بمساعدة مصفوفة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) قداس التحليل الطيفي من البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون

ملخص

يمثل قياس كتلة دقيقة خطوة هامة أثناء التحقيق في البروتينات. بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) مطياف الكتلة (MS) يمكن استخدامها لمثل هذا القرار والميزة الرئيسية له هو التسامح إلى الأملاح والمنظفات والملوثات. نحن هنا توضيح نهج الوصول إليها لتحليل البروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI-MS.

الملخص

تحديد فعالية الجماهير من البروتينات أمر بالغ الأهمية لكثير من الدراسات البيولوجية (مثلا للتحقيقات البيولوجيا البنيوية). تقرير شامل دقيق يسمح احد لتقييم صحة تسلسل الأولية البروتين، وجود الطفرات و / أو التعديلات بعد متعدية، وتدهور ممكن البروتين، والتجانس العينة، ودرجة النظائر التأسيس في حالة وضع العلامات (مثل وضع العلامات ¹³ C ).

يستخدم Electrospray تأين (ESI) مطياف الكتلة (MS) على نطاق واسع لتحديد كتلة من البروتينات التشويه والتحريف، ولكن يتأثر كفاءتها من خلال تكوين عينة العازلة. على وجه الخصوص، وجود الأملاح والمنظفات، والملوثات يقوض بشدة فعالية تحليل البروتين بواسطة ESI-MS. بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) MS هو بديلا جذابا، وذلك بسبب التسامح الملح وبساطة الحصول على البيانات وتفسيرانشوئها. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد كتلة غير متجانسة من البروتينات الكبيرة (أكبر من 100 كيلو دالتون) هو أسهل عن طريق MALDI-MS نظرا لعدم وجود تداخل التوزيعات ولاية تهمة عالية والتي هي موجودة في ESI الأطياف.

هنا نقدم هذا النهج للوصول لتحليل البروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI وقت الرحلة (TOF). نحن لتوضيح مزايا استخدام مزيج من اثنين من المصفوفات (حمض أي 2،5-dihydroxybenzoic وحمض α-سيانو-4-hydroxycinnamic) والأداة المساعدة للأسلوب طبقة رقيقة مع اقتراب لترسب العينة. نحن أيضا مناقشة الدور الحاسم للمصفوفة والنقاء المذيبات، المعايير المستخدمة في المعايرة، من طاقة الليزر، وللاكتساب الوقت. عموما، ونحن نقدم المعلومات اللازمة لمبتدئ لتحليل البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI-MS.

المقدمة

يعتمد علم الأحياء الهيكلي على إنتاج البروتينات عالية الجودة ⁽¹⁾ وبالتالي يحتاج إلى أن يقترن مع تقنيات فعالة وموثوقة لتحليل البروتين ^2،3. لدينا في مطياف الكتلة (MS) داخل مختبر معهد البيولوجيا البنيوية نحن بحاجة لتأكيد تسلسل الأولية للبروتينات، وتقييم وجود الطفرات وتعديلات ما بعد النقل، وتدهور البروتينات، والتجانس العينة، ونوعية وضع العلامات النظائر (على سبيل المثال بالديوتيريوم البروتينات للدراسات الرنين المغناطيسي النووي ^4). منذ الأحياء الهيكلية استخدام التحلل البروتيني محدودة للتمييز المجالات جامدة هيكليا من أجزاء مرنة، ونحن بحاجة لتوصيف موثوق مثل البروتينات اقتطاع باستخدام MS.

عندما يتم تحليل الجزيئات الحيوية عن طريق MS، وتستخدم نهجين الممكن ionise بهدوء مثل هذه الجزيئات الثقيلة وعطوب. تأين Electrospray (ESI) ionises جزيئات مباشرة منيتطلب بمساعدة مصفوفة الامتزاز الليزر تأين (MALDI) أن الجزيئات الحيوية وشارك تبلورت مع الجزيئات العضوية التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية (أي مصفوفة الجزيئات) ^6؛ الطور السائل ^5.

