مقالة منهجية

الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية

10.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50639

⸱

ديسمبر 10, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي المتزامن والمقارنة بين ثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. تتضمن المنهجية استخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، وبرامج التحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، وبرامج التحليل الإحصائي.

الملخص

الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) هو أداة قوية للتحقيق في الأغشية الحيوية. نجح عدد قليل جدا من التحقيقات في تحديد التوزيع المتزامن لأكثر من مكونين داخل الأغشية الحيوية للأسباب التالية: 1) اختيار الأصباغ الفلورية ذات الحد الأدنى من التداخل الطيفي أمر معقد ، و 2) يشكل القياس الكمي للفلوروكرومات المتعددة مشكلة متعددة العوامل. اهداف: الإبلاغ عن منهجية لتحديد ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية / خارج الخلية للأغشية الحيوية المزروعة على ركائز ذات صلة. أساليب: تتكون الطريقة من خطوات متميزة ومترابطة تتضمن نمو الأغشية الحيوية ، والتلوين ، وتصوير CLSM ، والتحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، والتحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية. نمت الأغشية الحيوية من العقدية الطافرة (سلالة UA159) لمدة 48 ساعة على عينات معقمة من مركبات راتنج النقطة 4 و TPH3. تم غمر العينات لاحقا لمدة 60 ثانية في غسول الفم Biotène PBF (BIO) أو Listerine Total Care (LTO) ، أو الماء (المجموعة الضابطة ؛ ن = 5 / مجموعة). تم تلطيخ الأغشية الحيوية بالفلوروكرومات للمواد البوليمرية خارج الخلية والبروتينات والأحماض النووية قبل التصوير باستخدام CLSM. كانت المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المحسوبة باستخدام برنامج تحليل الصور ISA3D هي الحجم الحيوي ومتوسط سمك الأغشية الحيوية. قارنت التحليلات الإحصائية للنماذج المختلطة المعلمات الهيكلية بين غسول الفم والمجموعات الضابطة (برنامج SAS ؛ α = 0.05). سمح برنامج Volocity بتصور التوزيعات ثلاثية الأبعاد لمكونات الأغشية الحيوية المتراكبة (الفلوروكروم). النتائج: أنتج غسول الفم BIO هياكل غشاء حيوي اختلفت اختلافا كبيرا عن التحكم (p<0.05) على كل من مركبات الراتنج ، في حين أن LTO لم ينتج اختلافات (p>0.05) في أي من المنتجين. الاستنتاجات: قامت هذه المنهجية بكفاءة ونجاح بقياس ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات رئيسية داخل الأغشية الحيوية S. mutans على الركائز ذات الصلة ، وبالتالي التغلب على تحديين للتقييم المتزامن لمكونات الأغشية الحيوية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد فعالية العوامل المضادة للبكتيريا / المضادة للحشف ضد مكونات الأغشية الحيوية المتعددة ، كما هو موضح باستخدام غسول الفم. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة لها تطبيق واسع لأنها تسهل مقارنة الهياكل ثلاثية الأبعاد / هندسة الأغشية الحيوية في مجموعة متنوعة من التخصصات.

المقدمة

الأغشية الحيوية عبارة عن مجتمعات ميكروبية منظمة مغلفة في مصفوفة خارج الخلية منتجة ذاتيا ، ومتصلة بأسطح بيولوجية أو خاملة1. تمثل الأغشية الحيوية أسلوب حياة مشتركا للعديد من البكتيريا ، وتتشكل عن طريق الانتقال على مراحل من الخلايا العائمة الحرة (العوالق) إلى مجتمعات معقدة متعددة الأنواع. المقاومة المتأصلة للأغشية الحيوية للعوامل المضادة للميكروبات هي السبب الجذري للعديد من الالتهابات البكتيرية المستمرة والمزمنة1،2 ، كما يتضح من الأغشية الحيوية عن طريق الفم (لوحة الأسنان). تقوم الكائنات الحية الدقيقة المسببة للتسوس مثل الطافرات والعقدية بمعالجة السكروز والكربوهيدرات الأخرى لإنتاج مصفوفة خارج الخلية وتوليد الأحماض التي يمكن أن تزيل المعادن من بنية الأسنان وتسبب تسوس الأسنان. معظم مصفوفات الأغشية الحيوية عبارة عن بوليمرات حيوية تتكون من مكونات خلوية وخارج الخلية مثل عديدات السكاريد الخارجية (EPS) والبروتينات والأحماض النووية3،4.

