مقالة منهجية

إنشاء نظام في المختبر لدراسة السلوك داخل الخلايا للمبيضات الجلابراتا في البلاعم THP-1 البشرية

DOI:

10.3791/50625

⸱

ديسمبر 10, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Fungal Pathogenesis, Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India, 2Current location: VIB Department for Molecular Biomedical Research, UGent, Fiers-Schell-Van Montagu Building, Technologiepark 927, B-9052 Ghent (Zwijnaarde), Belgium

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدد المقالة الحالية بروتوكولا لإنشاء نظام نموذج زراعة الخلايا في المختبر لدراسة تفاعل مسببات الأمراض الفطرية البشرية الاختيارية داخل الخلايا المبيضات glabrata مع البلاعم البشرية والتي ستكون أداة مفيدة لتعزيز معرفتنا بآليات الفراوعة الفطرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يكون نظام نموذج زراعة الخلايا ، إذا كان يحاكي عن كثب الظروف البيئية للمضيف ، بمثابة بديل غير مكلف وقابل للتكرار وقابل للتلاعب بسهولة لأنظمة النماذج الحيوانية لدراسة خطوة محددة من عدوى مسببات الأمراض الميكروبية. تم استخدام خط الخلايا البشرية أحادي الخلية THP-1 الذي ، عند علاج إستر فوربول ، إلى ضامة ، لدراسة استراتيجيات الفوعة للعديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا بما في ذلك المتفطرة السلية. هنا ، نناقش بروتوكولا لسن نظام نموذج زراعة الخلايا في المختبر باستخدام البلاعم THP-1 لتحديد تفاعل مسببات الخميرة البشرية الانتهازية المبيضات glabrata مع الخلايا البلعمية المضيفة. هذا النظام النموذجي بسيط وسريع وقابل للشاشات الطافرة عالية الإنتاجية ، ولا يتطلب أي معدات متطورة. تستغرق تجربة عدوى البلاعم THP-1 النموذجية حوالي 24 ساعة مع 24-48 ساعة إضافية للسماح للخميرة داخل الخلايا المستردة بالنمو على وسط غني لتحليل الجدوى القائم على وحدة تشكيل المستعمرة. مثل أنظمة النماذج المختبرية الأخرى ، فإن القيد المحتمل لهذا النهج هو صعوبة استقراء النتائج التي تم الحصول عليها على دائرة خلية مناعية معقدة للغاية موجودة في المضيف البشري. ومع ذلك ، على الرغم من ذلك ، فإن البروتوكول الحالي مفيد جدا لتوضيح الاستراتيجيات التي قد يستخدمها العامل الممرض الفطري للتهرب من / مواجهة الاستجابة المضادة للميكروبات والبقاء على قيد الحياة والتكيف والتكاثر في البيئة الفقيرة بالمغذيات للخلايا المناعية المضيفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > أنواع المبيضات هي السبب الرئيسي للالتهابات الفطرية الغازية التي تهدد الحياة لدى المرضى الذين يعانون من نقص المناعة1. المبيضات glabrata ، وهي مسببات الأمراض الناشئة في المستشفيات ، هي ثاني أو ثالث أنواع المبيضات الأكثر عزلة من مرضى وحدة العناية المركزة اعتمادا على الموقع الجغرافي1-3. من الناحية التطورية ، C. glabrata ، وهي خميرة ناعمة أحادية الصيغة الصبغية ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالخميرة النموذجية غير المسببة للأمراض خميرة الخميرة من المبيضات المسببة للأمراض spp. بما في ذلك C. albicans4. تمشيا مع هذا ، C. glabrata يفتقر إلى بعض سمات الفوعة الفطرية الرئيسية بما في ذلك التزاوج والنشاط المحلل للبروتين المفرز واللدونة المورفولوجية4-5.

على الرغم من أن C. glabrata لا تشكل خيوط ، إلا أنها يمكن أن تعيش وتتكاثر في الفئران والبلاعم البشرية6-8 مما يشير إلى أنها طورت آليات فريدة للتسبب في المرض. تتوفر معلومات محدودة حول الاستراتيجيات التي تستخدمها C. glabrata للبقاء على قيد الحياة في بيئة البلاعم داخل الخلايا الفقيرة بالمغذيات ومواجهة استجابات المضيف المؤكسدة وغير المؤكسدة التي تجمعها الخلايا المناعية المضيفة5. يعد نظام نموذج البلاعم ذي الصلة شرطا أساسيا لتحديد تفاعل C. glabrata مع الخلايا البلعمية المضيفة عبر الأساليب الجينومية والبروتينية الوظيفية. خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) والضامة المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) من أصل بشري وفئران ، على التوالي ، تم استخدامها في وقت سابق لدراسة تفاعل C. glabrata مع الخلايا المناعية المضيفة7،9. ومع ذلك ، فإن صعوبة الحصول على PBMCs و BMDMs ، وعمرها المحدود وتنوعها الجوهري بين المتبرعين المختلفين للثدييات يحد من استخدام هذه الخلايا كأنظمة نموذجية متعددة الاستخدامات.

