مقالة منهجية

رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

DOI:

10.3791/50618

⸱

أكتوبر 15, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم جهاز ميكروفلويديك التي تمكن من تحديد كمية الجزيئات الحيوية داخل الخلايا في الخلايا وحيدة متعددة في نفس الوقت. لهذا الغرض، محاصرون الخلايا بشكل سلبي في منتصف microchamber. عند تفعيل طبقة تحكم، يتم عزل الخلية من حجم المحيطة في غرفة صغيرة. ويمكن بعد ذلك يتم تبادلها حجم المحيطة دون التأثير على الخلايا المعزولة. ومع ذلك، عند فتح وإغلاق قصيرة للغرفة، والحل في غرفة يمكن استبدالها في غضون بضع مئات من ميلي ثانية. ويرجع ذلك إلى العودة إلى الوراء من الغرف، والخلايا يمكن أن يتعرض لها حلول مختلفة بالتتابع بطريقة التحكم الى حد كبير، على سبيل المثال للحضانة، والغسيل، وأخيرا، تحلل الخلية. وmicrochambers مغلقة بإحكام تمكين الاحتفاظ المحللة، وتقليل والسيطرة على التخفيف بعد تحلل الخلية. منذ تحلل والتحليل تحدث في نفس المكان، ويتم الاحتفاظ حساسية عالية لأنه لا يوجد مزيد من دilution أو فقدان التحاليل يحدث أثناء النقل. وبالتالي فإن تصميم microchamber يتيح تحليل موثوق بها وقابلة للتكرار من الأرقام نسخة صغيرة جدا من الجزيئات داخل الخلايا (attomoles، zeptomoles) صدر من الخلايا الفردية. علاوة على ذلك، يمكن ترتيب العديد من microchambers في شكل مجموعة، والسماح للتحليل العديد من الخلايا في آن واحد، نظرا إلى أن تستخدم الأجهزة البصرية مناسبة للرصد. وقد استخدمنا بالفعل منصة لإثبات صحة مفهوم الدراسات لتحليل البروتينات داخل الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة والمرسلين الثاني بطريقة قابلة للقياس الكمي إما النسبية أو المطلقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد كشفت العديد من الدراسات في الماضي خلية الى خلية الخلافات بين السكان زنزانة كبيرة 1-3، ولا سيما إشارات العمليات 4، أو مبالغ الجزيئات الحيوية مثل البروتينات داخل الخلايا 5،6، الأيض، والعوامل المساعدة 7،8. وتعتبر هذه التغاير أن يكون أهمية أساسية للتكيف الخلايا والتطور 9، ولكن أيضا أن تلعب دورا رئيسيا في ظهور والعلاج من الأمراض مثل السرطان 10-13. وبالتالي، دراسات على مستوى خلية واحدة هي من الفائدة المرتفعة في الأبحاث البيولوجية والدوائية، وخاصة إذا تكشف هذه الدراسات ردود مختلفة من الخلايا بعد العلاج مع المواد الكيميائية النشطة بيولوجيا.

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت العديد من المنصات التحليلية التي تسهل تحليل الخلايا الحية واحدة أو التركيب الكيميائي لمحتوى الخلية. بينما الفلورسنت خلية تنشيط الفرز (FACS) هو الذهب الحادي وANDARD لتحليل الإنتاجية العالية جدا من الخلايا الحية واحدة، وطريقة لا يمكن أن تستخدم لتقدير حجم المركبات داخل الخلايا أو يفرز. وقد وعدت ظهور منصات ميكروفلويديك استراتيجيات تحليلية جديدة لتحديد المواقع، والمعالجة والمراقبة للخلايا واحدة. وتم التوصل إلى علامة فارقة في على microfluidics مع دمج PDMS مرن الصمامات التي حققتها الزلزال وزملاء العمل 14،15. هذه الصمامات هي مفيدة لأنها يمكن عزل مناطق في الرقاقة، مثل فصل ثقافتين 16. علاوة على ذلك، كانت قابلة للتطبيق وخاصة بالنسبة للتحليل خلية واحدة، وبالتالي يساعد على تقليل المشاكل التخفيف تحليلها. قوة هذا النهج للتحليل وحيدة الخلية وقد تجلى مؤخرا من قبل هانسن وزملاء العمل، الذي حلل التعبير الجيني من مئات الخلايا واحد في نفس الوقت 17.

