Method Article

الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية

DOI:

10.3791/50639

⸱

December 10th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي المتزامن والمقارنة بين ثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. تتضمن المنهجية استخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، وبرامج التحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، وبرامج التحليل الإحصائي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) هو أداة قوية للتحقيق في الأغشية الحيوية. نجح عدد قليل جدا من التحقيقات في تحديد التوزيع المتزامن لأكثر من مكونين داخل الأغشية الحيوية للأسباب التالية: 1) اختيار الأصباغ الفلورية ذات الحد الأدنى من التداخل الطيفي أمر معقد ، و 2) يشكل القياس الكمي للفلوروكرومات المتعددة مشكلة متعددة العوامل. اهداف: الإبلاغ عن منهجية لتحديد ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية / خارج الخلية للأغشية الحيوية المزروعة على ركائز ذات صلة. أساليب: تتكون الطريقة من خطوات متميزة ومترابطة تتضمن نمو الأغشية الحيوية ، والتلوين ، وتصوير CLSM ، والتحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، والتحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية. نمت الأغشية الحيوية من العقدية الطافرة (سلالة UA159) لمدة 48 ساعة على عينات معقمة من مركبات راتنج النقطة 4 و TPH3. تم غمر العينات لاحقا لمدة 60 ثانية في غسول الفم Biotène PBF (BIO) أو Listerine Total Care (LTO) ، أو الماء (المجموعة الضابطة ؛ ن = 5 / مجموعة). تم تلطيخ الأغشية الحيوية بالفلوروكرومات للمواد البوليمرية خارج الخلية والبروتينات والأحماض النووية قبل التصوير باستخدام CLSM. كانت المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المحسوبة باستخدام برنامج تحليل الصور ISA3D هي الحجم الحيوي ومتوسط سمك الأغشية الحيوية. قارنت التحليلات الإحصائية للنماذج المختلطة المعلمات الهيكلية بين غسول الفم والمجموعات الضابطة (برنامج SAS ؛ α = 0.05). سمح برنامج Volocity بتصور التوزيعات ثلاثية الأبعاد لمكونات الأغشية الحيوية المتراكبة (الفلوروكروم). النتائج: أنتج غسول الفم BIO هياكل غشاء حيوي اختلفت اختلافا كبيرا عن التحكم (p<0.05) على كل من مركبات الراتنج ، في حين أن LTO لم ينتج اختلافات (p>0.05) في أي من المنتجين. الاستنتاجات: قامت هذه المنهجية بكفاءة ونجاح بقياس ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات رئيسية داخل الأغشية الحيوية S. mutans على الركائز ذات الصلة ، وبالتالي التغلب على تحديين للتقييم المتزامن لمكونات الأغشية الحيوية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد فعالية العوامل المضادة للبكتيريا / المضادة للحشف ضد مكونات الأغشية الحيوية المتعددة ، كما هو موضح باستخدام غسول الفم. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة لها تطبيق واسع لأنها تسهل مقارنة الهياكل ثلاثية الأبعاد / هندسة الأغشية الحيوية في مجموعة متنوعة من التخصصات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأغشية الحيوية عبارة عن مجتمعات ميكروبية منظمة مغلفة في مصفوفة خارج الخلية منتجة ذاتيا ، ومتصلة بأسطح بيولوجية أو خاملة1. تمثل الأغشية الحيوية أسلوب حياة مشتركا للعديد من البكتيريا ، وتتشكل عن طريق الانتقال على مراحل من الخلايا العائمة الحرة (العوالق) إلى مجتمعات معقدة متعددة الأنواع. المقاومة المتأصلة للأغشية الحيوية للعوامل المضادة للميكروبات هي السبب الجذري للعديد من الالتهابات البكتيرية المستمرة والمزمنة1،2 ، كما يتضح من الأغشية الحيوية عن طريق الفم (لوحة الأسنان). تقوم الكائنات الحية الدقيقة المسببة للتسوس مثل الطافرات والعقدية بمعالجة السكروز والكربوهيدرات الأخرى لإنتاج مصفوفة خارج الخلية وتوليد الأحماض التي يمكن أن تزيل المعادن من بنية الأسنان وتسبب تسوس الأسنان. معظم مصفوفات الأغشية الحيوية عبارة عن بوليمرات حيوية تتكون من مكونات خلوية وخارج الخلية مثل عديدات السكاريد الخارجية (EPS) والبروتينات والأحماض النووية3،4.