هنا ، نصف طريقة لإنشاء نظام في المختبر لدراسة السلوك داخل الخلايا ل C. glabrata الخلايا في الضامة المشتقة من خط الخلايا البشرية أحادية الخلية THP-1. كان الهدف العام من هذا البروتوكول هو سن نظام نموذج زراعة الخلايا البسيط وغير المكلف والسريع والقابل للتكرار والذي يمكن التلاعب به بسهولة لدراسة جوانب مختلفة من تفاعل مسببات الأمراض بين الفطريات المضيفة.

تم استخدام خلايا

THP-1 سابقا لفك تشفير الاستجابة المناعية للمضيف ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات10-12. من السهل الحفاظ على خلايا THP-1 أحادية الخلية ويمكن تمييزها ، عند معالجة إستر فوربول ، إلى البلاعم التي تحاكي البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية للإنسان وتعبر عن علامات البلاعم المناسبة13. تتمثل المزايا الرئيسية لنظام نموذج البلاعم THP-1 في سهولة الاستخدام وعدم وجود متطلبات معدات متطورة.

البروتوكول المقدم هنا قابل للتكيف بسهولة لدراسة تفاعل مسببات الأمراض الفطرية البشرية الأخرى مع الخلايا المناعية المضيفة. يمكن أيضا استخدام الإجراء الحالي لتحديد عوامل الفوعة لمسببات الأمراض ذات الأهمية باستخدام شاشات متحولة عالية الإنتاجية. تم تجسيد إثبات المفهوم هذا من خلال الاستخدام الناجح لنظام نموذج ثقافة THP-1 لتحديد مجموعة من 56 جينا مطلوبة لبقاء C. glabrata في البلاعم البشرية8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصى بإجراء تجارب عدوى C. glabrata في مختبر بمستوى احتواء السلامة الحيوية 2 (BSL-2).

  1. تحضير طبقة أحادية البلاعم THP-1.
  2. تحضير C. glabrata تعليق الخلية.
  3. إصابة الضامة THP-1 بخلايا C. glabrata.
  4. قياس معدل البلعمة والتكاثر داخل الخلايا عن طريق مقايسة وحدة تشكيل المستعمرة.
  5. مراقبة النسخ المتماثل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر.
فئة

1. تحضير طبقة أحادية البلاعم THP-1

  1. THP-1 هو خط خلية بشرية أحادية الخلية مشتق من الدم المحيطي لطفل ذكر يبلغ من العمر عاما واحدا يعاني من سرطان الدم وحيد الخلية الحاد14. يتم الحفاظ على THP-1 ، وهو خط خلوي معلق ، بشكل روتيني عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربونالمرطب 2 في وسط استزراع RPMI-1640 المكمل بنسبة 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنينية). يؤدي العلاج بفوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA ، إستر فوربول) إلى التمايز النهائي للخلايا أحادية الخلية THP-1 إلى ضامة. الأهم من ذلك ، أن علاج PMA لا يؤثر على بقاء الخلايا ولا تنقسم الخلايا المتمايزة.
  2. قم بزرع ما يقرب من 1.5 × 106 THP-1 أحادية الخلايا في أطباق استزراع 100 مم في وسط RPMI-1640 كامل (متوسط RPMI-1640 مكمل بمصل 10٪ ، 2 ملي مولار جلوتامين و 1x مضادات حيوية ؛ 10 مل / طبق) واترك الخلايا تنمو عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة يومين.
  3. بمجرد أن تصل خلايا THP-1 إلى كثافة 8 × 105 خلايا / مل ، انقل طبق الثقافة إلى غطاء التدفق الصفحي لثقافة الخلية وقم بتدويره برفق لإعادة تعليق الخلايا المستقرة.
  4. ماصة تعليق الخلية للخارج، ضعها في أنبوب معقم سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 1,000 دورة في الدقيقة (130 × جم) لمدة 4 دقائق.
  5. تعداد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وتخفيف معلق الخلية إلى كثافة نهائية تبلغ 106 خلايا / مل مع وسط كامل RPMI-1640 مسخن
    6. مسبقا
  6. أضف 1 ميكرولتر من مخزون PMA 160 ملي مولار (محلول فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات محضر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد) إلى 10 مل معلق خلية THP-1 (التركيز النهائي 16 نانومتر) واخلطه جيدا. قم بتوزيع معلق الخلية 1 مل في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا واحتضان اللوحة في الحاضنة التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 12 ساعة.
  7. قم بإزالة الوسط القديم ، وأضف 1 مل من الوسط الكامل RPMI-1640 المسخن مسبقا واسمح للخلايا بالتعافي لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  8. راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب للتأكد من أن الخلايا أحادية الخلية THP-1 البيضاوية الشكل في المعلق قد تم تمايزها إلى ضامة مسطحة على شكل مغزل وملتصقة. هذه الخلايا المتمايزة جاهزة الآن لإجراء دراسات عدوى C. glabrata.
فئة