< p class = "jove_content" > المجهر بالليزر متحد البؤر (CLSM) ، التقني الأكثر استخداما للتصوير الفلوري ، قد أدى إلى تحويل التصوير البصري بشكل جذري في علم الأحياء لأن لديه القدرة على جمع صور ثلاثية الأبعاد للهياكل البيولوجية الرطبة دون تثبيت5،6،7. تتضمن هذه التقنية غير المدمرة جمع صور للأقسام الرقيقة داخل منطقة الاهتمام على العينة بطريقة تتم إزالة مساهمة الضوء خارج نطاق التركيز. تتجاوز جودة ودقة الصور الملتقطة بواسطة CLSM ما يمكن تحقيقه باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال. يتمثل أحد العوائق الرئيسية في CLSM في أن مسح الصور يحدث بمعدل أبطأ من تقنيات الفحص المجهري واسع المجال ، حيث يتم جمع الصور بأكملها في وقت واحد5. ومع ذلك ، مع اتساع مجموعة من الفلوروكرومات والليزر والمرشحات ، أصبحت CLSM واحدة من التقنيات السائدة للتصوير متعدد الأطياف5،7.

أظهرت الدراسات السابقة أن CLSM أداة مفيدة لفحص بنية أو بنية الأغشية الحيوية باستخدام علامة أو بقع فلورية واحدة أو اثنتين لتوفير فهم أفضل لتوزيع EPS والخلايا داخل الأغشية الحيوية ، وخاصة داخل المصفوفة خارج الخلية7،8. من الناحية النظرية ، من المستحسن تلطيخ / وضع العلامات الفلورية لمكونات متعددة لاستكشاف الهيكل التفصيلي وتحديد المواقع للمكونات الخلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. ومع ذلك ، فإن التحليل المتزامن للمكونات المختلفة داخل الأغشية الحيوية يمكن أن يكون صعبا للأسباب التالية: 1) اختيار الأصباغ الفلورية ذات الحد الأدنى من التداخل الطيفي أمر معقد ، و 2) يشكل القياس الكمي للفلوروكرومات المتعددة مشكلة متعددة العوامل. يتطلب التحديد المشترك باستخدام العديد من الفلوروكرومات استخدام بقع محددة للغاية مع الحد الأدنى من التداخل الطيفي لتجنب أي تأثيرات نزيف ، والتي تحدث عندما يكون لاثنين من الفلوروكروم تداخل كبير في ذروتها الطيفية ، مما يتسبب في إثارة أحدهما بقوة أكبر من الآخر9. من الناحية المثالية ، فإن الفلوروكرومات التي تحتوي على أطياف إثارة لا تتداخل ستوفر أفضل النتائج ، ولكن من الصعب جدا العثور على البقع التي تلبي هذا المعيار. بدلا من ذلك ، يتم تحسين اختيار البقع عن طريق اختيار الفلوروكرومات التي تحتوي أطياف انبعاثها على حد أدنى من التداخل ، مما يسمح بعرض البقع واحدة تلو الأخرى ضمن نطاق الطول الموجي المحدودللمراقبة 9.