عند استهداف البروتينات ونواتج الأيض، وتحليل أمر صعب جدا نظرا لعدم وجود مناسبةطرق mplification، وعدد كبير من مركبات مختلفة الحاضر، والاختلافات في الطبيعة الكيميائية. علاوة على ذلك، من المتوقع أن تكون موجودة بأعداد نسخة منخفضة في حدود بضع عشرة آلاف الجزيئات الحيوية داخل الخلايا 18 الأكثر، وبالتالي الطريقة التحليلية المستخدمة يجب أن يكون لديك حساسية عالية. فحوصات أكثر قوة مثل المناعية والمناعية انزيم مرتبط (ELISA) يصعب على الاندماج في الأجهزة ميكروفلويديك لأنها تتطلب العديد من الخطوات الغسيل والحضانة وكذلك تجميد السطح.

نظرا لهذه التحديات، فإنه ليس من المستغرب أن تم الإبلاغ سوى أمثلة قليلة حيث تم كميا البروتينات او نواتج على مستوى خلية واحدة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن دراسات على إفراز مركبات الفلورسنت 19،20. في الآونة الأخيرة، وقدم مع تنفيذ ELISA لتحليل يفرز (nonfluorescent) البروتينات من ثقافة الخلية (الخلايا THP-1) 21 واحد (طمناعية) الخلايا 10. استهداف البروتينات داخل الخلايا، شي وآخرون. تطوير جهاز ميكروفلويديك التي سهلت تحديد البروتينات داخل الخلايا لتحليل مسارات الإشارات في الخلايا السرطانية عن طريق والمناعية 11. ومع ذلك، تم تحديد كميات النسبية فقط من البروتينات، وكان يستخدم أي التضخيم الأنزيمية لزيادة إشارة للبروتينات وفرة منخفضة.

في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على الجمع بين محاصرة microdevice وحيدة الخلية مع المقايسات المناعية مضان 8 و 22 (الشكل 1). محاصرون الخلايا بشكل سلبي في الهياكل عقبة microsized، والتي تسمح العرض والصرف (السريع) من العوامل الكيميائية الأخرى المتوسطة ودون أي حركة الخلايا. صمام على شكل حلقة حول كل فخ يمكن عزل الخلية في حجم صغير جدا ("وmicrochamber"). وهذا صمام دفعتها مباشرة بعد إدخال عازلة الخلايا lysing (hypoosmolar)، وقال انهالامتحانات التنافسية الوطنية ومنع الجزيئات داخل الخلايا أو الجزيئات يفرز لنزع فتيل بعيدا. الأهم من ذلك، ونظرا لصغر حجم وحدة التخزين (625 رر) يتم تجنب تخفيف كبير من الجزيئات. علاوة على ذلك، منذ يتم تنفيذ تحلل والتحليل في في نفس الموقف في رقاقة، ليست هناك خسارة من analytes بسبب النقل. تصميم رقاقة الموصوفة هنا تضم ​​8 صفوف بالتناوب إما 7 أو 8 microchambers، بلغ مجموعها 60 microchambers. ودفعتها في غرف الصفوف، بحيث تنتفي صفة انتقال التلوث على طول الخط.

منصة يمكن استخدامها في تركيبة مع المقايسات مضان فضلا عن المقايسات المناعية (الشكل 1D). لهذا الأخير، أنشأنا بروتوكولات لتجميد الأجسام المضادة، التي تتوافق مع إنتاج رقاقة وعملية التجميع. وبالتالي منصة يفتح الطريق لفحوصات حساسة وموثوقة وقابلة للقياس الكمي على مستوى خلية واحدة. حتى الآن، وقد استخدمنا جهاز لتحليل طالانزيمات ntracellular ويفرز (الكمي النسبي الذي المقايسات الأنزيمية)، العوامل المساعدة داخل الخلايا والبروتينات والجزيئات الصغيرة (الكمي المطلق من قبل المقايسات نقطة النهاية أو ELISA). في ما يلي، ونحن تصف عملية تصنيع رقاقة عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة متعدد الطبقات وبروتوكولات لالزخرفة من الأجسام المضادة عن طريق microcontact الطباعة والكيمياء السطح. بالإضافة إلى ذلك، يتم إعطاء بعض الأمثلة على استخدام رقاقة والعمليات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SU-8 تلفيق ماستر

