور A. Doni ، Istituto Clinico Humanitas ، ميلانو ، إيطاليا
الفئران المضادة للفأر CD68 AbD SerotecMCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1 Stem Cell Technologies1404
H&# 8211; chst 33342Life TechnologiesH21492
الفأر المضادة للعصبية (NeuN)CHEMICONMAB377
الماعز البيوتينيلتي الأجسام المضادة للفئرانJackson Immuno Research112-065-143
TSA السيانين 5 System Perkin ElmerNEL705A001KT
إطالة الذهب InvitrogenP36930
المضادة للفئران Alexa 546InvitrogenA-11081
مضاد للفأر Alexa 488InvitrogenA-21121
مضاد للأرانب Alexa 594InvitrogenA-11037
مختبرات ناقلاتمصل الماعز العاديS-1000
Tritin X-100SigmaT8787
فوسفات مخزن محلول ملحيسيجماP4417-100
<قوي>المعدات< القوية>
Cryostat CM1850Leica
Olympus IX81 مجهر متحد البؤر أوليمبوس
التحليل برنامجESSENTIAL برنامج أوليمبوس
إيماريس 5.0Bitplane
Photoshop cs2حزم برامج أنظمة
Adobe GraphPad Prism الإصدار 4.0شركة GraphPad Software Inc.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  2. Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
  3. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
  6. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
  7. Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
  8. Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373(2007).
  9. Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943(2011).
  10. Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
  11. Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
  12. Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD11b CD68 Ym1 Imaris Z

مقالات ذات صلة