< p class = "jove_content" > المجهر بالليزر متحد البؤر (CLSM) ، التقني الأكثر استخداما للتصوير الفلوري ، قد أدى إلى تحويل التصوير البصري بشكل جذري في علم الأحياء لأن لديه القدرة على جمع صور ثلاثية الأبعاد للهياكل البيولوجية الرطبة دون تثبيت5،6،7. تتضمن هذه التقنية غير المدمرة جمع صور للأقسام الرقيقة داخل منطقة الاهتمام على العينة بطريقة تتم إزالة مساهمة الضوء خارج نطاق التركيز. تتجاوز جودة ودقة الصور الملتقطة بواسطة CLSM ما يمكن تحقيقه باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال. يتمثل أحد العوائق الرئيسية في CLSM في أن مسح الصور يحدث بمعدل أبطأ من تقنيات الفحص المجهري واسع المجال ، حيث يتم جمع الصور بأكملها في وقت واحد5. ومع ذلك ، مع اتساع مجموعة من الفلوروكرومات والليزر والمرشحات ، أصبحت CLSM واحدة من التقنيات السائدة للتصوير متعدد الأطياف5،7.

أظهرت الدراسات السابقة أن CLSM أداة مفيدة لفحص بنية أو بنية الأغشية الحيوية باستخدام علامة أو بقع فلورية واحدة أو اثنتين لتوفير فهم أفضل لتوزيع EPS والخلايا داخل الأغشية الحيوية ، وخاصة داخل المصفوفة خارج الخلية7،8. من الناحية النظرية ، من المستحسن تلطيخ / وضع العلامات الفلورية لمكونات متعددة لاستكشاف الهيكل التفصيلي وتحديد المواقع للمكونات الخلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. ومع ذلك ، فإن التحليل المتزامن للمكونات المختلفة داخل الأغشية الحيوية يمكن أن يكون صعبا للأسباب التالية: 1) اختيار الأصباغ الفلورية ذات الحد الأدنى من التداخل الطيفي أمر معقد ، و 2) يشكل القياس الكمي للفلوروكرومات المتعددة مشكلة متعددة العوامل. يتطلب التحديد المشترك باستخدام العديد من الفلوروكرومات استخدام بقع محددة للغاية مع الحد الأدنى من التداخل الطيفي لتجنب أي تأثيرات نزيف ، والتي تحدث عندما يكون لاثنين من الفلوروكروم تداخل كبير في ذروتها الطيفية ، مما يتسبب في إثارة أحدهما بقوة أكبر من الآخر9. من الناحية المثالية ، فإن الفلوروكرومات التي تحتوي على أطياف إثارة لا تتداخل ستوفر أفضل النتائج ، ولكن من الصعب جدا العثور على البقع التي تلبي هذا المعيار. بدلا من ذلك ، يتم تحسين اختيار البقع عن طريق اختيار الفلوروكرومات التي تحتوي أطياف انبعاثها على حد أدنى من التداخل ، مما يسمح بعرض البقع واحدة تلو الأخرى ضمن نطاق الطول الموجي المحدودللمراقبة 9.

من المحتمل أن يكون تراكب الصور الفلورية < p class = "jove_content" > هو الطريقة الأكثر استخداما لتقييم التوزيع المتزامن للفلوروكروم. يظهر تحديد موقع المكونات المختلفة على شكل تداخل بين ألوان مختلفة من خلال قنوات متعددة تم إنشاؤها بواسطة الفلوروكرومات التي يتمفحصها 10. تتوفر أدوات عرض الصور الفلورية متعددة القنوات كصور ملونة مدمجة في معظم برامج CLSM وبرامج تحليل الصور البيولوجية. على الرغم من أن تراكب الصور مفيد للتقييم المكاني للتوطين المشترك ، إلا أنه لا يمكن فحص الصور نوعيا إلا عن طريق التحليل البصري. يوفر هذا قدرا محدودا من المعلومات ، حيث أن هذه التمثيلات ليست مفيدة بشكل عام في تحديد تحديد التحديد الكمي في ظل ظروف تجريبية مختلفة ولا تحدد ما إذا كان التحديد المشترك يتجاوز المصادفةالعشوائية 11. استخدمت عدد قليل جدا من التحقيقات حتى الآن طرقا كمية لتحليل البنية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية ومكونات الأغشية الحيوية ، وحتى عدد أقل من ذلك قام بتحديد تأثير العلاجات المضادة للبكتيريا أو التدابير المضادة للحشف على مكونات الأغشية الحيوية.