من المحتمل أن يكون تراكب الصور الفلورية < p class = "jove_content" > هو الطريقة الأكثر استخداما لتقييم التوزيع المتزامن للفلوروكروم. يظهر تحديد موقع المكونات المختلفة على شكل تداخل بين ألوان مختلفة من خلال قنوات متعددة تم إنشاؤها بواسطة الفلوروكرومات التي يتمفحصها 10. تتوفر أدوات عرض الصور الفلورية متعددة القنوات كصور ملونة مدمجة في معظم برامج CLSM وبرامج تحليل الصور البيولوجية. على الرغم من أن تراكب الصور مفيد للتقييم المكاني للتوطين المشترك ، إلا أنه لا يمكن فحص الصور نوعيا إلا عن طريق التحليل البصري. يوفر هذا قدرا محدودا من المعلومات ، حيث أن هذه التمثيلات ليست مفيدة بشكل عام في تحديد تحديد التحديد الكمي في ظل ظروف تجريبية مختلفة ولا تحدد ما إذا كان التحديد المشترك يتجاوز المصادفةالعشوائية 11. استخدمت عدد قليل جدا من التحقيقات حتى الآن طرقا كمية لتحليل البنية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية ومكونات الأغشية الحيوية ، وحتى عدد أقل من ذلك قام بتحديد تأثير العلاجات المضادة للبكتيريا أو التدابير المضادة للحشف على مكونات الأغشية الحيوية.

كان الهدف من هذه الدراسة هو الإبلاغ عن منهجية للقياس الكمي والمقارنة بين التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية للأغشية الحيوية. تتكون الطريقة من خطوات متميزة ولكنها مترابطة تشمل نمو الأغشية الحيوية ، والتلوين ، وتصوير CLSM للأغشية الحيوية ، والتحليل الهيكلي للأغشية الحيوية والتصور ، والتحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية. يسمح اختبار نمو الأغشية الحيوية بنمو الأغشية الحيوية على الركائز ذات الصلة ، وينتج هياكل الأغشية الحيوية القابلة للتكرار. يؤدي الجمع بين التلوين المتزامن الجديد ل EPS والبروتينات ومكونات الحمض النووي مع قياس المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد إلى توزيعات قابلة للقياس الكمي للمكونات داخل الأغشية الحيوية. يسهل التحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية تقييم الأغشية الحيوية في ظل ظروف تجريبية محددة (على سبيل المثال بعد العلاج بغسول الفم) ، كما سيتم وصفه في القسم التالي.

البروتوكول

1. تحضير الأوساط والكواشف

  1. حضّر 300 ml من وسط المزرعة لليلة واحدة (THY؛ وهو عبارة عن 3% Todd Hewitt Broth مُحضّر وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة ومُدعم بـ 0.3% Yeast Extract في ماء فائق النقاء) ثم عَقِّمه بالـ autoclave. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهرين.
  2. حضّر 1 L من أغار THY (يتكون من 3% Todd Hewitt Broth، و0.3% Yeast Extract، و1.5% agar في ماء فائق النقاء)، ثم عَقِّمه بالـ autoclave، وبَرِّده حتى 60 °C قبل صبّه في أطباق Petri. يُحفظ في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  3. حضّر 150 ml من وسط نمو الغشاء الحيوي (0.5X TY مُدعم بـ 10 mM sucrose؛ ويتكون من 1.5% Tryptone، و0.5% Yeast Extract، و10 mM sucrose في ماء فائق النقاء) ثم عَقِّمه بالترشيح. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهر واحد.
  4. حضّر 1 L من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS؛ ويتكون من 8 g NaCl، و0.2 g KCl، و1.44 g Na2HPO4، و0.24 g KH2PO4 في ماء فائق النقاء) ثم عَقِّمه بالـ autoclave. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  5. حضّر 600 ml من محلول Tris HCl المنظم بتركيز 10 mM مُدعم بـ 10 mM CaCl2 في ماء فائق النقاء (TC buffer؛ pH 7.2) ثم عَقِّمه بالـ autoclave. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  6. عَقِّم 1 L من الماء فائق النقاء باستخدام الـ autoclave. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.

