والأرومة الليفية العضلية هي الخلية اللحمية تأثيرا في الجهاز الهضمي الذي ينظم العمليات الفسيولوجية الهامة في الدول العادية والمرض. نحن تصف تقنية تسمح لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان، والتي يمكن استخدامها في المختبر لالتجريب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والأرومة الليفية العضلية هي خلايا انسجة الجهاز الهضمي من (GI) المسالك التي تم تكتسب اهتماما كبيرا لدورها الحاسم في كثير من وظائف الجهاز الهضمي. في حين أن العديد من خطوط الخلايا الأرومة الليفية العضلية المتاحة تجاريا لدراسة هذه الخلايا في المختبر، ونتائج البحوث من خط الخلية تتعرض لظروف تجريبية ثقافة الخلية على قيود متأصلة نظرا لطبيعة اختزالية بشكل مفرط من العمل. استخدام myofibroblasts الأولية يقدم ميزة كبيرة من حيث تؤكد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية. عزل myofibroblasts الأولية من نموذج حيواني يسمح لدراسة myofibroblasts ظل الظروف التي تحاكي بشكل وثيق الدولة الأمراض التي تجري دراستها. عزل myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان يوفر يمكن القول إن معظم البيانات التجريبية ذات الصلة، منذ الخلايا تأتي مباشرة من المرضى الذين يعانون من هذا المرض الأساسي. نحن تصف تقنية راسخة يمكن أن تكون شtilized لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان. وقد اتسمت هذه الخلايا أن تكون معزولة أكتين ألفا العضلات الملساء وvimentin إيجابية، وdesmin السلبية، بما يتفق مع myofibroblasts المعوية تحت الظهارة. يمكن زراعتها خلايا الأرومة الليفية العضلية الأولية في خلية ثقافة وتستخدم لأغراض تجريبية على عدد محدود من المقاطع.
المقدمة
تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظيفة الجهاز ينطوي المعقدة، والتفاعلات الدينامية بين الطبقة المخاطية واللحمة المتوسطة الكامنة. هذه التفاعلات تخدم عادة للحفاظ على التوازن ولكن قد يؤدي أيضا إلى تطوير الحالات المرضية في ظل ظروف مرضية 1. Myofibroblasts هي جزء من السكان من الخلايا اللحمية تقع تحتاني إلى الطبقة الظهارية التي تتصل بطريقة نظير الصماوي مع توضيح المجموعات السكانية الفرعية خلية لتنظيم عدد من العمليات الحرجة الجهاز الهضمي والتي تشمل تجديد الغشاء المخاطي، والإصلاح، والتليف 2.
خط الخلية 18Co هو مثال على القولون خط الخلية البشرية الأرومة الليفية العضلية التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية لأنها تشترك في كثير من الخصائص من التعليم الابتدائي في myofibroblasts الموقع. وتشمل هذه تعبير البروتين من العضلات على نحو سلس الأكتين (α-SMA) وvimentin، فضلا عن التعبير عن عددمن مستقبلات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل نمو البشرة، أو مستقبلات حمض 3،4 lysophosphatidic. بسبب هذه الخصائص التركيبية المشتركة، فضلا عن التشابه في وظيفة بيولوجية 5، وقد استخدم خط الخلية 18Co على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية في سياق العديد من الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء أو القولون والمستقيم 3،6 السرطان. ومع ذلك، هناك قيود والمخاوف المتأصلة عند استخدام خط الخلية. وتشمل هذه عدم الاستقرار الوراثي بمرور الوقت التي تميز خطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وتغيير النمط الظاهري وظيفة بيولوجية الخلية، بما في ذلك معدلات النمو والتفاعل مع السكان الخلية الأخرى. تفتقر خطوط الخلايا أيضا مكونات طبيعية من المكروية GI (الظهارية، اللحمية، ومكونات الأوعية الدموية)، والذي يشكل قيدا رئيسيا لاستخدامه. وبالتالي، فإن الاستنتاجات المستخلصة من البحوث التجريبية خط الخلية يتطلب مزيدا من التحقق من صحة للحد من ريكورونا من سوء التفسير.
ويمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان والفأر لتأكيد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية 7. طريقة وصفت في الأصل من قبل Mahida، وآخرون. 8، وبروتوكول لدينا هي واحدة من العديد من التقنيات موصوفة وصفا جيدا والتي يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية من الماوس والقولون الإنسان 9. عن أي نموذج الفأر من مرض القولون، هذه التقنية يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية لدراسة كيفية تفاعلها مع الخلايا المجاورة أو المساهمة في الظروف العادية أو عمليات GI مرضية 10،11. هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة كيفية مساهمة myofibroblasts إلى المخاطية الشفاء، والتليف، وتطوير أورام القولون والمستقيم وسرطان. كما يمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان التي تم مقطوعة في وقت التشغيل لحميدة (مرض التهاب الأمعاء، والقيود، انسدادات) أو ج الخبيثةonditions. يمكن زراعتها الخلايا الأولية المعزولة من أنسجة القولون الإنسان والفأر في المزارع الخلوية والاستفادة منها على عدد محدود من المقاطع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الحصول على الأنسجة القولون
فأر
بروتوكول لأداء التجارب على الحيوانات، تبين بالتفصيل المنطقي وأهداف البحث، وقدمت والتي وافق عليها مكتب المؤسسية لدينا الحيوان بحوث الرقابة.
- الموت ببطء الماوس مع isoflurane واستنشاق تليها خلع عنق الرحم.
- جعل خط الوسط شق بطني، سحب الأمعاء الدقيقة بعيدا وتحديد القولون. سحب المثانة والرحم (إذا كان موجودا) أفقيا وتحديد عظم العانة وقطع عليه مع مقص غرامة لفضح المستقيم.
- تشريح مساريق الظهرية من المستقيم من القولون والقولون حشد من فتحة الشرج إلى الأعور، والقطع إلى قطع القولون من الأمعاء الدقيقة.
- وضع العينة في الفوسفات مخزنة المالحة الجليد الباردة (PBS).
- ملء حقنة 10 مل مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة وطرد القولون التجويف عدة مرات لمسح محتوياته، ثم قص مكتب مستشار رئيس الوزراء القولونن طول الحكيم باستخدام المقص.
- وضع القولون في أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على 20 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. ليس لديها القولون لتوضع في أي اتجاه معين. غسل القولون عن طريق استبدال برنامج تلفزيوني حتى السائل واضح مع عدم وجود الجسيمات.
بشري
بروتوكول للحصول على الأنسجة البشرية من المرضى لعمليات جراحية، تتضمن تفاصيل عن أهمية الحصول على هذا النسيج فضلا عن تقييم المخاطر والفوائد المحتملة، قدمت والتي وافق عليها مكتب المؤسسية لدينا برنامج بحوث وقاية الإنسان.
- التعاون البحثي مع جراح القولون والمستقيم هو ضروري لتكون قادرة على الحصول على الأنسجة البشرية لأغراض البحث الخاصة بك. وينبغي تقديم بروتوكول للحصول على أنسجة القولون الإنسان والتي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية الخاص بك.
- يتم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من المريض قبل إجراء العمليات الجراحية.
- سوف الجراح إجراء استئصال القولون في موقفأزياء ارض. مرة واحدة تمت إزالة القولون من المريض، يتم أخذ عينة فورا لعلم الأمراض. 0.5 في قسم كامل سماكة جدار القولون يست هناك حاجة لتقييم مرضية يتم توفير ويتم وضعها على الفور على PBS الجليد الباردة. لا ينبغي أن تشمل هذه العينة مساريق القولون، ويجب إزالة الزوائد الثربية كذلك، حيث إن وجود الدهون سوف يؤثر على عملية الهضم.
2. تعرية الخلايا الظهارية
- احتضان القولون الماوس بأكمله في 25 مل من EDTA 5 ملم في HBSS (درجة حرارة الغرفة) في أنبوب 50 مل المخروطية. وضع أنبوب مخروطي في 37 درجة مئوية تهز حمام الهواء (250 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة، صب بعناية قبالة السوائل وإعادة ملء الأنبوب مع 25 مل من EDTA 5 ملم، وتكرار لما مجموعه 5 يغسل. لالقولون الإنسان، بعد الحصول على الشريط ½ بوصة من جدار القولون من الطبيب الشرعي قطع مع مقص القولون إلى أربعة أقسام متساوية الحجم. وضع اثنين من قطعة واحدة في أنبوب 50 مل المخروطية، ووضع ما تبقى من قطعتين من النسيج القولون منفصلة في أنبوب 50 مل المخروطية. ثم احتضان مع 25 مل من EDTA 5 ملم في HBSS وأداء يغسل، كما هو موضح أعلاه.
- شطف القولون مرتين في 20 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- وضع أنسجة القولون الماوس في أنبوب 50 مل المخروطية جديدة تحتوي على 20 مل من RPMI-5، 10 من dispase U، U و 2،000 من كولاجيناز D (درجة حرارة الغرفة). لأنسجة القولون البشري، واستخدام ضعف كمية dispase كولاجيناز و(20 U dispase، 4،000 U كولاجيناز D).