كان الهدف من هذه الدراسة هو الإبلاغ عن منهجية للقياس الكمي والمقارنة بين التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية للأغشية الحيوية. تتكون الطريقة من خطوات متميزة ولكنها مترابطة تشمل نمو الأغشية الحيوية ، والتلوين ، وتصوير CLSM للأغشية الحيوية ، والتحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، والتحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية. يسمح اختبار نمو الأغشية الحيوية بنمو الأغشية الحيوية على الركائز ذات الصلة ، وينتج هياكل الأغشية الحيوية القابلة للتكرار. يؤدي الجمع بين التلوين المتزامن الجديد ل EPS والبروتينات ومكونات الحمض النووي مع قياس المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد إلى توزيعات قابلة للقياس الكمي للمكونات داخل الأغشية الحيوية. يسهل التحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية تقييم الأغشية الحيوية في ظل ظروف تجريبية محددة (على سبيل المثال بعد العلاج بغسول الفم) ، كما سيتم وصفه في القسم التالي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. تحضير الوسائط والكواشف

  1. اصنع 300 مل وسط استزراع بين عشية وضحاها (THY ؛ 3٪ مرق تود هيويت محضر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع 0.3٪ مستخلص الخميرة في ماء فائق النقاء) والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. اصنع 1 لتر THY أجار (3٪ مرق تود هيويت ، 0.3٪ مستخلص خميرة ، و 1.5٪ أجار في ماء عالي النقاء) ، الأوتوكلاف ، واتركه يبرد إلى 60 درجة مئوية قبل سكبه في أطباق بتري. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  3. اصنع 150 مل من وسط نمو الأغشية الحيوية (0.5X TY مكمل ب 10 ملي من السكروز ؛ 1.5٪ التربتون ، 0.5٪ مستخلص الخميرة ، و 10 ملي مولار من السكروز في ماء فائق النقاء) وقم بتعقيمه. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 شهر.
  4. اصنع 1 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 8 جم كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم كلوريد كلوريد الصوديوم ، 1.44 جم Na2HPO4 ، و 0.24 جم KH2PO4 في ماء عالي النقاء) والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  5. اصنع 600 مل 10 ملي من Tris HCl مع 10 ملي CaCl2 في ماء فائق النقاء (TC عازلة ؛ درجة الحموضة 7.2) والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  6. الأوتوكلاف 1 لتر ماء عالي النقاء. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
< p class = "jove_title" >2. تصنيع العينة
  1. قم بتصنيع عينات على شكل قرص من مركبات راتنج الأسنان Point 4 (PF) و TPH3 (TP) في قالب مصنوع خصيصا من الفولاذ المقاوم للصدأ بزيادتين. يتم معالجة كل زيادة بالضوء لمدة 40 ثانية باستخدام وحدة معالجة ضوء LED. يحتوي المنتجان على تركيبات ومستويات حشو مختلفة قليلا ، وبالتالي ينتجان طبوغرافيا سطحية مختلفة ستزرع عليها الأغشية الحيوية.
    1. يمكن تصنيع عينات من الركائز ذات الصلة باستخدام بروتوكولات معمول بها من تخصصات أخرى بدلا من الخطوة 2.1.
  2. قم بإنهاء وتلميع العينات إلى تشطيب سطح نهائي مقبول ، على سبيل المثال باستخدام مطحنة ملمع شبه آلي. اشطف العينات المصقولة بالماء فائق النقاء وجففها باستخدام الهواء المضغوط.
  3. تعقيم العينات باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين أو طريقة التعقيم البديلة.
< p class = "jove_title" >3. نمو الأغشية الحيوية
    تلقيح
  1. مستعمرة واحدة من S. mutans في وسط استزراع بين عشية وضحاها 4 مل (الخطوة 1.1). احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. يجب أن تكون الكثافة البصرية (OD600) للثقافة ≥0.9.
    1. من الأفضل استخدام مستعمرة من مزارع الصفائح التي تم تمريرها 2x من مخزون أصلي ، لأن هذا ينتج عنه نمو أغشية حيوية أكثر اتساقا.
  2. قم بإنشاء تخفيف بنسبة 1: 100 باستخدام المزرعة الليلية (الخطوة 1.1) في 10 مل من وسط نمو الأغشية الحيوية (الخطوة 1.3).
  3. نقل العينات المركبة من الراتنج المعقم (مثل PF ، TP) إلى ألواح معقمة ذات 12 بئرا.