2. تجهيز العينات

  1. قم بتصنيع عينات قرصية الشكل من مركبات الراتنج السنية Point 4 (PF) و TPH3 (TP) في قالب من الفولاذ المقاوم للصدأ مُصنع خصيصاً على مرحلتين. يتم معالجة كل مرحلة بالضوء لمدة 40 sec باستخدام وحدة معالجة ضوئية LED. يتميز المنتجان بتركيبات ومستويات حشوات مختلفة قليلاً، وبالتالي ينتجان تضاريس سطحية مختلفة ستنمو عليها الأغشية الحيوية.
    1. يمكن تصنيع عينات من الركائز ذات الصلة باستخدام بروتوكولات معتمدة من تخصصات أخرى بدلاً من الخطوة 2.1.
  2. قم بإنهاء وتلميع العينات للوصول إلى تشطيب نهائي مقبول للسطح، على سبيل المثال، باستخدام جهاز تجليخ وتلميع شبه آلي. اشطف العينات الملمعة بماء فائق النقاء وجففها باستخدام الهواء المضغوط.
  3. قم بتعقيم العينات باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين أو طريقة تعقيم بديلة.

3. نمو الغشاء الحيوي

  1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من S. mutans في 4 ml من وسط زراعة ليلي (الخطوة 1.1). يتم التحضين طوال الليل عند 37 °C لمدة 16-18 hr. يجب أن تكون الكثافة الضوئية (OD600) للمزرعة ≥0.9.
    1. يُفضل استخدام مستعمرة من مزارع الأطباق التي تم تمريرها مرتين من المخزون الأصلي، حيث يؤدي ذلك إلى نمو أكثر اتساقاً للغشاء الحيوي.
  2. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1:100 باستخدام المزرعة الليلية (الخطوة 1.1) في 10 ml من وسط نمو الغشاء الحيوي (الخطوة 1.3).
  3. انقل عينات الراتنج المركب المعقمة (e.g. PF, TP) إلى أطباق معقمة ذات 12 بئراً.
  4. أضف 2.5 ml من وسط المزرعة المخفف (الخطوة 3.2) إلى آبار مجموعات العلاج (غسول الفم) ومجموعات الضبط. أضف 2.5 ml من وسط نمو الغشاء الحيوي المعقم وغير الملقح إلى آبار ضبط التعقيم.
  5. قم بتنمية الأغشية الحيوية تحت ظروف هوائية دقيقة. ضع الأطباق على جهاز هزاز بسرعة 100 rpm داخل حاضنة عند 37 °C لمدة 24 hr.
  6. بعد 24 hr، قم بشفط الوسط من جميع الآبار بطريقة معقمة واغسلها مرتين باستخدام PBS معقم (الخطوة 1.4؛ 2.5 ml/well)، مع شفط الـ PBS بعد كل غسلة. أضف 2.5 ml من وسط نمو الغشاء الحيوي الطازج في كل بئر وحضنها لمدة 24 hr إضافية تحت ظروف مماثلة للخطوة السابقة، ليصل إجمالي وقت نمو الغشاء الحيوي إلى 48 hr.
  7. بدلاً من الخطوات المذكورة أعلاه، يمكن تنمية أغشية حيوية لأنواع أخرى على ركائز باستخدام البروتوكولات المعتمدة.

4. المعالجات المضادة للبكتيريا/غسول الفم

  1. قم بسحب الوسط بعد اكتمال نمو الغشاء الحيوي الرقيق.
  2. أضف 2.5 ml من غسول الفم Biotène PBF (BIO) أو Listerine Total Care (LTO)، أو أي وسيلة علاجية أخرى، في آبار مجموعات العلاج، وأضف 2.5 ml من الماء فائق النقاء المعقم إلى بئر مجموعة الضبط. اغمر العينات لمدة 60 sec، وفقاً لتعليمات الشركات المصنعة، مع تحريك الأطباق على هزاز مداري بسرعة 150 rpm. اسحب فوراً غسول الفم والماء فائق النقاء من الآبار.
  3. اغسل العينات 5 مرات لمدة 15 sec لكل غسلة باستخدام الماء فائق النقاء المعقم على الهزاز المداري بسرعة 150 rpm، مع سحب الماء بعد كل خطوة غسيل.
  4. بدلاً من الخطوات المذكورة أعلاه، يمكن اختبار عوامل مضادة للبكتيريا أخرى باستخدام البروتوكولات المعتمدة.