2. تحضير تعليق خلية C. glabrata

C. glabrata سيتم استخدام سلالة Bg2 لإصابة البلاعم THP-1. يتم زراعة خلايا C. glabrata بشكل روتيني في وسط YPD السائل (مستخلص الخميرة (1٪) - الببتون (2٪) - سكر العنب (2٪)). يتم تحضير وسط YPD الصلب بإضافة 2٪ أجار قبل التعقيم المتوسط.

  1. لتحضير ثقافة C. glabrata ، اختر مستعمرة واحدة من صفيحة الأجار بحلقة معقمة يمكن التخلص منها وقم بتلقيحها في وسط سائل YPD سعة 10 مل واحتضانها لمدة 14-16 ساعة مع الرج (200 دورة في الدقيقة) عند 30 درجة مئوية.
  2. جهاز الطرد المركزي هذه الثقافة (1 مل) عند 4,000 دورة في الدقيقة (1,800 × جم) لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS معقم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4) وتعليق حبيبات الخلية في 1 مل PBS.
  3. قم بقياس OD600 من C. glabrata تعليق الخلية وتخفيفه بحجم مناسب من PBS المعقم للحصول على كثافة 2 × 106 خلايا / مل (OD600 = 0.1). بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق كثافة الخلايا المطلوبة عن طريق حساب خلايا الخميرة باستخدام مقياس كثافة الدم.
< p class = "jove_title" >3. إصابة البلاعم THP-1 بخلايا C. glabrata

  1. أضف 50 ميكرولتر C. معلق الخلية glabrata إلى البلاعم THP-1 (106 خلايا مصنفة لكل بئر من صفيحة استزراع 24 بئرا) للحصول على MOI (تعدد العدوى) 0.1 واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. لتحديد عدد الخميرة القابلة للحياة ، قم بتخفيف 50 ميكرولتر C. معلق الخلية glabrata 100 ضعفا في PBS معقم ولوحة 100 ميكرولتر على وسط صلب YPD. احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية واحسب يدويا عدد مستعمرات الخميرة التي تظهر بعد 1-2 أيام. هذه الأرقام, من الآن فصاعدا, سوف يشار إليها باسم 0 ساعة C. glabrata CFUs (وحدات تشكيل المستعمرة).
  3. بعد ساعتين من التثقيف لخلايا THP-1 مع C. glabrata الخلايا ، تخلص من وسط الثقافة عن طريق قلب لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا في خزان واغسلها برفق ثلاث مرات باستخدام PBS المعقم الدافئ مسبقا لإزالة خلايا C. glabrata خارج الخلية. تعتبر الغسالات اللطيفة باستخدام PBS ضرورية للغاية لإنجاز الإزالة الكاملة لجميع الخميرة خارج الخلية دون التسبب في أي ضرر لطبقة أحادية البلاعم THP-1.
< p class = "jove_title" >4. قياس معدل البلعمة والتكاثر المتماثل داخل الخلايا عن طريق فحص وحدة تشكيل المستعمرة