  4. أضف 2.5 مل من وسط المزرعة المخفف (الخطوة 3.2) إلى الآبار للعلاج (غسول الفم) ومجموعات التحكم. أضف 2.5 مل من وسط نمو الأغشية الحيوية المعقمة غير الملقحة إلى آبار التحكم في العقم.
  5. قم بزراعة الأغشية الحيوية في ظل ظروف الهوائية الدقيقة. ضع الأطباق على شاكر عند 100 دورة في الدقيقة داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  6. بعد 24 ساعة ، قم بشفط الوسط من جميع الآبار واغسله مرتين باستخدام PBS معقم (الخطوة 1.4 ؛ 2.5 مل / بئر) ، مع شفط PBS بعد كل غسلة. قم بتجديد 2.5 مل من وسط نمو الأغشية الحيوية الطازجة في كل بئر واحتضانه لمدة 24 ساعة إضافية في ظل ظروف مماثلة للخطوة السابقة ، لإجمالي وقت نمو الأغشية الحيوية 48 ساعة.
  7. بدلا من الخطوات المذكورة أعلاه ، يمكن زراعة الأغشية الحيوية لأنواع أخرى على ركائز باستخدام البروتوكولات المعمول بها.
< p class = "jove_title" >4. العلاجات المضادة للبكتيريا / غسول الفم
  1. وسط الشفط بعد اكتمال نمو الأغشية الحيوية.
  2. أضف 2.5 مل من غسول الفم Biotène PBF (BIO) أو Listerine Total Care (LTO) ، أو طريقة علاج أخرى ، في آبار لمجموعات العلاج ، وأضف 2.5 مل من الماء المعقم عالي النقاء إلى مجموعة التحكم جيدا. اغمر العينات لمدة 60 ثانية ، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة ، أثناء تحريك الألواح على شاكر مداري عند 150 دورة في الدقيقة. استنشق على الفور كل من غسول الفم والماء عالي النقاء من الآبار.
  3. اغسل العينات 5 مرات لمدة 15 ثانية لكل غسلة بماء معقم فائق النقاء على الخلاط المداري عند 150 دورة في الدقيقة ، مع شفط الماء بعد كل خطوة غسيل.
  4. بدلا من الخطوات المذكورة أعلاه ، يمكن اختبار العوامل المضادة للبكتيريا الأخرى باستخدام البروتوكولات المعمول بها.
< ص الفئة = "jove_title" >5. تلطيخ
  1. تحضير تخفيفات البقع لتحليل الأغشية الحيوية.
    1. قم بإعداد محلول مخزون 5 مجم / مل من Concanavalin A ، Alexa Fluor 647 المترافق (AF) في 0.1 M بيكربونات الصوديوم درجة الحموضة 8.3. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حصص للاستخدام الفردي لعدة أشهر لأنه لا ينصح بالتجميد والذوبان. باستخدام محلول مخزون التركيز البؤري التلقائي هذا، قم بإعداد تخفيف 250 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت TC.
    2. قم بإعداد تخفيف 10 ميكرومولار باستخدام محلول مخزون Syto 9 (SY) سعة 5 ملي مولار ، على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة ، في المخزن المؤقت TC. قم بتخزين محلول مخزون SY المتبقي عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
    3. قم بإعداد تخفيف 10x باستخدام محلول مخزون Sypro Red (SR) 5,000x ، كما توفره الشركة المصنعة ، في ماء معقم فائق النقاء. قم بتخزين محلول مخزون SR المتبقي عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  2. اغسل جميع الأغشية الحيوية 2x باستخدام عازلة TC (2.5 مل / بئر) باستخدام حركة الدوران اليدوي ، مما يسمح للغسيل الثاني بالبقاء في الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الشفط.
  3. ضع قطرة 50 ميكرولتر من صبغة الرجفان الأذيني على كل عينة من الأغشية الحيوية. وصمة عار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. اغسل 2x باستخدام عازلة TC (2.5 مل / بئر) ، مع الشفط بعد كل غسلة.
  4. اتبعه بقطرة 50 ميكرولتر من صبغة SY على كل عينة من الأغشية الحيوية. وصمة عار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. اغسل 2x بماء معقم فائق النقاء (2.5 مل / بئر) ، مع الشفط بعد كل غسلة
  5. أخيرا ، ضع قطرة 50 ميكرولتر من صبغة SR على كل عينة من الأغشية الحيوية. وصمة عار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. اغسل 3 مرات بماء معقم فائق النقاء (2.5 مل / بئر) ، مع الشفط بعد كل غسلة.
  6. انقل العينات إلى صفيحة مكونة من 6 آبار ، ووضع عينة واحدة لكل بئر في 6 مل من الماء المعقم فائق النقاء لتسهيل الفحص المجهري متحد البؤر.
فئة