5. التلوين

  1. تحضير تخفيفات الأصباغ لتحليل الغشاء الحيوي الرقيق.
    1. تحضير محلول مخزون بتركيز 5 mg/ml من Concanavalin A المقترن بـ Alexa Fluor 647 (AF) في بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.1 M ورقم هيدروجيني pH 8.3. يُحفظ في درجة حرارة -20 °C في حصص مخصصة للاستخدام لمرة واحدة لعدة أشهر، حيث يُنصح بتجنب التجميد والإذابة المتكررين. وباستخدام محلول AF المخزون هذا، يتم تحضير تخفيف بتركيز 250 μg/ml في منظم TC.
    2. تحضير تخفيف بتركيز 10 μM باستخدام محلول Syto 9 المخزون بتركيز 5 mM (SY)، كما هو مورد من الشركة المصنعة، في منظم TC. يُحفظ ما تبقى من محلول SY المخزون في درجة حرارة -20 °C لعدة أشهر.
    3. تحضير تخفيف بمقدار 10x باستخدام محلول Sypro Red المخزون بتركيز 5,000x (SR)، كما هو مورد من الشركة المصنعة، في ماء فائق النقاء ومعقم. يُحفظ ما تبقى من محلول SR المخزون في درجة حرارة -20 °C لعدة أشهر.
  2. غسل جميع الأغشية الحيوية مرتين باستخدام منظم TC (بواقع 2.5 ml/well) عن طريق التحريك اليدوي الدائري، مع ترك الغسلة الثانية في الطبق لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، ثم سحب السائل.
  3. وضع قطرة بحجم 50 μl من صبغة AF على كل عينة من الغشاء الحيوي. تُترك الصبغة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء. تُغسل العينات مرتين بمنظم TC (بواقع 2.5 ml/well)، مع سحب السائل بعد كل غسلة.
  4. يتبع ذلك وضع قطرة بحجم 50 μl من صبغة SY على كل عينة من الغشاء الحيوي. تُترك الصبغة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء. تُغسل العينات مرتين بماء فائق النقاء ومعقم (بواقع 2.5 ml/well)، مع سحب السائل بعد كل غسلة.
  5. أخيراً، توضع قطرة بحجم 50 μl من صبغة SR على كل عينة من الغشاء الحيوي. تُترك الصبغة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء. تُغسل العينات ثلاث مرات بماء فائق النقاء ومعقم (بواقع 2.5 ml/well)، مع سحب السائل بعد كل غسلة.
  6. نقل العينات إلى طبق ذو 6 آبار، مع وضع عينة واحدة في كل بئر في 6 ml من الماء فائق النقاء والمعقم لتسهيل عملية المجهر البؤري.

6. التصوير باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر

  1. التقط صوراً لكل مكون (صبغة) ضمن الأغشية الحيوية لمجموعات العلاج والمجموعة الضابطة باستخدام مجهر مسح ليزري متحد البؤر وفقاً للإعدادات الموضحة في الجدول 1. استُخدمت في هذه الدراسة عدسة غمر 63X بفتحة عددية 0.9 ومسافة عمل تبلغ 2.2 mm.
    مخطط صبغ الغشاء الحيوي؛ أطوال موجات الليزر (nm) ونطاقات الانبعاث (nm) للمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)، والأحماض النووية، والبروتينات.
    الجدول 1. إعدادات مجهر المسح الليزري متحد البؤر.