إعداد كل من القوالب الرئيسية لقنوات (فلويديك والسيطرة، لالخطط وأبعاد انظر الشكل 2) مع بروتوكول التالي ولكن مع أنماط مختلفة قناع. يظهر عملية في الشكل 3A.

  1. تبدأ عن طريق تسخين 4 بوصة رقاقة السيليكون لمدة 10 دقيقة على حرارة 180 درجة مئوية. تحميل رقاقة المجففة على المغطي تدور واستخدام بروتوكول التالية لتدور طلاء SU-8 عام 2015:
    1. تدور رقاقة في 100 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية (الغطاء مفتوحا من تدور المغطي، الاستغناء SU-8 خلال هذه الخطوة، غطاء قريبة بعد الاستغناء).
    2. تدور رقاقة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية (وهذا سوف ينشر مقاومة على رقاقة كله).
    3. تدور رقاقة في 1،750 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (يحدد ارتفاع مقاومة إلى 20 ميكرون).
  2. إزالة مقاومة من على حافة الرقاقة مع الأسيتون (استخدام مسحة) حيث سيؤدي ذلك إلى عصا إلا إلى موقد في الخطوة التالية. نقل الرقاقة لآهotplate في 95 درجة مئوية والحرارة لمدة 4 دقائق. بعد softbake، فضح مقاومة من خلال الضوئية مسجلة لsodalime الزجاج في اليجنر قناع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (150 ميغا جول / سم 2، وتقاس في 365 نانومتر).
  3. بعد التعرض، وتسخين ويفر مرة أخرى في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على موقد. تهدئة رقاقة لRT ومن ثم تزج في حمام من SU-8 المطور لمدة 4 دقائق. يهز بلطف لإزالة غير معلن SU-8. غسل الرقاقة مع غرفة نظيفة الصف الأيزوبروبانول وضربة الجافة مع النيتروجين. تحقق تحت المجهر إذا كانت التنمية الناجحة (لا سيما الفخاخ الخلية). إذا وضعت الفخاخ الخلية تماما، ينبغي أن تكون انعكاسا للرقاقة السيليكون مرئية. إذا لزم الأمر، وتطوير رقاقة مرة أخرى لبضع دقائق.
  4. خبز الرقاقة في الفرن لمدة 2 ساعة على حرارة 180 درجة مئوية لإزالة جميع المذيبات المتبقية. تحقق ذروة القنوات مع خطوة التعريف. إذا كان ارتفاع يختلف عن الارتفاع المطلوب، وتكرار هذا البروتوكول بدءا من الخطوة 1.1 مع رقاقة جديدة وتغيير السرعة تدور (الخطوة 1.1.3). وضع اللمسات الأخيرة على تصنيع القالب الرئيسي بواسطة silanizing الرقاقة مع 1H، 1H، 2H، 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-سيلاني في مجفف بين عشية وضحاها.

2. تصنيع رئيسية لmicrocontact الطباعة

  1. من أجل إعداد قوالب رئيسية لmicrocontact الطباعة، يذوى رقاقة السيليكون لمدة 10 دقيقة على حرارة 180 درجة مئوية. تدور معطف 1 مل HDMS على هذه الرقاقة عند 7،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (في مقاومة تتمسك أفضل لسطح silanized). تدور معطف 2 مل من AZ1518 مقاومة إيجابية مع هذا البروتوكول:
    1. الاستغناء ثابت للمقاومة إلى الرقاقة.
    2. تدور رقاقة لمدة 5 ثانية في 500 دورة في الدقيقة.
    3. تدور رقاقة لمدة 60 ثانية في 4000 دورة في الدقيقة.
  2. بعد ثانية softbake 50 عند 100 درجة مئوية على موقد، فضح مقاومة للأشعة فوق البنفسجية ضوء (21 ميغا جول / سم 2 في 365 نانومتر) من خلال الضوئية وعلى اليجنر قناع. تطوير مقاومة في حمام من الالف الى الياء 726 لمدة 75 ثانية. شطف الرقاقة وضعها مع الماء DI-وضربة دراي مع النيتروجين. إزالة المذيبات المتبقية عن طريق تسخين الرقاقة عند 115 درجة مئوية لمدة 50 ثانية. Silanize الرقاقة تحت فراغ بين عشية وضحاها.