6. التصوير باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر

  1. احصل على صور لكل مكون (بقعة) داخل الأغشية الحيوية لمجموعات العلاج والتحكم باستخدام إعدادات مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر الموضح في الجدول 1. تم استخدام عدسة غمس 63X بفتحة عددية 0.9 بمسافة عمل تبلغ 2.2 مم في هذه الدراسة.
    figure-protocol-1
    الجدول 1. إعدادات مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر.

  1. اضبط حجم المسح الضوئي على 250 ميكرومتر × 250 ميكرومتر ودقة بكسل لا تقل عن 512 × 512 للحصول على صور CLSM بدقة مناسبة للتحليل الكمي.
  2. استخدم صبغة SY لضبط النقاط العلوية والسفلية لمجموعة صور الأغشية الحيوية ، ثم اضبط الخطوة z لتكون مناسبة للتحليل الكمي (0.6 ميكرومتر لهذه الدراسة). قبل جمع المسح الضوئي ، قم بتحسين معلمات الصورة والبقع (مثل جهد PMT والإزاحة) باستخدام خيار QLUT. تم استخدام جدول البحث عن الألوان لتعيين ألوان زائفة لكل بقعة (أخضر ل SY ، وأحمر ل SR ، والأزرق ل AF) من أجل جعل كل مكون من مكونات الأغشية الحيوية أكثر تميزا في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.
  3. اجمع صور CLSM بتردد 400 هرتز باستخدام المسح المتسلسل في وضع "بين المكدسات" لتحسين التقاط صور البقع المتعددة داخل نفس الأغشية الحيوية.
فئة