إلى جانب ESI الوقت من الطيران (TOF) MS إلى اللوني السائل أصبحت تقنية روتينية لتحليل البروتينات سليمة، لأنه يسمح التصميم الشامل مع دقة عالية (≤ 50 جزء في المليون). ومع ذلك، فإنه هو عرضة للغاية لتكوين عينة العازلة (وخاصة للأملاح والمنظفات الصناعية) والملوثات (أي بوليمرات) والتي تكون في بعض الأحيان صعبة للقضاء، مما تسبب في قمع إشارة الحليلة.

MALDI-TOF MS يمثل بديلا فعالا للESI-MS بسبب أدائها هو أقل تأثرا مكونات العازلة، المنظفات والملوثات، ويسمح البروتين سليمة تقرير الشامل مع دقة كافية (≤ 500 جزء في المليون) للتحقق من صحة التسلسل. بعد البروتيناتن الهضم، ويمكن استخدامها MALDI-TOF MS أيضا لتحليل الببتيدات التي تم الحصول عليها لمزيد من التأكيد تسلسل الأولية من قبل ما يسمى ب "الببتيد البصمات الشامل".

في أيدينا، وتحديد كتلة من البروتينات سليمة، والتي هي أكبر من 100 كيلو دالتون وغير المتجانسة (بسبب التعديلات أو truncations)، هو أسهل من خلال MALDI-MS من قبل ESI-MS. ويرجع ذلك إلى عدم وجود تداخل التوزيعات ولاية تهمة موجودة في ESI أطياف هذا. علاوة على ذلك، منذ عملية MALDI لا تعتمد على حجم الحليلة ^7، مثل عوائد طريقة حساسية عالية عندما كتلة جزيء حيوي هو فوق 100 كيلو دالتون. أجريت تحليلات رائعة من البروتينات سليمة من استخدام الأدوات المصنوعة محليا بين نهاية عام 1980 وبداية عام 1990 في ^8-11.

MALDI-TOF يمكن استخدامها أيضا كأداة فحص لتقييم جودة عينات البروتين لأنه يتطلب وقتا أقل لإعداد العينات وأقل عرضة للinterferenالمجال الاقتصادي الموحد بسبب الشوائب المشتركة (مثل أملاح). بعد الأولى، والتقييم السريع من قبل MALDI-MS، عينة يمكن تحليلها بواسطة ESI-TOF لتحديد كتلته مع دقة أعلى. علاوة على ذلك، MALDI بتوليد أيونات تحتوي على رسوم أقل من ESI، وبالتالي اكتساب وتفسير البيانات MALDI هو أكثر وضوحا. هذا يتيح للطلاب العمل في علم الأحياء الهيكلي لتحليل البروتينات المؤتلف بهم فقط بعد تدريبي قصير الامد.

نوعان من العوامل الرئيسية التأثير على نوعية أطياف MALDI: المصفوفة والتقنية المستخدمة لترسب مصفوفة (الحبرية مثل المجففة ⁸ و طبقة رقيقة ^{12-16،17،18).} مصفوفة العضوية احدة [مثل حمض sinapinic (SA) ^19-21 أو α-سيانو-4-hydroxycinnamic حمض (α-CHCA) ^14،22،23] وغالبا ما يستخدم لفحص MS البروتينات سليمة والمجمعات البروتين عبر ربط . باستخدام α-CHCA، قدم مجموعة Chait سابقا بروتوكول مفصلة لعيصلح طبقة رقيقة جدا قبل تحليل MALDI من البروتينات القابلة للذوبان وغشاء ^14،15. في الآونة الأخيرة، جوركا آخرون يتضح طلاء الهدف القائم على الجرافيت لتحسين تحليل MALDI من الببتيدات والبروتينات باستخدام α-CHCA مثل المصفوفة ^24.

