تحدد المقالة الحالية بروتوكولا لإنشاء نظام نموذج زراعة الخلايا في المختبر لدراسة تفاعل مسببات الأمراض الفطرية البشرية الاختيارية داخل الخلايا المبيضات glabrata مع البلاعم البشرية والتي ستكون أداة مفيدة لتعزيز معرفتنا بآليات الفراوعة الفطرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء نظام في المختبر لدراسة السلوك داخل الخلايا للمبيضات الجلابراتا في البلاعم THP-1 البشرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن يكون نظام نموذج زراعة الخلايا ، إذا كان يحاكي عن كثب الظروف البيئية للمضيف ، بمثابة بديل غير مكلف وقابل للتكرار وقابل للتلاعب بسهولة لأنظمة النماذج الحيوانية لدراسة خطوة محددة من عدوى مسببات الأمراض الميكروبية. تم استخدام خط الخلايا البشرية أحادي الخلية THP-1 الذي ، عند علاج إستر فوربول ، إلى ضامة ، لدراسة استراتيجيات الفوعة للعديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا بما في ذلك المتفطرة السلية. هنا ، نناقش بروتوكولا لسن نظام نموذج زراعة الخلايا في المختبر باستخدام البلاعم THP-1 لتحديد تفاعل مسببات الخميرة البشرية الانتهازية المبيضات glabrata مع الخلايا البلعمية المضيفة. هذا النظام النموذجي بسيط وسريع وقابل للشاشات الطافرة عالية الإنتاجية ، ولا يتطلب أي معدات متطورة. تستغرق تجربة عدوى البلاعم THP-1 النموذجية حوالي 24 ساعة مع 24-48 ساعة إضافية للسماح للخميرة داخل الخلايا المستردة بالنمو على وسط غني لتحليل الجدوى القائم على وحدة تشكيل المستعمرة. مثل أنظمة النماذج المختبرية الأخرى ، فإن القيد المحتمل لهذا النهج هو صعوبة استقراء النتائج التي تم الحصول عليها على دائرة خلية مناعية معقدة للغاية موجودة في المضيف البشري. ومع ذلك ، على الرغم من ذلك ، فإن البروتوكول الحالي مفيد جدا لتوضيح الاستراتيجيات التي قد يستخدمها العامل الممرض الفطري للتهرب من / مواجهة الاستجابة المضادة للميكروبات والبقاء على قيد الحياة والتكيف والتكاثر في البيئة الفقيرة بالمغذيات للخلايا المناعية المضيفة.
المقدمة
< p class = "jove_content" > أنواع المبيضات هي السبب الرئيسي للالتهابات الفطرية الغازية التي تهدد الحياة لدى المرضى الذين يعانون من نقص المناعة1. المبيضات glabrata ، وهي مسببات الأمراض الناشئة في المستشفيات ، هي ثاني أو ثالث أنواع المبيضات الأكثر عزلة من مرضى وحدة العناية المركزة اعتمادا على الموقع الجغرافي1-3. من الناحية التطورية ، C. glabrata ، وهي خميرة ناعمة أحادية الصيغة الصبغية ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالخميرة النموذجية غير المسببة للأمراض خميرة الخميرة من المبيضات المسببة للأمراض spp. بما في ذلك C. albicans4. تمشيا مع هذا ، C. glabrata يفتقر إلى بعض سمات الفوعة الفطرية الرئيسية بما في ذلك التزاوج والن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يوصى بإجراء تجارب عدوى C. glabrata في مختبر بمستوى احتواء السلامة الحيوية 2 (BSL-2).
- تحضير طبقة أحادية البلاعم THP-1.
- تحضير C. glabrata تعليق الخلية.
- إصابة الضامة THP-1 بخلايا C. glabrata.
- قياس معدل البلعمة والتكاثر داخل الخلايا عن طريق مقايسة وحدة تشكيل المستعمرة.
- مراقبة النسخ المتماثل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر.