  1. Lyse C. glabrata مصابة البلاعم THP-1 في 1 مل معقم H2O لمدة دقيقتين ، اكشط برفق لإزالة بقايا البلاعم من البئر وجمع محللة الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. يعد التحقق المجهري من تحلل البلاعم الكامل أمرا محوريا لاستعادة جميع الخميرة الداخلية.
  2. قم بإعداد تخفيف 100 ضعف من المحللة في PBS المعقم ، ولوحة 100 ميكرولتر على وسط صلب YPD واحتضان الألواح عند 30 درجة مئوية.
  3. بعد 1-2 أيام ، عد يدويا عدد C. glabrata مستعمرات التي ظهرت على وسط YPD ، واضرب بعامل التخفيف (2 ساعة CFUs) واحسب معدل البلعمة الذي يشير إلى النسبة المئوية ل C. glabrata الخلايا التي يتم تناولها بواسطة الضامة THP-1 بعد 2 ساعة من التكاثر باستخدام الصيغة التالية.
    ٪ البلعمة = [(CFUs في 2 ساعة) / (CFUs عند 0 ساعة)] X 100
  4. لقياس معدل التكاثر داخل الخلايا ل C. glabrata الخلايا في الضامة THP-1 ، اجمع الخميرة داخل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة ، أي 4 و 6 و 8 و 10 و 12 و 24 ساعة ، عن طريق تكرار الخطوات 3.3-4.3.
  5. احسب بقاء أضعاف / النسخ المتماثل ل C. glabrata الخلايا في الضامة THP-1 عن طريق قسمة إجمالي CFUs في أي نقطة زمنية معينة مع تلك الموجودة في 2 ساعة (الخميرة البلعمة).
فئة