- وضع أنبوب في حمام الهواء 37 ° C تهز موجه عموديا (إذا وضعت أفقيا، وهناك الكثير من التهوية وتلف الخلايا). يهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 60 دقيقة. بعد التعرض لdispase كولاجيناز وD، فإن الأنسجة القولون تبدأ في هضم وسوف تبدأ أنسجة القولون للبحث مفتول العضلات. هذا عادة ما يستغرق حوالي 30 دقيقة. عندما القولون لديه هذا المظهر، وإزالة القولون من الانزيمات.
- يهز كل أنبوب صعودا وهبوطا 2-4 مرات لتفريق الأنسجة. Pellet الأنسجة في 200 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة (4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق. صب بعناية قبالة طاف وتجاهل.
3. عزل الأرومة الليفية العضلية والثقافة
- في resuspend كل بيليه بإضافة 10 مل ACK العازلة تحلل (47 درجة مئوية). الطرد المركزي مرة أخرى في 200 x ج لمدة 5 دقائق (4 ° C)، صب قبالة وتجاهل طاف.
- في resuspend كل بيليه بإضافة 10 مل RPMI-5 مع ماصة.
- تمرير نصف لتعليق الخلية (5 مل) من خلال شبكة مصفاة 70 ميكرومتر باستخدام ماصة 10 مل إلى 100 مم طبق المعالجة TC. ثم إضافة 15 مل إضافية من RPMI-5. أكرر مع 5 مل المتبقية من تعليق خلية إلى 100 مم طبق المعالجة TC مختلفة. ولذلك فإن واحدة القولون الماوس انتاج اثنين من 100 ملم الأطباق المعالجة TC. واحد ونصف بوصة شريط من الأنسجة القولون الإنسان تسفر عن مجموعه أربعة أطباق المعالجة TC 100 ملم.
- وضع أطباق زراعة الأنسجة في 10٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. الشروط الثقافة هي نفسها وأو الماوس والخلايا الأولية الإنسان.
- بعد 3 ساعة، ويغسل بلطف الخلايا غير ملتصقة مع اثنين من التغييرات من HBSS. والحطام العائمة يجب غسلها بلطف. وتتكون الخلايا الملتصقة من الخلايا الظهارية، الضامة وmyofibroblasts. أسبوع واحد بعد البذر، myofibroblasts الفجوة فقط، الضامة والخلايا الظهارية senesce بعد مرور الأول. إضافة جديدة RPMI-5 وتنمو الخلايا في خلية ثقافة.
- و passaged الخلايا عن طريق trypsinization لمدة 5 دقائق ويتم تقسيم 2:1.
الاختصارات
HBSS: محلول ملحي متوازن هانك؛ RPMI-5: معهد روزويل بارك التذكاري وسائل الإعلام؛ ACK: الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم؛ FCS: مصل العجل الجنين؛ TC المعالجة: زراعة الأنسجة المعالجة
حلول
ACK تحلل العازلة - (4.15 ز NH 4 CL، 0.5 غرام KHCO 3، 18.6 ملغ نا 2 EDTA، 400 مل H 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،4 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك). مرشح sterilizه من خلال مرشح 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. RPMI-5 - (لجعل 500 مل: 454.5 مل RPMI، 25 مل FCS، 5 مل 200 ملي L-الجلوتامين، 5 مل 1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.4، 5 مل 100 ملي البيروفات الصوديوم، 5 مل 100X القلم بكتيريا، 500 مل 50 ملي B-ME في برنامج تلفزيوني).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مرة واحدة معزولة، myofibroblasts الإنسان الأساسية يمكن زراعتها في خلية ثقافة وتستخدم أكثر من عدد محدود من المقاطع (حتى مرور 4). وتتميز هذه الخلايا بأنها على نحو سلس أكتين العضلات وvimentin إيجابية، وسلبية desmin (الشكل 1A)، بما يتفق مع myofibroblasts تحت الظهارة المعوية 5،7. لديهم أيضا النجمية مورفولوجيا مميزة (الشكل 1B). ويمكن بعد ذلك myofibroblasts الأولية أن تستخدم لتأكيد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية. وقد استخدمت هذ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنية عامة مشابهة عند استخدام إما الماوس أو القولون الإنسان. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لعزل myofibroblasts من الأمعاء الدقيقة. تفاصيل محددة لعزل myofibroblasts من 1. الماوس و 2. وتناقش القولون البشري أدناه.
1. الماوس القولون
ومما يسهل الري من القولون الماوس عن طريق ربط 4 في، 16 G بوبر حادة في نهاية الإبرة إلى واحدة من نهاية القولون. ويساعد ه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5KO8DK085136-02 لJY.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | رقم كتالوج | الشركة | التعليقات (اختياري) |
| Dispase I | Invitrogen / GIBCO# | 17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | # 1 088 858 | |
| 4 بوصة ، 16 G بوبر إبرة حادة | Fisher | # 14-825-16K |
المراجع
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898(2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