7. التحليل الهيكلي للأغشية الحيوية

  1. تحليل صور CLSM التي تم جمعها باستخدام برنامج تحليل الصور للأغشية الحيوية. تصف الخطوات التالية استخدام برنامج ISA3D12 لحساب المعلمات الهيكلية لصور الأغشية الحيوية التي تم جمعها.
    1. انسخ ملفات صور CLSM لكل فيلم حيوي إلى مجلد الصور، كما هو محدد في دليل البرنامج. تأكد من اتباع اصطلاح التسمية لملفات CLSM المطلوبة من قبل البرنامج. يسمح البرنامج بتحليل الملفات داخل المجلدات الفرعية في وضع الدفعات ، مما يسهل تحليل الأغشية الحيوية للمعالجة ومجموعة التحكم في نفس التشغيل.
    2. أدخل أبعاد المحور x وy وz لصور CLSM في حقلي dxy وdz في مربع الحوار الرئيسي. حدد إعدادات تعيين العتبة والمسافة ، كما هو موضح في دليل البرنامج (تم استخدام Otsu و Quasi-Euclidean لهذه الدراسة ، على التوالي). أدخل اسما مناسبا لملف النتائج ، ثم قم بتشغيل البرنامج. سيتم إنتاج ملف النتائج في مجلد ISA.
    3. عرض ملف النتائج للحصول على قيم لعشرين معلمة هيكلية ثلاثية الأبعاد12 مثل الحجم الحيوي ومتوسط سمك الأغشية الحيوية (تم قياسها في هذه الدراسة) التي تحدد التوزيع ثلاثي الأبعاد لكل مكون (بقعة) داخل الأغشية الحيوية.
< p class = "jove_title" >8. تصور هيكل الأغشية الحيوية
  1. قم بإنشاء إعادة بناء للمكونات المتراكبة (البقع) داخل كل غشاء حيوي باستخدام برنامج تحليل الصور. تصف الخطوات التالية استخدام برنامج Volocity لإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
    1. قم بإنشاء مكتبة لكل فيلم حيوي عن طريق نسخ ملفات صور CLSM إلى البرنامج ، كما هو موضح في الدليل.
    2. استخدم خيار قائمة 3D Renderer لإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها من صور CLSM لكل فيلم حيوي (تم استخدام تنسيق عتامة HR لهذه الدراسة).
    3. قم بتدوير الصورة ثلاثية الأبعاد لتوجيه جميع الأغشية الحيوية بطريقة مماثلة فيما يتعلق بمحاور الإحداثيات x و y و z. التقط لقطة لإعادة بناء الأغشية الحيوية الموجهة بشكل صحيح ، ثم قم بتصدير اللقطة بتنسيق TIFF أو JPEG أو أي تنسيق مناسب آخر.
  2. إجراء تحليل بصري للتوزيع المتزامن ل EPS والبروتينات ومكونات الحمض النووي داخل الأغشية الحيوية على الصور المعاد بناؤها.
  3. استخدم معامل ارتباط بيرسون ومعامل تداخل ماندرز لإجراء تحليل تحديد الموقع لمكونات الأغشية الحيوية المتعددة (لم يتم قياس التموضع المشترك في هذه الدراسة).
< p class = "jove_title" >9. التحليل الإحصائي
  1. استخدم التحليلات الإحصائية للنماذج المختلطة المنفصلة لمقارنة القيم المتوسطة للمعلمات الهيكلية بين غسول الفم ومجموعات التحكم (α = 0.05). في هذه الدراسة ، تم استخدام برنامج SAS لإجراء التحليل الإحصائي.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج التمثيلية للعلاجات (غسول الفم) ومجموعة المراقبة غير المعالجة موضحة في الجدول 2 ، والشكلين 1 و 2. يعرض الجدول 2 قيم المتوسط والانحراف المعياري للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية الحجم الحيوي (μm3) ومتوسط سمك الأغشية الحيوية (μm) التي تم حسابها باستخدام برنامج ISA3D. المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المعالجة بغسول الفم والتي اختلفت اختلافا كبيرا عن تلك الموجودة في الأغشية الحيوية في المجموعة الضابطة (p<0.05) لها قيم متوسط وانحراف معياري مميزة باللون الأحمر. أظهرت نتائج التحليلات الإحصائية للنماذج المختلطة أن غسول الفم BIO أنتج هياكل غشاء حيوي تختلف اختلافا كبيرا عن التحكم (p<0.05) على كل من مركبات الراتنج ، في حين أن غسول الفم LTO لم ينتج فروقا كبيرة (p>0.05) على أي من مركب الراتنج. تظهر النتائج بوضوح أن مكونات الأغشية الحيوية الخلوية وخارج الخلية المتبقية بعد علاجي غسول الفم اختلفت. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن S. mutans الأغشية الحيوية المزروعة على الركيزتين (PF و TP) اختلفت في الهيكل ثلاثي الأبعاد على الرغم من أنها نمت في ظل ظروف متشابهة وتم صقل كلتا الركيزتين بمواد كاشطة مماثلة.