3. تصنيع رقاقة ميكروفلويديك

ويستخدم تصميم الجهاز من طبقتين لهذه التجارب. يتم إعداد الطبقتين على حدة ومستعبدين معا، قبل المستعبدين رقاقة أخيرا على شريحة زجاجية (الشكل 3B). ويصف هذه الخطوة إنتاج PDMS طبقات وختم PDMS لmicrocontact الطباعة.

  1. إعداد 10:01 خليط من PDMS وكيل المعالجة. إعداد حوالي 80 ز PDMS في المجموع (باستخدام التصاميم، وهذا سوف يؤدي إلى رقائق 10). مزيج جزأي بقوة وديغا في PDMS حتى يصبح الخليط هي فقاعة مجانا (~ 30 دقيقة).
  2. وضع رقاقة مع طبقة التحكم داخل طبق بتري والشريط وضعها على الجزء السفلي. المقبل، صب ~ 50 غرام من PDMS على رأس ووضع رقاقة لا يقل عن 2 ساعة في الفرن على 80 درجة مئوية لضمان كاملةعلاج من PDMS. كرر نفس الإجراء لرقاقة microcontact الطباعة، لهذا هناك حاجة ~ 20 ز PDMS.
  3. تدور معطف PDMS على رقاقة مع طبقة فلويديك بسرعة دوران 2،000 دورة في الدقيقة لتشكيل طبقة PDMS عالية حوالي 40 ميكرون. علاج PDMS في الفرن لمدة 1 ساعة على الأقل في 80 ° C.
  4. عندما يشفى كلا الجزأين، وإزالة طبقة التحكم من رقاقة ومقطعة إلى قطع بشفرة حلاقة. لكمة ثقوب اتصال الضغط باستخدام 1 ملم خزعة الناخس. للتخزين، فإنه من المستحسن أن وضع قطعة من الشريط على القنوات.
  5. السندات طبقتين، واتخاذ الرقاقة المغلفة تدور والجزء العلوي ووضعها في نظافة البلازما 23. بعد العلاج البلازما، بسرعة محاذاة كلا أجزاء تحت المجهر مع مسافة العمل الكبيرة. إضافة بعض PDMS الغيار حول الأجزاء العليا وضعت. هذه الخطوة ليست إلزامية، إلا أنه يسهل إزالة PDMS من رقاقة. وضع الرقاقة في الفرن على 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
  6. استخدام مشرط لإزالة بعناية PDMS من رقاقة وقطع الرقائق. لكمة ثقوب الوصول للاتصالات فلويديك مع 1.5 ملم خزعة الناخس.
  7. الانتهاء من رقاقة PDMS الآن ويمكن تخزينها لعدة أشهر. اختياري: إذا تم استخدام رقاقة مع الخزان، وقطع الجزء العلوي من غيض ماصة 200 ميكرولتر واستخدام بعض قطع الغيار، PDMS شبه شفي الغراء على القمة. وضع رقاقة في الفرن مرة أخرى في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.

4. الترابط لزجاج الشرائح

لاستخدام الجهاز لفحوصات الأنزيمية المباشر، فإن الخطوة الوحيدة المطلوبة بعد الترابط هو حجب السطوح. لهذا البروتوكول، انتقل إلى A. ومع ذلك، لاستخدام رقاقة ميكروفلويديك لالمناعية أو ELISAs، يرجى الرجوع إلى بروتوكول B للحد من مواقع الربط فقط على شريحة زجاجية (أي للفحص المجهري TIRF أو SPR). إذا كان هذا التقييد ليست مهمة، تشير إلى A، ولكن استخدام تقارن البيروكسيديز في الخطوة 4.3 وتابع مع الخطوة 4.8في بروتوكول B لخلق سطح ظيفية بالكامل.