هنا، نقدم بروتوكول بسيط لتحليل البروتينات سليمة من قبل MALDI-TOF MS، وذلك باستخدام مزيج من اثنين من المصفوفات: حمض 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) وα-CHCA ^25. قمنا بتقييم منهجي لأداء مزيج DHB-CHCA مقارنة SA-α وCHCA المصفوفات، من أجل السيطرة على البروتينات سليمة. خليط مصفوفة يسمح قرار أفضل (أي قمم البروتين هي أكثر وضوحا من ذلك بكثير). وعلاوة على ذلك، فإن وجود مكثفة تهم متعددة الأيونات (أي M ⁺² H ^{2 +،} M +3 H ^{3 +،} الخ) تمكن تقرير الشامل أكثر دقة لأن القرار من الصكوك المحوري MALDI-TOF أعلى في انخفاض الشامل أكثر من تهمة (م / ض) ^26. هذا مفيد بشكل خاص لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون.

يتم التوصل إلى حساسية أعلى أيضا باستخدام خليط DHB-CHCA (0.5 pmoles من البروتين رصدت على الهدف MALDI).

كما ذكرنا أعلاه، أحد العوامل الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند استخدام أداة MALDI هو ترسب مصفوفة. وجسن وآخرون. اقترح استخدام DHB-CHCA الخليط لأول مرة ^25، وذلك باستخدام ترسب قطرات المجففة. ومع ذلك، لاحظنا نتائج أفضل (مثل حساسية أعلى من ذلك بكثير) عندما كنا تستخدم أسلوب طبقة رقيقة حيث يتم تشكيل الطبقة الأولى من α-CHCA المذاب في الأسيتون. طبقة رقيقة الأسلوب ^12،27 يعني تشكيل قوام متجانس من بلورات المصفوفة على الهدف MALDI، التي وصفت في شريط فيديو إن الرب سابقا ^15. ثم، وتودع العينة على هذه التحتية، وأخيراوتودع مصفوفة إضافية (انظر أدناه). في هذه المقالة، ونحن أيضا توضيح كيفية إيداع العينة على الهدف MALDI، ولكن أيضا كيفية تنظيف الهدف ^15، لأعد بلورة وإعداد مصفوفات.

لإبرام نحن نهدف إلى توفير جميع المعلومات اللازمة لتحليل البروتينات سليمة للعلماء (على وجه الخصوص، وعلماء الأحياء الهيكلية) الذين يحتاجون إلى تقييم نوعية البروتينات التي تنتج في وسيلة سريعة وبسيطة والذين ليسوا على دراية بذلك مع MALDI-TOF MS. كما تنبأ في منتصف 1990s ^28، زارها MS تأثير زيادة على البحوث البيولوجية، وإمكانية الحصول عليها لعلماء البيولوجيا قد ازداد. نأمل أن المعلومات التي قدمت وسوف يكون من المفيد لجعل MALDI-TOF في متناول علماء البيولوجيا وعلماء الذين يرغبون في بدء استخدام مطياف الكتلة.

البروتوكول

1. إعداد البروتين العينة: العازلة صرف (اختياري)

5-25 ميكرولتر من تركيزات مكرومولي من البروتين (1-20 ميكرون) ضرورية. يمكن أن يتم تبادل عازلة خارج باستخدام أجهزة الطرد المركزي الفائق (مثل Vivaspin، سارتوريوس) أو الأعمدة ميكروسنتريفوج هلام الترشيح (على سبيل المثال، مايكرو بيو سبين 6 أعمدة اللوني، بيو راد) ^29،30. خطوات تبادل العازلة يمكن تكرار 2-3X. وقدم وصفا تفصيليا الصرف العازلة سابقا ^29،30. على سبيل المثال، نحن نستخدم 20 ملي تريس (هيدروكسي) aminomethane (أي تريس) الرقم الهيدروجيني 8 كما عازلة النهائي.

ملاحظة: يمكن حذف هذه الخطوة في العديد من الحالات. ينبغي القيام بها عندما يحتوي عينة البروتين جزيئات أو المخازن المؤقتة التي يمكن أن تتداخل بقوة مع MS كشف [مثل الجلسرين، 4 - (2-هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic حمض، HEPES]. كما أنها مفيدة لتحسين تشوعلى ality من الأطياف.

2. التبلور من مصفوفات من أجل تحسين تلك الطهارة (اختياري)

1. صب 10 مل من 40٪ من الإيثانول (ETOH) في قارورة بيركس.
2. إضافة 600 ملغ من مصفوفة.
3. باستخدام حمام مائي وسخان المقاومة، تدفئة حل المصفوفة ويحرك حتى يذوب تماما المصفوفة باستخدام قضيب الزجاج أو النمام المغناطيسي.
4. كرر الخطوة 2 حتى يكون لديك محلول مشبع.

ملاحظة: استخدام كمية كبيرة جدا من المذيبات أو تذويب سوف المصفوفة أقل بكثير من درجة غليان المحلول يسبب الغلة الفقراء من بلورات بلورات أو لا على الإطلاق.

5. يسمح الحل لتبرد ببطء. يمكنك ترك في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات ومن ثم في 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة: إذا لم تتشكل البلورات، وتبلور يمكن الناجم عن الخدش داخل الدورق (فقط تحت سطح الحل) باستخدام قضيب الزجاج التحريك.
6. جمع بلورات المصفوفة عن طريق الترشيح.
7. شطف بلورات مع الحد الأدنى من المذيبات الجليد الباردة والترشيح لها.
8. تسمح للبلورات لتجف. يمكنك استخدام فراغ لهذه الخطوة.

3. تنظيف الفولاذ المقاوم للصدأ الهدف MALDI

1. شطف لوحة MALDI مع الميثانول (MeOH) ويمسح برفق بمنديل التنظيف صنعت خصيصا لتطبيقات المختبر (مثل Kimwipe).
2. شطف الهدف مع H ₂ O وامسحه بمنديل التنظيف.
3. إدراج لوحة MALDI في كوب 600 مل وتغطية ذلك مع 50٪ ETOH.
4. يصوتن الهدف في حل ETOH لمدة 10 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية.
5. إذا كان هناك بقايا المتبقية على لوحة، وكرر الخطوات 1-4 مرة أخرى.
6. أخيرا، شطف الهدف مع MeOH (أو مع الماء، انظر الملاحظة أدناه)، والميل هو في الطريقة التي يتم جمع كل السائل على الأنسجة التنظيف. السماح للهدف الجافة في درجة حرارة الغرفة أو استخدام النيتروجينتدفق الغاز.

ملاحظة: تم وصف إجراء مماثل سابقا ^15.

ملاحظة: المذيب (MeOH أو الماء) المستخدمة في الشطف الأخير من الهدف يحدد بعض الميزات الهدف. إذا تم تشطف الهدف مع MeOH، ينتشر العينة على الهدف أكثر بكثير من عند استخدام المياه.

4. α-CHCA رقيقة طبقة الحل: إعداد وترسب على MALDI الهدف

1. حل α-CHCA في الأسيتون من أجل جعل محلول مشبع.
2. من جهة (دون أي ماصة) تراجع 10 ميكرولتر طرف (مثل GELoader تلميح، إيبندورف) في α-CHCA محلول مشبع: سوف كمية صغيرة من الحل تتدفق في الطرف (بسبب الشعرية).
3. تلمس بسرعة كبيرة (أي 1 ثانية) الهدف MALDI مع طرف ماصة وإيداع الحل الأسيتون α-CHCA على الهدف MALDI. وهذا يشكل طبقة رقيقة مصفوفة، حيث البروتينوسوف تودع العينة. محاولة إنشاء طبقة رقيقة بقعة صغيرة قدر الإمكان.

ملاحظة: عند استخدام SA مثل المصفوفة، ونحن نستعد طبقة رقيقة باستخدام محلول مشبع من SA في الأسيتون.

5. إعداد Natrix الحلول: SA، α-CHCA، DHB وCHCA_DHB خليط ²⁵

1. يعد حل 20 ملغ / مل SA في ACN، 0.1٪ TFA (70:30، المجلد / المجلد).
2. إعداد 20 ملغ / مل α-CHCA الحل في ACN وحمض الفورميك 5٪ (70:30، المجلد / المجلد) [يدعى "حل α-CHCA"].
3. إعداد 20 ملغ / مل حل DHB في ACN وحمض 0.1٪ trifluoroacetic (TFA) (70:30، المجلد / المجلد) [يدعى "حل DHB"].
4. مزيج "حل α-CHCA" و "حل DHB" في نسبة 1:1 (المجلد / المجلد)، للحصول على "حل CHCA_DHB".

ملاحظة: يمكن للمرء أن خلط "α-CHCA الحل" و "حل DHB" في نسب مختلفة، عند تحليل البروتينات مع كتلة أقل من 100 كيلو دالتون. لإكساءmple نسبة 40:60 بين α-CHCA وDHB (المجلد / المجلد) تعطي أفضل قرار، ولكن أقل حساسية (انظر المناقشة).

6. ترسب العينة على الهدف MALDI

1. إيداع 0.5 ميكرولتر من العينة البروتين على α-CHCA طبقة رقيقة معدة مسبقا. مباشرة بعد ذلك، إضافة 0.5 ميكرولتر من الحل المصفوفة (أي SA حل أو الحل α-CHCA أو "مزيج CHCA_DHB"). هذا يعني خلط العينة والمصفوفة على الهدف.

ملاحظة: عادة واحدة تختلط العينة البروتين مع المصفوفة في نسبة 1:1. هذه النسبة هو أمر حاسم لنوعية جيدة من أطياف MALDI. إذا كنت ترغب في اختبار عينة تركيزات مختلفة، يمكنك استخدام محلول حمض ACN_formic (المذكورة أعلاه) لتخفيف العينة.

ملاحظة: إذا كنت تفضل، يمكنك مزج العينة ومصفوفة في أنبوب ثم إيداع المختلطة "sample_matrix المحاليلنشوئها "على طبقة رقيقة.

ملاحظة: نقترح عليك لاختبار عينة تركيزات مختلفة لتمييع العينة يسمح لك للحد من التدخل من الملوثات. لتخفيف العينة، يمكنك استخدام محلول حمض ACN_formic (المذكورة أعلاه) لتخفيف العينة.

7. Calibrant ترسب

1. إيداع 0.5 ميكرولتر من معيار calibrant (على سبيل المثال "البروتين القياسية II"، بروكر Daltonics، بريمن) ثم إضافة 0.5 ميكرولتر من الحل المصفوفة.

ملاحظة: قم بتحميل calibrant على لوحة MALDI بجانب عينة البقع البروتين (انظر المناقشة).

8. MALDI أطياف اقتناء Calibrant وعينات البروتين

مرة واحدة يتم تجفيفها العينات وcalibrant، يمكنك مراقبة "النقاط" تحت المجهر. هذه الملاحظة هو اختياري ويمكن أن تكون مثيرة للاهتمام أساسا إلى المبتدئين. للحصول على عينة الأطياف، إدراج الهدف ه في الصك MALDI-TOF واختيار المعلمات دور فعال المناسبة التي هي مختلفة لكل نوع من المعدات. للحصول على أنسب مجموعة المتابعة ينبغي للمرء أن اتباع توصيات الشركة المصنعة. كما الاعتبارات العامة عند تحليل البروتينات سليمة، ينبغي للمرء أن استخدام الصك في وضع خطي (وليس في وضع العاكس، الذي هو مناسبة لالببتيدات يحلل). عادة نستخدم أداة لدينا في وضع إيجابي أيون. علاوة على ذلك، معلمة المفتاح هو "استخراج أيون نابض" مما يحسن من القرار ³¹ دورا. بعبارات بسيطة، فإن "أيون استخراج نابض" يمكن تعريفها بأنها وقفة بين جيل من العينة الأيونات والوقت الذي تسارع الأيونات نحو كاشف. عند تحليل البروتينات سليمة، ينبغي للمرء أن تستغل "استخراج أيون نابض" (على سبيل المثال 500 NSEC) أكبر من عند مراقبة الببتيدات (على سبيل المثال 80 NSEC).

اختيار مجموعة م / ض المناسبة، والحصول على أطياف سو في calibrant، ومعايرة أجهزة القياس. عند الحصول على أطياف العينات الخاصة بك، استخدم كثافة الليزر المناسب (انظر المناقشة).

النتائج

قمنا بتحليل البروتين سليمة (صيانة المنطقة كروموسوم 1 البروتين، Crm1؛ الوزن الجزيئي: 123386 دا) باستخدام اثنين من المصفوفات مختلفة، طريقتين الترسيب، ونفس كثافة الليزر (الشكل 1). واستخدمت SA وخليط CHCA_DHB كما المصفوفات. خليط أسفرت أطياف الشامل من أعلى جودة من حيث إشارة إلى نسبة الضوضاء والحساسية (أرقام 1A وباء). على وجه الخصوص، فإننا لا يمكن الكشف عن 0.5 pmoles من البروتين المودعة على الهدف MALDI (الشكل 1C). وكان نفس كمية البروتين بالكاد يمكن كشفها باستخدام SA (1D الشكل). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام خليط المصفوفات، كان الأسلوب المفضل لترسب مصفوفة نهج "طبقة رقيقة" (الشكل 1A). باستخدام طريقة "المجفف الحبرية"، ونحن لم يكشف أي بروتين مع كتلة أعلى من 100 كيلو دالتون (لا تظهر البيانات). الاستفادة من خليط CHCA_DHB (أرقام 1A و 1C)، اتهم تتكاثر أيون من البروتيناتن لوحظت، مما يتيح للتقرير الشامل مع أعلى قدر من الدقة لأن القرار ذروة في الصكوك MALDI-TOF محوري يتناسب عكسيا مع م / ض ^26.

نحن أيضا تحليل أحادى بيتا غالاكتوزيداز (116300 دا) (الشكل 2). وكانت الأطياف CHCA_DHB أفضل من SA أطياف من حيث الحساسية والدقة. وعلاوة على ذلك، فإن وجود أيونات مشحونة ضرب (م ^{2 +، 3 +} M و M ^{4 +)} سمح لنا لتأكيد كتلة البروتين مع دقة أعلى (أرقام 2A و 2C). باستخدام نهج طبقة رقيقة، قارنا أداء الخليط CHCA_DHB، SA-α وCHCA وحدها لتحليل والمناعي، مفتش (148500 دا) (الشكل 3). عندما كنا ربط بيانات مختلفة، وكانت إشارات البروتين العالي ومع أفضل قرار في أطياف CHCA_DHB. وختاما، فإن استخدام الخليط CHCA_DHB ورقيقة طريقة ترسيب طبقة أظهرت تحسنا كبيرا في نوعية كبيرة سليمة أطياف البروتين الشامل المكتسبة باستخدام أداة MALDI TOF.

الشكل 1. تحليل MALDI-TOF المنطقة كروموسوم سليمة الصيانة 1 البروتين، (Crm1)، الوزن الجزيئي: 123386 دا. تم تحليل A) 1 pmole من Crm1 باستخدام مزيج DHB_CHCA مثل المصفوفة B) كمية: 1 pmole؛ مصفوفة: SA C) كمية: 0.5 pmole؛ مصفوفة: DHB_CHCA D) كمية: 0.5 pmole؛ مصفوفة: SA. إشارة من القمم، وأعرب في نطاق وحدة كثافة التعسفي، هو تطبيع إلى أقصى قيمة الحاضر في كل الطيف.

خريج "سرك =" / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg "/>
الشكل 2. تحليل MALDI-TOF من سليمة بيتا غالاكتوزيداز (116300 دا). أ) كمية: 20 pmoles؛ مصفوفة DHB_CHCA B) كمية: 20 pmoles؛ مصفوفة: SA C) كمية: 5 pmoles؛ مصفوفة: DHB_CHCA D) كمية: 5 pmoles؛ مصفوفة: SA.

الرقم 3. تحليل MALDI-TOF من الغلوبولين المناعي سليمة، مفتش (148،500 دا)؛ المبلغ: كانت 1.7 pmoles الأطياف التي تم الحصول عليها باستخدام خليط CHCA_DHB أكثر كثافة بكثير (الحد الأقصى: 8200 وحدة تعسفية، والاتحاد الافريقي) من أطياف SA (الحد الأقصى: 1،200 [أو]) وα-CHCA الأطياف (الحد الأقصى: 4500 الاتحاد الافريقي)

المناقشة

قدمنا ​​بروتوكول التفاصيل للحصول على جودة عالية الأطياف كتلة من البروتينات سليمة كبيرة مع الأوزان الجزيئية أكبر من 100 كيلو دالتون، وذلك باستخدام أداة MALDI-TOF. وينبغي النظر في عدد من الجوانب الهامة المتعلقة بإعداد العينة بعناية من أجل تحسين نوعية الأطياف الشامل. المصفوفات والمذيبات عالية النقاء ذات أهمية حاسمة لأن تتركز كل الملوثات الموجودة في مصفوفات والمذيبات على الهدف MALDI بعد تبخر المذيبات. من أجل تعزيز نقاء المصفوفات MALDI فمن الممكن لتنقية لهم باستخدام الأساليب الكلاسيكية التبلور (انظر أعلاه). نوصي أيضا إلى إعداد طازجة الحلول المصفوفات (على الأقل مرة واحدة في الأسبوع) لتحسين بلورة المصفوفة وتجنب تدهور المصفوفة.

النهج ترسب مصفوفة حرجة للغاية لنوعية النهائي للأطياف. كما هو موضح أعلاه، وطريقة طبقة رقيقة هو أسلوبنا سو خيار ^12. وعلاوة على ذلك، ونحن الأمثل النهج لإيداع الطبقة الأولى. عندما يذوب في الأسيتون المصفوفة للحصول على محلول مشبع، وبروبانون يسمح التبخر السريع للالمذيب، ولكن أيضا يجعل حجم الطبقة الأولى من الصعب جدا السيطرة عليها. نقترح استخدام تلميح GELoader كما فرشاة القليل الذي تراجع في حل matrix_acetone للحصول على الحد الأدنى من حجم الذي تقوم بإيداع بسرعة على الهدف. حجم الطبقة الأولى تسيطر على نحو ما الحجم النهائي للبقعة MALDI: بقعة صغيرة (أي 0،5-،75 ملم من قطر) هو الأفضل لأنه في هذه الحالة تركيز العينة هو أعلى منه في حالة وجود بقعة كبيرة. الحصول على بقعة صغيرة يختلف عن النهج طبقة رقيقة جدا المقترحة سابقا في شريط فيديو JOVE ^15. في Fenyo وآخرون. ينتشر الحل طبقة رقيقة في جميع أنحاء الهدف MALDI باستخدام الجانب من طرف ماصة. يتطلب هذا النهج اختبار طبقة رقيقة التي ينبغي أن تلبي معايير محددة(على سبيل المثال سرعة تبخر المذيبات). إذا لم يتم استيفاء المعيار، يجب غسلها الهدف MALDI وينبغي إعداد طبقة رقيقة جديدة. وهذا يجعل إعداد شاقة جدا بالنسبة لمبتدئ. وعلاوة على ذلك، فإن ترسب خليط عينة / مصفوفة على لوحة يتطلب تطلع المذيبات الزائد باستخدام خط فراغ وخطوة الغسيل باستخدام TFA ¹⁵ هو ضروري، مما يجعل Fenyo وآخرون. إعداد قليلا أكثر صعوبة من نهجنا.

نسبة حجم المصفوفة وبين عينة من المهم جدا بالنسبة لتحليل ناجحة من البروتينات سليمة من قبل MALDI-TOF. بعد اختبار نسب مختلفة نقترح استخدام نسبة 1:1. مصفوفة مختلفة: عينة نسبة يمكن أن تؤثر سلبا على جودة الأطياف، وربما يرجع ذلك إلى تبلور غير متجانسة. الترتيب الذي يتم إيداع مصفوفة وعينة أمر بالغ الأهمية أيضا. بعد إيداع طبقة رقيقة مصفوفة، وتودع العينة ومباشرة بعد (قبل عصيدةلو يصبح بقعة جافة) يضاف خليط CHCA_DHB. وقد تم تعريف هذا الإجراء بأنه "طريقة ساندويتش" ^27، حيث يتم إيداع عينة وحده بين طبقتين المصفوفة. كبديل، والحل CHCA_DHB والعينة يمكن أن تكون مختلطة في أنبوب 0.5 مل ثم رصدت على طبقة رقيقة CHCA ^12. هذا ينتج بقعة مع طبقة متجانسة من البلورات الناتجة في ذات جودة عالية الأطياف. عند تحليل البروتينات مع انخفاض كتلة من 100 كيلو دالتون، وتركيز DHB يمكن زيادة (على سبيل المثال 60:40 DHB: CHCA)، وهذا يمكن أن تنتج أكثر وضوحا الذروة، ولكن يمكن أن تؤثر سلبا على حساسية قياس (أي قمم أقل كثافة).

لمعايرة الأدوات الصحيحة، فمن الضروري أن تودع المعايير calibrant قريبة جدا من بقع عينة، مما يسمح احد للحصول على دقة أفضل الشامل. A "الزائفة الداخلية إجراء المعايرة" واقترح سابقا ^15: بعد الحصول على عينة الطيف، بقعة ط calibrantتضاف ق الليزر اطلاق النار وإشارة من calibrant إلى الطيف العينة. هذا يسمح لك لمعايرة داخليا الطيف العينة باستخدام القمم calibrant.

وينبغي أيضا التحكم في طاقة الليزر بعناية خلال اقتناء الأطياف. في معظم الحالات، والطاقة العالي يزيد من حساسية، ولكن يقلل من القرار. نقترح استخدام الحد الأدنى الممكن طاقة الليزر دون المساس حساسية الاستحواذ. وعلاوة على ذلك، من أجل تحسين جودة الطيفية، يمكن للمرء الحصول على مزيد من الطلقات على كل بقعة العينة. عادة مزيد من الطلقات تحصل عليه (1،000-2،000 طلقة)، وارتفاع كثافة الإشارة. عندما تصل إلى بقعة مع الليزر، ويحتاج المرء إلى العثور على المكان المناسب (أي "بقعة الحلو")، لأنه لا يتم توزيع العينة متجانس. يمكنك اطلاق النار على نفس المنطقة حتى إشارة آخذ في الازدياد، ومن ثم محاولة إيجاد منطقة أخرى تحتوي على العينة.

في الختام، نقاء عالية من المصفوفات ويذابالوالدان، والأساليب المستخدمة لعينة والمصفوفات ترسب على الهدف، والموقف من المعايير المستخدمة للمعايرة، وكثافة طاقة الليزر، والوقت من اقتناء (عدد من الطلقات / البقعة) هي العوامل الحاسمة التي ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار عند تحليل البروتينات سليمة من قبل MALDI-TOF MS.

المؤلف مساهمات

LS والنفقات الخارجة عن الميزانية تصميم التجارب، أجريت التجارب مطياف الكتلة، تحليل البيانات، وكتب مخطوطة.

المواد

<قوي> الكواشف < / قوي >
Trizma هيدروكلوريد	Sigma	T3253
Trizima	Sigma	T6066
Micro Bio-Spin 6 أعمدة كروماتوغرافيا	Bio-Rad	732-6221
Vivaspin 500	Sartorius	VS0122	الجزيئي المختلف قطع
الميثانول	فلوكا	14262
الإيثانول	فلوكا	02860
KIMTECH SCIENCE مناديل مبللة دقيقة مناديل مناديل	الأنسجة كيمبرلي كلارك	05511
&# 945 ؛ -سيانو -4-هيدروكسي سيناميك حمض	سيجما ألدريتش	C8982
الأسيتون	سيجما ألدريتش	650501
2،5-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك	فلوكا	39319
جيلوادر نصائح	إيبندورف	0030 001.222
أسيتونيتريل	سيجما ألدريتش	34998
حمض الفورميك	فلوكا	09676
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك	سيجما ألدريتش	302031
بروتين قياسي II	بروكر دالتونيكس	207234	يحتوي على التربسينوجين والبروتين أ ومصل الألبومين البقري
الغلوبولين المناعي جي	ABSciex	GEN602151
[header]
تنقية المياه PURELAB Ultra Analytic	ELGA LabWater	89204-052
أداة Autoflex MALDI-TOF	Bruker Daltonics
MALDI-TOF الهدف	Bruker Daltonics