يمكن تصور التوزيع المتزامن ل EPS والبروتينات والحمض النووي داخل الأغشية الحيوية من خلال عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج Volocity. يوضح الشكلان 1 و 2 عمليات إعادة بناء تمثيلية للأغشية الحيوية لمجموعة التحكم المزروعة على مركبات راتنج PF و TP ، على التوالي. تمثل البقعة الزرقاء EPS داخل الأغشية الحيوية S. mutans ، وتظهر البقعة الخضراء الأحماض النووية ، وتظهر البقعة الحمراء البروتينات. قد يشغل الماء أو مكونات الأغشية الحيوية الأخرى غير الفلورية.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-1
الشكل 1. إعادة بناء تمثيلية ثلاثية الأبعاد ل S. mutans biofilm المزروعة على مركب راتنج PF في المجموعة الضابطة (غير معالج بغسول الفم). يسمح التراكب المتزامن للبقع الثلاث داخل غشاء حيوي واحد بالتصور المتزامن ل EPS (البقعة الزرقاء) ، والحمض النووي (البقعة الخضراء) ، والبروتين (البقعة الحمراء) داخل S. mutans الأغشية الحيوية. (1 وحدة = 24 ميكرومتر). انقر هنا لعرض رقم أكبر. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-2
الشكل 2. إعادة بناء 3D تمثيلية ل S. mutans biofilm المزروعة على مركب راتنج TP في المجموعة الضابطة (غير معالج بغسول الفم). يسمح التراكب المتزامن للبقع الثلاث داخل غشاء حيوي واحد بالتصور المتزامن ل EPS (البقعة الزرقاء) ، والحمض النووي (البقعة الخضراء) ، والبروتين (البقعة الحمراء) داخل S. mutans الأغشية الحيوية. (1 وحدة = 24 ميكرومتر). انقر هنا لعرض رقم أكبر. مركب الراتنج النقطة 4 TPH3 غسول الفم مكون BV (ميكرومتر3) MT (ميكرومتر) BV (ميكرومتر3) MT (ميكرومتر) Biotène PBF الأحماض النووية 279,517±53,291 9.32±2.80 195,033±42,014 7.45±3.70 ربحية السهم 344,902±56,386 35.22±17.19 197,840±62,351 9.83±7.26 بروتينات 298,796±62,868 54.21±21.65 216,033±66,654 24.33±39.64 العناية الكاملة بالليسترين الأحماض النووية 355,707±110,444 26.45±14.21 273,296±47,323 13.43±2.89 ربحية السهم 494,099±180,592 64.90± 26.68 329,150±47,145 34.35±30.32 بروتينات 348,416±161,316 58.68±47.28 303,150±54,705 34.18±41.46 التحكم (غير المعالج) الأحماض النووية 388,375±42,152 51.15±40.66 327,809±39,400 17.08±1.65 ربحية السهم 660,448±173,197 91.37±74.84 363,850±67,612 28.33± 15.07 بروتينات 517,274±119,475 127.96±73.84 353,161±56,518 21.17±4.41 < p class = "jove_content" > الجدول 2. قيم المتوسط والانحراف المعياري للحجم الحيوي (BV) ومتوسط سمك الأغشية الحيوية (MT) للأغشية الحيوية المعالجة ب BIO أو LTO ، أو تركت دون معالجة (المجموعة الضابطة). المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المعالجة بغسول الفم والتي اختلفت اختلافا كبيرا عن تلك الموجودة في الأغشية الحيوية في المجموعة الضابطة (p<0.05) لها قيم متوسط وانحراف معياري مميزة باللون الأحمر.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إجراء الحصول على صور CLSM بالطريقة والشكل اللازمين لقياس الأغشية الحيوية وتحليل التحديد المشترك ، بحيث يكون توزيع شدة الإشارة في كل صورة تمثيلا موثوقا به لتوزيع كل فلوروكروم في مكدس الأغشية الحيوية. يجب تمييز شدة الإشارة عن الضوضاء والخلفية10،11 ، وعدم التأثر بالتألق الذاتي من الركيزة ، ولها الحد الأدنى من النزيف بسبب التداخل الطيفي بين الفلوروكرومات المستخدمة11. الضوضاء هي قيد لا مفر منه للفحص المجهريالفلوري 11 ، ويمكن أن تكون جودة الصورة محدودة في بعض الأحيان لأسباب فنية أو لوجستية. يعد تحديد الفلوروكرومات ذات الحد الأدنى من التداخل الطيفي أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذه الطريقة ، ولكنه قد يكون معقدا. علاوة على ذلك ، فإن القياس الكمي للفلوروكرومات المتعددة يشكل مشكلة متعددة العوامل. لذلك ، ليس من المستغرب أن عددا قليلا جدا من التحقيقات نجح في تحديد التوزيع المتزامن لأكثر من مكونين داخل هياكل الأغشية الحيوية.

