رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

Summary

في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.

Abstract

نقدم جهاز ميكروفلويديك التي تمكن من تحديد كمية الجزيئات الحيوية داخل الخلايا في الخلايا وحيدة متعددة في نفس الوقت. لهذا الغرض، محاصرون الخلايا بشكل سلبي في منتصف microchamber. عند تفعيل طبقة تحكم، يتم عزل الخلية من حجم المحيطة في غرفة صغيرة. ويمكن بعد ذلك يتم تبادلها حجم المحيطة دون التأثير على الخلايا المعزولة. ومع ذلك، عند فتح وإغلاق قصيرة للغرفة، والحل في غرفة يمكن استبدالها في غضون بضع مئات من ميلي ثانية. ويرجع ذلك إلى العودة إلى الوراء من الغرف، والخلايا يمكن أن يتعرض لها حلول مختلفة بالتتابع بطريقة التحكم الى حد كبير، على سبيل المثال للحضانة، والغسيل، وأخيرا، تحلل الخلية. وmicrochambers مغلقة بإحكام تمكين الاحتفاظ المحللة، وتقليل والسيطرة على التخفيف بعد تحلل الخلية. منذ تحلل والتحليل تحدث في نفس المكان، ويتم الاحتفاظ حساسية عالية لأنه لا يوجد مزيد من دilution أو فقدان التحاليل يحدث أثناء النقل. وبالتالي فإن تصميم microchamber يتيح تحليل موثوق بها وقابلة للتكرار من الأرقام نسخة صغيرة جدا من الجزيئات داخل الخلايا (attomoles، zeptomoles) صدر من الخلايا الفردية. علاوة على ذلك، يمكن ترتيب العديد من microchambers في شكل مجموعة، والسماح للتحليل العديد من الخلايا في آن واحد، نظرا إلى أن تستخدم الأجهزة البصرية مناسبة للرصد. وقد استخدمنا بالفعل منصة لإثبات صحة مفهوم الدراسات لتحليل البروتينات داخل الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة والمرسلين الثاني بطريقة قابلة للقياس الكمي إما النسبية أو المطلقة.

Introduction

وقد كشفت العديد من الدراسات في الماضي خلية الى خلية الخلافات بين السكان زنزانة كبيرة ^1-3، ولا سيما إشارات العمليات ^4، أو مبالغ الجزيئات الحيوية مثل البروتينات داخل الخلايا ^5،6، الأيض، والعوامل المساعدة ^7،8. وتعتبر هذه التغاير أن يكون أهمية أساسية للتكيف الخلايا والتطور ^9، ولكن أيضا أن تلعب دورا رئيسيا في ظهور والعلاج من الأمراض مثل السرطان ^10-13. وبالتالي، دراسات على مستوى خلية واحدة هي من الفائدة المرتفعة في الأبحاث البيولوجية والدوائية، وخاصة إذا تكشف هذه الدراسات ردود مختلفة من الخلايا بعد العلاج مع المواد الكيميائية النشطة بيولوجيا.

Protocol

1. SU-8 تلفيق ماستر

إعداد كل من القوالب الرئيسية لقنوات (فلويديك والسيطرة، لالخطط وأبعاد انظر الشكل 2) مع بروتوكول التالي ولكن مع أنماط مختلفة قناع. يظهر عملية في الشكل 3A.

1. تبدأ عن طريق تسخين 4 بوصة رقاقة السيليكون لمدة 10 دقيقة على حرارة 180 درجة مئوية. تحميل رقاقة المجففة على المغطي تدور واستخدام بروتوكول التالية لتدور طلاء SU-8 عام 2015:
   1. تدور رقاقة ف....

Results

برنامجنا هو قادرا على تحليل مجموعة متنوعة من الخلايا وكذلك جزيئات يفرزها موجودة في أو التي تنتجها الخلايا واحد. هنا، نود أن تقديم دراسات سبيل المثال مختلفة للتأكيد على مجموعة متنوعة من فحوصات ممكن. وسنقدم مثالا للانزيم يفرز (الشكل 5A)، وكذلك انزيم داخل الخلايا (الشكل 5B) والبروتين (أرقام 5C ود). لمزيد من الأمثلة، مثل العوامل المساعدة أو الجزيئات الصغيرة، يرجى الرجوع إلى يير وآخرون (2012) ويير وآخرون (2013).

<.......

Discussion

وقد فتحت التكنولوجيا على microfluidics إمكانيات جديدة ورائعة للتحليل وحيدة الخلية. على وجه الخصوص، وإمكانية اعتراض وشل الخلايا بشكل فردي عن طريق أدوات ميكروفلويديك سمحت دراسات منهجية على المدى القصير والطويل على خصائص وحيدة الخلية والاستجابة لها. بالإضافة إلى ذلك، التغليف من الخلايا في microdroplets عالية التردد، ولدت على رقاقة، مكنت الدراسات إفراز خلية واحدة، والتي لا يمكن أن يؤديها مع أجهزة الخلوي التقليدية. النهج microdroplet، ومع ذلك، لديها بعض القيود عندما يطلب الحضانة وغسل ا.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي> الكواشف: < / قوي>
اسم	تعليقات رقم كتالوج شركة		الكاشف (اختياري)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon ، MA)	n.a.1H
، 1H ، 2H ، 2H - Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane	ABCR (كارلسروه ، ألمانيا)	AB103608
4-Methylumbelliferyl & beta ؛ -D-N ، N′-diacetylchitobioside hydrate	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (دارمشتات ، ألمانيا)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (فيسبادن ، ألمانيا)	n.a.AZ
726 المطور	AZ Electronic Materials (فيسبادن ، ألمانيا)	n.a.
ألبومين مصل الأبقار	Sigma Aldrich	A-4503
ألبومين مصل البقر ، البيوتين	Sigma Aldrich	A-8549
عازلة تفكك الخلايا	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
حمض الهيدروكلوريك	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (دارمشتات ، ألمانيا)	109634
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	Fluka	63068
MR مطور 600	Microresist technology GmbH (برلين ، ألمانيا)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG المطعمة	SuSoS ، (Dü بندورف ، سويسرا)	n.a.PLL-g-PEG
البيوتين المطعمة	SuSoS ، (Dü بندورف ، سويسرا)	n.a.كلوريد
البوتاسيوم	فلوكا	60132
بروتين G ، البيوتين	سيجما فاين كيماويات	41624
رقاقة السيليكون	Si-Mat (Kaufering ، ألمانيا)	n.a.Sylgard
184 سيليكون المطاط الصناعي كيت (PDMS)	داو كورنينج	39100000
تريس (هيدروكسي ميثيل) - أمينوميثان	بيوراد	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT: < / strong>
اسم المادة		كتالوج	الشركة تعليقات (اختياري)
0.22 & micro ؛ م PES حقنة مرشح	TRP	99722
1 / 1.5 مم خزعة لكمة	Miltex ، يورك PA	33-31AA / 33-31A
مرشح خلية Trics 20 & micro ؛ m	Partec	04-004-2325
جهاز طرد مركزي Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Hotplate
HP 160 III BM	Sawatec ، ساكس ، سويسرا	n.a.MA-6
محاذاة قناع	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M مجهر	نيكون شركة	نيكون n.a.Photomask
	Microlitho ، إسيكس ، المملكة المتحدة	n.a
منظف البلازما PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
Coater Modell WS-400 BZ-6NPP / LITE	Laurell	n.a.Spin
Modules SM 180 BM	Sawatec ، Sax ، سويسرا	n.a.Step
profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.مضخة
حقنة و MESYS	Cetoni	n.a.