1. تحضير طبقة أحادية البلاعم THP-1
- THP-1 هو خط خلية بشرية أحادية الخلية مشتق من الدم المحيطي لطفل ذكر يبلغ من العمر عاما واحدا يعاني من سرطان الدم وحيد الخلية الحاد14. يتم الحف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كشفت تحليلات العدوى للخلايا البلعمية THP-1 المعالجة بـ PMA مع خلايا C. glabrata من النوع البري (wt) أن الخلايا من النوع wt قد تم بلعمتها بواسطة الخلايا البلعمية بمعدل 55-65% بعد ساعتين من الحضن المشترك. علاوة على ذلك، تمكنت خلايا C. glabrata من مقاومة القتل بواسطة الخلايا البلعمية THP-1 وشهدت زيادة متوسطة بمقدار 5 إلى 7 أضعاف في وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة مع الخلايا البلعمية THP-18. كما تم التحقق من التضاعف داخل الخلوي للخلايا من النوع البر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يلعب الجهاز المناعي الفطري دورا مهما في السيطرة على الالتهابات الفطرية الانتهازية. تساهم البلاعم في الدفاع المضاد للفطريات عن طريق ابتلاع وتدمير العامل الممرض الفطري. وبالتالي ، فإن توضيح العوامل المطلوبة للبقاء و / أو مواجهة الوظائف المضادة للميكروبات للبلاعم سيعزز فهمنا لاستراتيجيات الضراوة الفطرية. في هذا السياق ، أنشأنا نظاما نموذجيا لزراعة الخلايا في المختبر باستخدام الضامة المشتقة من خط خلية أحادية الخلية البشرية THP-1 لتوصيف تفاعل العامل الممرض الفطري الانتهازي البشري C. glabrata مع الخلايا البلع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المبتكر للتكنولوجيا الحيوية الشابة BT / BI / 12/040/2005 و BT / PR13289 / BRB / 10/745/2009 منحة من وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند والأموال الأساسية لمركز بصمات الحمض النووي وتشخيصه ، حيدر أباد. حصلت MNR و GB على زمالات بحثية للمبتدئين والكبار من مجلس البحث العلمي والصناعي من أجل الحصول على درجة الدكتوراه من جامعة مانيبال. SB حاصلة على زمالة بحثية للمبتدئين وكبار من قسم التكنولوجيا الحيوية من أجل السعي للحصول على درجة الدكتوراه من جامعة مانيبال.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| THP-1 | مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي | TIB 202 | خط خلايا ابيضاض الدم أحادي الخلية البشرية الحاد |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | للحفاظ على خلايا THP-1 |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | تحذير: |
| YPD & nbsp الخطير. | BD-Difco | 242710 | لزراعة خلايا Candida glabrata< / em> |
| خلايا الفورمالديهايد | سيجما-ألدريتش | F8775 | لتثبيت C. glabrata< / em>-مصابة THP-1 |
| الضامة محلول ملحي مخزن (PBS) | عازلة (137 ملي كلوريد الصوديوم, 10 مللي فوسفات, 2.7 ملي مولار KCl, درجة الحموضة 7.4) لغسل | ||
| سترات الصوديوم المالحة (SSC) | عازلة (3 M كلوريد الصوديوم ، 0.3 م سترات الصوديوم بتركيز 20x) للغسيل مخزن | ||
| للتهجين المسبق | (50٪ فورماميد ، 5x Denhardt' حل s ، 5x SSC ، 1٪ SDS) للتهجين | ||
| تركيب VECTASHIELD | Vector Labs | H-1200 | لتركيب الشرائح للفحص المجهري متحد البؤر |
| 32< / sup>P-labeled &alpha ؛ -dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | لوضع العلامات الراديوية لعلامات التوقيع أطباق |
| زراعة الأنسجة 100 مم | Corning | 430167 | لزراعة خلايا THP-1 |
| لوحة زراعة الأنسجة 24 بئر | Corning | 3527 | لإجراء دراسات العدوى C. glabrata< / em> في البلاعم THP-1 |
| الشريحة الزجاجية المعالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 4 غرف | BD Falcon | REF354104 لتصوير C. glabrata< / em>-مصابة بالبلاعم THP-1 | |
| ضغط الدم | Rohem الهند | لتعداد الخلايا | |
| الطرد المركزي الدقيق على الطاولة | Beckman Coulter | Microfuge 18 | لتدوير الخلايا في الأنابيب الدقيقة |
| جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة | Remi | R-8C | لتدوير الخلايا في أنابيب 15 مل مقياس |
| الطيف | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | لمراقبة امتصاص خلايا الخميرة |
| حاضنة الألواح | Labtech | مبردة | لتنمو C. glabrata< / em> خلايا |
| شاكر حاضنة | نيو برونزويك | Innova 43 | لتنمو C. glabrata< / em> الخلايا |
| المكتملة بالماء CO2< / sub> حاضنة | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | لزراعة خلايا THP-1 |
| المجهر متحد البؤر | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | لمراقبة C. glabrata< / em> مصابة بالبلاعم THP-1 |
| مجهر مركب | أوليمبوس | CKX 41 | لمراقبة C. glabrata< / em> و THP-1 البلاعم |
| PCR آلة | BioRad | DNA Engine | لتضخيم العلامات الفريدة من المدخلات والمخرجات فرن تهجين الحمض النووي الجيني |
| Labnet | Problot 12S | للتهجين ؛ | |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | لمسح الأغشية المهجنة |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | لتمسخ علامات التوقيع ذات العلامات الراديوية |
| وحدة توثيق الجل | Alphainnontech | Alphaimager | لتصور الحمض النووي الملطخ ببروميد الإيثيديوم في المواد الهلامية الاغاروز |
المراجع
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance stu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