كان الهدف من هذه الدراسة هو الإبلاغ عن منهجية تتكون من خطوات متميزة ولكنها مترابطة للقياس الكمي والمقارنة بين التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. يسمح فحص نمو الأغشية الحيوية الموصوف بنمو الأغشية الحيوية على الركائز ذات الصلة وينتج هياكل أغشية حيوية قابلة للتكرار ، كما هو موضح في النتائج الواردة في الجدول 1. يؤدي الجمع بين التلوين المتزامن الجديد ل EPS والبروتينات ومكونات الحمض النووي مع قياس المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد إلى توزيعات قابلة للقياس الكمي للمكونات داخل الأغشية الحيوية. يمكن التحليل البصري النوعي للتوزيع المتزامن ل EPS والبروتينات والحمض النووي داخل الأغشية الحيوية من خلال إعادة بناء البقع المتراكبة داخل كل غشاء حيوي. يحتوي برنامج ISA3D12 على العديد من المعلمات الهيكلية الفريدة مثل البعد الكسوري والتجانس ومعامل خشونة الأغشية الحيوية بالإضافة إلى المعلمات المقاسة تقليديا مثل المسامية وسمك الأغشية الحيوية لتعزيز القياس الكمي للهياكل ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية. يسهل التحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المقارنات ذات الصلة للأغشية الحيوية في ظل ظروف تجريبية محددة مثل الفعالية المضادة للبكتيريا / المضادة للحشف (على سبيل المثال بعد العلاج بغسول الفم) أو بمرور الوقت (التأثيرات الزمنية).

قامت هذه المنهجية بتحديد ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات رئيسية داخل S. mutans الأغشية الحيوية التي نمت على الركائز ذات الصلة ، وبالتالي التغلب على تحديين للتقييم المتزامن لمكونات الأغشية الحيوية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد فعالية العلاجات المضادة للبكتيريا أو التدابير المضادة للحشف ضد مكونات الأغشية الحيوية المتعددة ، كما هو موضح باستخدام غسول الفم في هذه الدراسة. علاوة على ذلك ، يمكن استبدال غالبية البروتوكولات الموضحة أعلاه ببروتوكولات لتصنيع الركائز ذات الصلة ومقايسات نمو الأغشية الحيوية للكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة. لذلك ، فإن هذه الطريقة لها تطبيق واسع لأنها تسهل مقارنة الهياكل / الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي في مجموعة متنوعة من التخصصات بما في ذلك العلوم الطبية وطب الأسنان والجيولوجيا والبحرية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. الإنتاج والوصول المجاني إلى هذه المقالة برعاية Leica Microsystems.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير تمويل هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR 1R15DE019566-01A1. د. تم الاعتراف ب Jim Henthorn (مختبر OUHSC Flow and Image Cytometry Parkatory) لتقديم المساعدة الفنية في الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر. تم تقدير الدكتور فرناندو إستيبان فلوريز (قسم مواد طب الأسنان) لتقديم المساعدة الفنية أثناء تصوير هذا الفيديو.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
باكتو أجاربيكتون وديكنسون وشركاه214010
باكتو تود هيويت مرقبيكتون وديكنسون وشركاه249240
مستخلص الخميرة ، حبيباتEMD Millipore1.03753.0500
باكتو تريبتونبيكتون وديكنسون وشركاه211705
OmniPur السكروزEMD Millipore8510
كلوريد البوتاسيوم ، كاشف ACS ، 99.0-100.5٪سيجما ألدريتشP3911-500G
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدة ، & ge ؛ 99.0٪ ، كاشف ACSسيجما ألدريتشP0662-500G
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS9888-500G
فوسفات الصوديوم ، أحادي الأساس ، أحادي الهيدراتEMD MilliporeSX0710-1
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان ، 99.8 + ٪ ، كاشف ACSسيجما ألدريتش252859-500G
كونكانافالين أ ، أليكسا فلور 647 مترافقإنفيتروجينC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 أو S6653
Biot & egrave ؛ ne PBF شطف الفمGlaxoSmithKlineN / A
Listerine Total CareMcNeil-PPC، Inc.غير متاح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).">Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).">Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).">Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).">Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).">Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).">Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).">Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).">Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).">Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).">Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).">Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biofilm QuantificationConfocal MicroscopyExtracellular Polymeric SubstancesNucleic Acid StainingProtein StainingBiofilm Structural Analysis3D Image ReconstructionStatistical AnalysisMouthwash TreatmentStreptococcus Mutans

Related Articles