قبل تنفيذ بروتوكول A و B: ومن المستحسن لتصفية كل الحلول البروتين المستعملة قبل تعريفهم في رقاقة. الحطام والركام البروتين قد منع وإلا الفخاخ الخلية، مما يؤدي إلى خفض عدد الدوائر التي يمكن استخدامها للتحليل. لهذا الغرض، واستخدام وحدة التكثيف اللابروتيني مرشح لتصفية كل الحلول قبل ادخالها في القنوات.

بروتوكول A (المقايسات الأنزيمية)

  1. لوضع اللمسات الأخيرة على جهاز ميكروفلويديك، والسندات وأجزاء PDMS على شريحة زجاجية. للقيام بذلك، وتنظيف أول شريحة زجاجية مع الصابون والماء المقطر والإيثانول. تجف الشريحة باستخدام تيار النيتروجين. تنظيف الجزء PDMS مع الاسكتلندي.
  2. وضع الجزء PDMS وشريحة زجاجية تنظيفها في نظافة البلازما لمدة 45 ثانية في 18 دبليو ولضمان الترابط مشددة، ووضع شريحة على طبق ساخن (100 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
  3. بعد الترابط، وملء مع رقاقة وluids. طريقة سهلة لتحقيق ذلك هو استخدام قوة الطرد المركزي. قطع الجزء السفلي من 200 ميكرولتر ماصة. للقنوات فلويديك، ملئها عرقلة الحل (ألبومين المصل البقري (4٪ ث / ت) أو بولي-L-يسين) المطعمة غليكول البولي إثيلين (0.05٪ ث / ت) ووضع نصائح في مداخل. ملء سيطرة طبقة مداخل إما مع الماء أو مع حل متسق الضغط التناضحي، على سبيل المثال برنامج تلفزيوني. وضع رقاقة في أجهزة الطرد المركزي (800 x ج) لمدة 5 دقائق. القنوات ينبغي أن تملأ الآن مع السائل تماما. إذا لم يكن كذلك، كرر هذه الخطوة.
  4. احتضان عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الحل للخروج من طبقة السائل مع برنامج تلفزيوني بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة الحقنة. الجهاز هو الآن جاهز للتجارب الخلية.

بروتوكول B (المناعية)

لمحة كاملة من تعديل السطح من الخطوة 4.7 فصاعدا، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1.

  1. فيPDMS الطوابع cubate لmicrocontact الطباعة مع حل bBSA / BSA (على سبيل المثال 1-100). بعد 30 دقيقة، وتنظيف الطوابع جيدا بالماء المقطر وتجفيف الطوابع تحت تيار من النيتروجين. وضع بسرعة الطوابع على شريحة زجاجية تنظيفها (الشكل 4).
  2. فضح شريحة زجاجية مع ختم جنبا إلى جنب مع الجزء العلوي من رقاقة ميكروفلويديك إلى البلازما الأكسجين لمدة 45 ثانية في أقصى قدر من السلطة (18 ث) في نظافة البلازما. بعد العلاج البلازما، وإزالة الطابع ومحاذاة السطح المطبوع تحت microchambers من الجهاز. وضع رقاقة لمدة 30 دقيقة على طبق ساخن عند 50 درجة مئوية.
  3. لمنع سطح المتبقية، وإدخال العقيمة التي تمت تصفيتها حل جيش صرب البوسنة (4٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني) في رقاقة مع جهاز للطرد المركزي (انظر الخطوة 4.2). احتضان لمدة 1 ساعة ويغسل الحل للخروج من طبقة السائل مع برنامج تلفزيوني (انظر الخطوة 4.3). ويمكن بعد ذلك أن تستخدم رقاقة مباشرة أو تخزينها لمدة تصل الى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية في مربع الرطبة.
  4. لالسطحية ملزمة تعمل بكامل طاقتهاه، وإدخال أفيدين (0.025٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني) في المكمن. استخدام معدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة لمدة 30 دقيقة لسحب الحل أفيدين من خلال القنوات السوائل. بعد ذلك، طرد برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. شطف الخزان تماما.
  5. بعد ذلك، إضافة بروتين G (0.0025٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني)، وتدفق لمدة 30 دقيقة أخرى. يغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة أخرى بعد ذلك. المقبل، إضافة الضد من مصلحة (0.0001٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة. بعد 10 دقيقة، ووقف تدفق لمدة 15 دقيقة للسماح ملزمة. المقبل، ويغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.