5. مراقبة النسخ المتماثل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر

  1. باتباع الخطوات الموضحة في القسم 1 ، خضوع الخلايا المعالجة بالبذور 5 × 105 THP-1 في كل بئر من شريحتين من أربع آبار وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 12 ساعة.
  2. استبدل الوسط القديم بوسط RPMI-1640 كامل مسخن مسبقا واسمح للخلايا بالتعافي من علاج PMA لمدة 12 ساعة.
  3. قم بإعداد GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) الموسومة بمعلق خلية C. glabrata كما هو موضح في القسم 2 وإصابة الضامة THP-1 إلى وزارة الداخلية 1. إذا لم تكن سلالات C. glabrata التي تعبر عن GFP متوفرة ، فيمكن استخدام خلايا الخميرة المصنفة ب FITC (الفلورسين إيزوثيوسيانات) لمراقبة الأحداث المبكرة بعد الإصابة ، أي معدل البلعمة والنضج البلعمي عند ساعتين.
  4. احتضن الشرائح لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، واقلبها بعناية للتخلص من الوسط واغسلها 3x باستخدام PBS معقم ودافئ مسبقا.
  5. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل RPMI-1640 الدافئ مسبقا إلى كل غرفة من شريحة واحدة واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 22 ساعة.
  6. لإصلاح 2 ساعة C. glabrata مصابة ب THP-1 ، أضف 500 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد (محضر في PBS) إلى كل غرفة من الشريحة الأخرى واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  7. اغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام PBS ، وأضف 500 ميكرولتر Triton-X (0.7٪) ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام.
  8. اغسل الشريحة 3x باستخدام PBS ، وقم بإزالة الغرفة من شريحة الثقافة وجففها بالهواء لمدة 3-5 دقائق في الظلام.
  9. قم بتركيب غطاء بعناية باستخدام وسيط تركيب Vectashield الذي يحتوي على DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) على الشريحة لتجنب تكوين الفقاعات. قم بإزالة السائل الزائد برفق باستخدام Kimwipe وأغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر. قم بتخزين الشريحة في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  10. كرر الخطوتين 5.4 و 5.6-5.9 لمعالجة خلايا THP-1 بعد 24 ساعة من الإصابة.
  11. خلايا الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر (هدف غمر الزيت 60X ، الإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر لصبغة DAPI و GFP ، على التوالي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشفت تحليلات العدوى للخلايا البلعمية THP-1 المعالجة بـ PMA باستخدام خلايا C. glabrata من النوع البري (wt) أن الخلايا من النوع wt قد تم بلعمتها بواسطة الخلايا البلعمية بمعدل 55-65% بعد ساعتين من الحضانة المشتركة. علاوة على ذلك، تمكنت خلايا C. glabrata من مقاومة القتل بواسطة الخلايا البلعمية THP-1 وشهدت زيادة متوسطة بمقدار 5 إلى 7 أضعاف في وحدات تشكيل المستعمرات CFUs بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة مع الخلايا البلعمية THP-18.  كما تم التحقق من التكاثر داخل الخلوي للخلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب الجهاز المناعي الفطري دورا مهما في السيطرة على الالتهابات الفطرية الانتهازية. تساهم البلاعم في الدفاع المضاد للفطريات عن طريق ابتلاع وتدمير العامل الممرض الفطري. وبالتالي ، فإن توضيح العوامل المطلوبة للبقاء و / أو مواجهة الوظائف المضادة للميكروبات للبلاعم سيعزز فهمنا لاستراتيجيات الضراوة الفطرية. في هذا السياق ، أنشأنا نظاما نموذجيا لزراعة الخلايا في المختبر باستخدام الضامة المشتقة من خط خلية أحادية الخلية البشرية THP-1 لتوصيف تفاعل العامل الممرض الفطري الانتهازي البشري C. glabrata مع الخلايا البلع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المبتكر للتكنولوجيا الحيوية الشابة BT / BI / 12/040/2005 و BT / PR13289 / BRB / 10/745/2009 منحة من وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند والأموال الأساسية لمركز بصمات الحمض النووي وتشخيصه ، حيدر أباد. حصلت MNR و GB على زمالات بحثية للمبتدئين والكبار من مجلس البحث العلمي والصناعي من أجل الحصول على درجة الدكتوراه من جامعة مانيبال. SB حاصلة على زمالة بحثية للمبتدئين وكبار من قسم التكنولوجيا الحيوية من أجل السعي للحصول على درجة الدكتوراه من جامعة مانيبال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
THP-1مجموعة الثقافة من النوع الأمريكيTIB 202خط خلايا ابيضاض الدم أحادي الخلية البشرية الحاد
RPMI-1640HycloneSH30096.01للحفاظ على خلايا THP-1
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP 8139تحذير:
YPD & nbsp الخطير.BD-Difco242710لزراعة خلايا Candida glabrata< / em>
خلايا الفورمالديهايدسيجما-ألدريتشF8775لتثبيت C. glabrata< / em>-مصابة THP-1
الضامة محلول ملحي مخزن (PBS)عازلة (137 ملي كلوريد الصوديوم, 10 مللي فوسفات, 2.7 ملي مولار KCl,  درجة الحموضة 7.4) لغسل
سترات الصوديوم المالحة (SSC) عازلة (3 M كلوريد الصوديوم ، 0.3 م سترات الصوديوم بتركيز 20x) للغسيل مخزن
للتهجين المسبق(50٪ فورماميد ، 5x Denhardt' حل s ، 5x SSC ، 1٪ SDS) للتهجين
تركيب VECTASHIELDVector LabsH-1200لتركيب الشرائح للفحص المجهري متحد البؤر
32< / sup>P-labeled &alpha ؛ -dCTPJONAKI-BARCLCP-102لوضع العلامات الراديوية لعلامات التوقيع أطباق
زراعة الأنسجة 100 ممCorning430167لزراعة خلايا THP-1
لوحة زراعة الأنسجة 24 بئرCorning3527لإجراء دراسات العدوى C. glabrata< / em> في البلاعم THP-1
الشريحة الزجاجية المعالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 4 غرفBD FalconREF354104 لتصوير C. glabrata< / em>-مصابة بالبلاعم THP-1
ضغط الدمRohem الهندلتعداد الخلايا
الطرد المركزي الدقيق على الطاولةBeckman CoulterMicrofuge 18لتدوير الخلايا في الأنابيب الدقيقة
جهاز طرد مركزي أعلى الطاولةRemiR-8Cلتدوير الخلايا في أنابيب 15 مل مقياس
الطيفAmersham BiosciencesUltraspec 10لمراقبة امتصاص خلايا الخميرة
حاضنة الألواحLabtechمبردةلتنمو C. glabrata< / em> خلايا
شاكر حاضنةنيو برونزويكInnova 43لتنمو C. glabrata< / em> الخلايا
المكتملة بالماء CO2< / sub>  حاضنةThermo Electron CorporationForma series 2لزراعة خلايا THP-1
المجهر متحد البؤرCarl ZiessZiess LSM 510 metaلمراقبة C. glabrata< / em> مصابة بالبلاعم THP-1
مجهر مركبأوليمبوسCKX 41لمراقبة C. glabrata< / em> و THP-1 البلاعم
PCR آلةBioRadDNA Engineلتضخيم العلامات الفريدة من المدخلات والمخرجات فرن تهجين الحمض النووي الجيني
LabnetProblot 12Sللتهجين   ؛
PhosphorImagerFujifilmFLA-9000لمسح الأغشية المهجنة
ThermomixerEppendorfThermomixer Comfortلتمسخ علامات التوقيع ذات العلامات الراديوية
وحدة توثيق الجلAlphainnontechAlphaimagerلتصور الحمض النووي الملطخ ببروميد الإيثيديوم في المواد الهلامية الاغاروز
مؤقت وسيط مقياس الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
  2. Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
  3. Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
  4. Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
  5. Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
  6. Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
  7. Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
  8. Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).
  9. Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
  10. Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
  11. Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
  12. Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
  13. Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
  14. Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
  15. Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة