Method Article

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

DOI:

10.3791/50637

⸱

October 4th, 2013

 ,  , 
1Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض طريقتين التكميلية على أساس التدفق الخلوي والمجهري الذي تمكن من القياس الكمي، على مستوى خلية واحدة، لديناميات التعبير الجيني الناجم عن تفعيل مسار MAPK في الخميرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكمي في التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة تكشف آليات تنظيمية الرواية تحجب في قياسات أجريت على مستوى السكان. يتم عرض طريقتين على أساس المجهري والتدفق الخلوي لشرح كيفية يمكن الحصول على هذه البيانات. ويستخدم تعبير مراسل الفلورسنت التي يسببها على تفعيل الأسمولية عالية الجلسرين MAPK المسار في الخميرة كمثال على ذلك. ويسلط الضوء على المزايا المحددة لكل طريقة. التدفق الخلوي يقيس عدد كبير من الخلايا (10،000) ويوفر مقياسا مباشرا لديناميات البروتين التعبير مستقلة عن حركية النضج البطيء للبروتين فلوري. التصوير من الخلايا الحية بواسطة المجهر هو على النقيض من ذلك تقتصر على قياس شكل نضجت لمراسل في خلايا أقل. ومع ذلك، يمكن للمجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذه التقنية أن تكون غنية للغاية وذلك بفضل لمجموعات من الصحفيين ومتعددة للمعلومات المكانية والزمانيةتم الحصول عليها من الخلايا الفردية. يمكن الجمع بين هذه الطرق قياس اثنين تقديم رؤى جديدة بشأن تنظيم بروتين تعبير عن طريق مسارات الإشارات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إشارة عبر أجهزة الطرد المركزي تنبيغ غالبا ما يتوج في التعبير عن البروتينات. توصيف هذا الملف التعبير هي عنصر أساسي في فهم وظيفة المسارات البيولوجية. لا يمكن أن يتحقق تحديد الطيف من التنظيم حتى البروتينات وديناميات التنشيط من خلال تقنيات مختلفة مثل المصفوفات الدقيقة، البقع أو البقع شمال غرب 1-3. ومع ذلك، يبلغ متوسط ​​هذه التقنيات الاستجابة شعب بأكمله من الخلايا. لفهم التنظيم غرامة من التعبير عن البروتينات، فمن المستحسن لجمع القياسات على مستوى خلية واحدة. من الناحية المثالية، ينبغي أن توفر هذه القياسات أيضا البيانات الكمية قابلة للتطوير النماذج الرياضية للمسار الأساسي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المجهر القياسات

  1. تطعيم 5 مل من المتوسط ​​الاصطناعية مع الخميرة.
  2. تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
  3. قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي.
  4. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD ​​600 0.05.
  5. تنمو ثقافة المخفف عند 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر

كانت تعلق خلايا الخميرة تحمل مراسل التعبير ع STL1-QV (ySP9 7) إلى الجزء السفلي من الشريحة جيدا ووضعها تحت المجهر. وقد حفز الخلايا بإضافة التوتر المتوسط ​​مباشرة في البئر أثناء الدورة التصوير. وهذا يسمح لنا للحصول على عدد قليل من الصور من قبل خلايا مسار الاستقراء والمتابعة مصيرهم بعد التحفيز. في هذه الحالة، وتلت الخلايا ل~ 2 ساعة مع فاصل زمني من 10 دقيقة. الشكل 1A هو صورة م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر

علاج بشكل جيد مع CONA هو خطوة أساسية لضمان التصوير السليم للخلايا. لأن CONA ديه قدرة منخفضة على الذوبان في برنامج تلفزيوني (5 ملغ / مل)، يسمح للعملية الترشيح إزالة الركام الكبيرة التي تكون موجودة في الحل غير المرشحة وتتداخل مع التصوير. خلايا إرفاق بقوة نسبيا على السطح المعالجة وإضافة الحل حمل يجب عدم إزعاج توطين الخلايا، والسماح لتتبع مستمر قبل وبعد التحفيز. ويمكن أيضا أن هذا العلاج يتم تطبيقها على تدفق قنوات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين أشكر ماتياس بطرس وجماعته في معهد الكيمياء الحيوية في ETH في زيوريخ حيث تم تطوير هذه الأساليب. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments < td colspan = "4" ><قوي>المواد< / قوي> في المجهر

<قوي > كاشف < / قوي >
قاعدة نيتروجين خميرةلمتوسطCYN6202
CSM مزيج الأحماض الأمينيةلمتوسطDCS0011
Concanavalin AGE Healthcare17-0450-01
CycloheximideFluka Aldrich SigmaC7698Toxic
ySP9W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34pRS305 pSTL1 (-800 -0) - رباعي V enus
مجهرنيكونTi-Eclipse
المجهر برنامج التحكمMicro-managerالإصدار 1.4.11
غرفة الحضانةLISضوء مضان الصندوق
مصدرLumencorSpectraX
CameraHamamatsuFlash 4.0
مقياس التدفق الخلويBDFACS calibur
Sonicator bathTelesonicTUC-150
8-well-slide Thermo Lab-tek155409
96-well-plateMatrical BioscienceMGB096-1-2-LG
FACS أنبوبBD فالكون352054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MAPK PathwayYeast CellsFluorescent ReporterFlow CytometryLive Cell MicroscopySingle Cell AnalysisProtein ExpressionCycloheximide TreatmentTime Lapse ImagingGene Expression

Related Articles