5. تجارب الخلايا

هو مكتوب البروتوكول بصفة عامة بسبب مجموعة متنوعة من فحوصات ممكن. كمثال ترد الكواشف اللازمة لفحص السمية G6PDH. الخلية محاصرة الكفاءة الأولي من الجهاز هو حوالي 2.5٪، أي سيتم المحاصرين 5 من أصل 200 خلية. إشغال النهائي من الفخاخ الخلية تعتمد بقوة على خط الخلية المستخدمة، وبروتوكول لتعليقخط الخلية والوقت يتم مسح الخلايا من خلال القناة. للخلايا تنمو بصورة طبيعية في التعليق (مثل U937)، والخلايا واحدة يمكن العثور عليها في نحو 75٪ من الغرف بعد بضع دقائق. إما لا شغل غرف أخرى أو المحتلة من قبل اثنين أو أكثر من الخلايا. بشكل عام، وشغل وحيدة الخلية أصغر لخطوط الخلايا الملتصقة. عند استخدام بروتوكول بتوقيف خفيفة بدلا المعروضة هنا، يقلل من نسبة 30٪ إلى حوالي (كلوة الجنين البشري، وخلايا MLT). يمكن تحسين الإشغال وحيدة الخلية عن طريق العلاج التربسين من الخلايا، ولكن هذا قد تغير أيضا نتائج التجارب.

اعتمادا على الجزيء المستهدف، والامتزاز أو الامتصاص لPDMS يمكن أن تؤثر على النتائج. ويمكن تخفيض امتصاص من خلال منع الأسطح مع BSA أو PLL-G-PEG. امتصاص غير المحتمل بالنسبة لمعظم الجزيئات الحيوية ماء، ولكن يجب أن يكون محددا لل(صغيرة) مكونات الخلية محبة للدهون.

  1. إعداد الخلايا وفقا لبروتوكول معين (على سبيل المثال إدمان المخدرات). لخلايا تعليق، إضافة الخلايا مباشرة إلى الرقاقة. لاصقة خطوط الخلايا، استخدم خالية من انزيم تفارق العازلة لإنتاج تعليق خلية. تحديد الخلايا قبل تعريفهم رقاقة لتقليل كمية من مجموعات الخلايا.
  2. تحميل الخلايا على شريحة باستخدام مضخة المحاقن وتدفق إلى الأمام، بدلا من سحب التعليق الخلية. استخدام معدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة للخطوط الخلايا التعليق وارتفاع معدلات تدفق 10-20 ميكرولتر / دقيقة لخلايا لاصقة منذ للحد من المرفقات غير محدد من الخلايا على الجدران القناة.
  3. عندما تمتلئ الفخاخ، وإغلاق الدوائر. إذا العديد من الخلايا التمسك nonspecifically إلى السطح، في محاولة ليطهرهم مع العازلة تفارق الخلية بمعدل تدفق 10-30 ميكرولتر / دقيقة.

بروتوكول A (المقايسات الأنزيمية)

  1. سحب العازلة تحلل من خلال رقاقة. لهذا المثال، هذا المخزن المؤقت هو منطقة عازلة مع hypoosmolar أضاف توين 20 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 1٪ (V / V) توين 20). للتحلل، والغرف المفتوحة بسرعة وعلى مقربة (أي 500 ميللي ثانية لمعدلات تدفق 10-50 ميكرولتر / دقيقة 7،21). لفحص G6PDH، إضافة 2 ملي الجلوكوز 6 فوسفات، 0.5 ملي NADP، و 0.5 U / مل ديافوراز و 0.3 ملي ريسازورين إلى تحلل العازلة. بدء مراقبة رد الفعل الحركية مباشرة بعد تحلل.

ملاحظة: اختر أي العازلة الذي هو مناسبة للمقايسة، ولكن عارية في الاعتبار أن المنظفات القوية (مثل تريتون، SDS) الخلايا ليز على الفور، وسوف يؤدي إلى فقدان الحليلة خلال افتتاح القاعة.

بروتوكول B (المناعية)

للحصول على وصف قصير من التجارب ELISA الخلية (معدلات التدفق، والوضع غرفة، الخ)، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1.

  1. لELISA، إضافة كاشف الكشف المطلوبة (مثل الأجسام المضادة الثانوية، مستضد المسمى) مباشرة إلى تحلل العازلة. أضاف هنا Tweeن 20 يقلل من امتصاص غير محددة. ليز الخلايا وفقا للخطوة 5.4. احتضان الخليط لمدة 10-15 دقيقة للسماح ملزمة (فترة حضانة اعتمادا على مستضد الضد والمستعملة).
  2. تقارن انزيم الأجسام المضادة التي كثف nonspecifically على الجدران قناة يمكن أن يؤدي إلى تحويل كاشف الكشف بالفعل داخل الخزان والقنوات. للحد من هذه القضايا الامتزاز، طرد المانع الدائم للانزيم الكشف المستخدمة من خلال رقاقة خلال فترة الحضانة (مغلقة الدوائر، قبل أن يضيف كاشف الكشف). لبرنامج الصحة الإنجابية، استخدم 20 ملي حمض الهيدروكلوريك في الماء لإبطال نشاط الانزيمات كثف nonspecifically بشكل دائم.
  3. بعد فترة حضانة، وإدخال كاشف الكشف (مثل Amplex الأحمر وبيروكسيد الهيدروجين لHRP) إلى الرقاقة. فتح غرف أخرى قريبا لغسل الأجسام المضادة الثانوية nonbound بعيدا وإضافة كاشف الكشف. بدء مراقبة رد الفعل الحركية على الفور.
  4. المعايرة: شلالأجسام المضادة ضد الهدف من الفائدة. غرف قريبة. إعداد تركيزات مختلفة من الحليلة في المخزن أو في الخلية المحللة خارج الرقاقة. تطبيق التركيز على رقاقة وبسرعة تبادل حجم داخل الغرف (500 ميللي ثانية افتتاح الوقت). هذه المرة افتتاح قصيرة بما فيه الكفاية لضمان عدم تراكم إضافية يحدث من الحليلة التنظيف، ويتم الكشف عنها فقط عدد معين من جزيئات من حجم microchamber. من تركيز معروف من المستضد داخل الحل وحجم الغرفة (625 رر)، وحساب كمية داخل الغرفة. بعد ذلك، تابع مع الخطوة 5.5 وإدخال شاردة الكشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برنامجنا هو قادرا على تحليل مجموعة متنوعة من الخلايا وكذلك جزيئات يفرزها موجودة في أو التي تنتجها الخلايا واحد. هنا، نود أن تقديم دراسات سبيل المثال مختلفة للتأكيد على مجموعة متنوعة من فحوصات ممكن. وسنقدم مثالا للانزيم يفرز (الشكل 5A)، وكذلك انزيم داخل الخلايا (الشكل 5B) والبروتين (أرقام 5C ود). لمزيد من الأمثلة، مثل العوامل المساعدة أو الجزيئات الصغيرة، يرجى الرجوع إلى يير وآخرون (2012) ويير وآخرون (2013).

<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد فتحت التكنولوجيا على microfluidics إمكانيات جديدة ورائعة للتحليل وحيدة الخلية. على وجه الخصوص، وإمكانية اعتراض وشل الخلايا بشكل فردي عن طريق أدوات ميكروفلويديك سمحت دراسات منهجية على المدى القصير والطويل على خصائص وحيدة الخلية والاستجابة لها. بالإضافة إلى ذلك، التغليف من الخلايا في microdroplets عالية التردد، ولدت على رقاقة، مكنت الدراسات إفراز خلية واحدة، والتي لا يمكن أن يؤديها مع أجهزة الخلوي التقليدية. النهج microdroplet، ومع ذلك، لديها بعض القيود عندما يطلب الحضانة وغسل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب الامتنان توم روبنسون للقراءة دليل على المخطوطة، C. BÄRTSCHI وH. بنز لبناء نظام مراقبة ضغط مبنية خصيصا. نود أيضا أن نعترف استخدام مركز المجهر الضوئي (LMC)، وكلاهما في ETH زيورخ أول مرفق غرفة نظيفة و. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شركة ميرك سيرونو ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الإطار 7 (ERC ابتداء غرانت، المشروع رقم 203428، nμLIPIDs).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> الكواشف: < / قوي>
اسمتعليقات رقم كتالوج شركةالكاشف (اختياري)
SU-8 2015MicroChem Corp. (Netwon ، MA)n.a.1H
، 1H ، 2H ، 2H - Perfluorodecyl-dimethylchloro-silaneABCR (كارلسروه ، ألمانيا)AB103608
4-Methylumbelliferyl & beta ؛ -D-N ، N′-diacetylchitobioside hydrateSigma AldrichM9763
AcetoneMerck VWR (دارمشتات ، ألمانيا)100014
AvidinAppliChem (Axon Lab AG)A-2568
AZ 1518AZ Electronic Materials (فيسبادن ، ألمانيا)n.a.AZ
726 المطورAZ Electronic Materials (فيسبادن ، ألمانيا)n.a.
ألبومين مصل الأبقارSigma AldrichA-4503
ألبومين مصل البقر ، البيوتينSigma AldrichA-8549
عازلة تفكك الخلاياInvitrogen13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)Sigma Aldrich40215
حمض الهيدروكلوريكFluka84422
IsopropanolMerck VWR (دارمشتات ، ألمانيا)109634
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومFluka63068
MR مطور 600Microresist technology GmbH (برلين ، ألمانيا)n.a.PBS
Invitrogen10010-031
PLL-g-PEG المطعمةSuSoS ، (Dü بندورف ، سويسرا)n.a.PLL-g-PEG
البيوتين المطعمةSuSoS ، (Dü بندورف ، سويسرا)n.a.كلوريد
البوتاسيومفلوكا60132
بروتين G ، البيوتينسيجما فاين كيماويات41624
رقاقة السيليكونSi-Mat (Kaufering ، ألمانيا)n.a.Sylgard
184 سيليكون المطاط الصناعي كيت (PDMS)داو كورنينج39100000
تريس (هيدروكسي ميثيل) - أمينوميثانبيوراد1610716
Tween 20Biorad1706531
EQUIPMENT: < / strong>
اسم المادةكتالوجالشركة تعليقات (اختياري)
0.22 & micro ؛ م PES حقنة مرشحTRP99722
1 / 1.5 مم خزعة لكمةMiltex ، يورك PA33-31AA / 33-31A
مرشح خلية Trics 20 & micro ؛ mPartec04-004-2325
جهاز طرد مركزي Sigma 3-18KKuehnern.a.Hotplate
HP 160 III BMSawatec ، ساكس ، سويسراn.a.MA-6
محاذاة قناعKarl Suessn.a.Multizoom
AZ100M مجهرنيكون شركةنيكون n.a.Photomask
Microlitho ، إسيكس ، المملكة المتحدةn.a
منظف البلازما PDC-32GHarrickn.a.Spin
Coater Modell WS-400 BZ-6NPP / LITELaurelln.a.Spin
Modules SM 180 BMSawatec ، Sax ، سويسراn.a.Step
profiler Dektak XT AdvancedBrukern.a.مضخة
حقنة و MESYSCetonin.a.
رقم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microfluidic ChipSingle Cell AnalysisCell LysisFluorescence MicroscopyImmunoassay DetectionFluidic ControlPDMS FabricationChamber TrappingSolution ExchangeBiomolecule Quantification

مقالات ذات صلة