  1. اضبط حجم المسح على 250 μm x 250 μm وبدقة بكسل لا تقل عن 512 x 512 للحصول على صور CLSM بدقة كافية للتحليل الكمي.
  2. استخدم صبغة SY لتحديد النقاط العليا والسفلى لمجموعة صور الغشاء الحيوي الركامية، ثم اضبط خطوة المحور z لتكون كافية للتحليل الكمي (0.6 μm في هذه الدراسة). قبل بدء المسح، قم بتحسين معلمات الصورة والصبغة (أي جهد الـ PMT والإزاحة) باستخدام خيار QLUT. استُخدم جدول بحث لوني لتعيين ألوان زائفة لكل صبغة (الأخضر لـ SY، والأحمر لـ SR، والأزرق لـ AF) لجعل كل مكون من مكونات الغشاء الحيوي أكثر تمييزاً في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.
  3. التقط صور CLSM بتردد 400 Hz باستخدام المسح المتسلسل في وضع "بين الركامات" (between stacks) لتحسين التقاط صور لصبغات متعددة داخل الغشاء الحيوي نفسه.

7. التحليل الهيكلي للغشاء الحيوي

  1. قم بتحليل صور CLSM التي تم جمعها باستخدام برنامج لتحليل صور الأغشية الحيوية. تصف الخطوات التالية استخدام برنامج ISA3D12 لحساب المعاملات الهيكلية لصور الغشاء الحيوي التي تم جمعها.
    1. انسخ ملفات صور CLSM لكل غشاء حيوي إلى مجلد Images، كما هو محدد في دليل البرنامج. تأكد من اتباع اتفاقية تسمية ملفات CLSM التي يتطلبها البرنامج. يسمح البرنامج بتحليل الملفات الموجودة داخل المجلدات الفرعية في وضع الدفعات (batch mode)، مما يسهل تحليل الأغشية الحيوية لمجموعات المعالجة والمجموعة الضابطة في نفس التشغيل.
    2. أدخل أبعاد المحاور x وy وz لصور CLSM في حقول dxy وdz في مربع الحوار الرئيسي. اختر إعدادات العتبة (threshold) ورسم خرائط المسافات (distance mapping)، كما هو موضح في دليل البرنامج (تم استخدام Otsu وQuasi-Euclidean في هذه الدراسة، على التوالي). أدخل اسماً مناسباً لملف النتائج، ثم قم بتشغيل البرنامج. سيتم إنشاء ملف نتائج في مجلد ISA.
    3. قم بمعاينة ملف النتائج للحصول على قيم عشرين معامل هيكلي ثلاثي الأبعاد (3D structural parameters)12 مثل الحجم الحيوي (biovolume) ومتوسط سمك الغشاء الحيوي (التي تم قياسها في هذه الدراسة) والتي تحدد كمياً التوزيع ثلاثي الأبعاد لكل مكون (صبغة) داخل الغشاء الحيوي.

8. تصور بنية الغشاء الحيوي

  1. إنشاء إعادة بناء للمكونات المتراكبة (الصبغات) داخل كل غشاء حيوي رقيق باستخدام برنامج تحليل الصور. تصف الخطوات التالية استخدام برنامج Volocity لإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
    1. إنشاء مكتبة لكل غشاء حيوي رقيق عن طريق نسخ ملفات صور CLSM إلى البرنامج، كما هو موضح في الدليل.
    2. استخدام خيار قائمة 3D Renderer لإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها من صور CLSM لكل غشاء حيوي رقيق (تم استخدام تنسيق HR Opacity في هذه الدراسة).
    3. تدوير الصورة ثلاثية الأبعاد لتوجيه جميع الأغشية الحيوية الرقيقة بطريقة مماثلة فيما يتعلق بمحاور الإحداثيات x وy وz. التقاط لقطة لإعادة بناء الغشاء الحيوي الرقيق الموجه بشكل صحيح، ثم تصدير اللقطة بتنسيق TIFF أو JPEG أو أي تنسيق مناسب آخر.
  2. إجراء تحليل بصري للتوزيع المتزامن لمكونات EPS والبروتينات والأحماض النووية داخل الأغشية الحيوية الرقيقة على الصور المعاد بناؤها.
  3. استخدام معامل ارتباط بيرسون ومعامل تداخل ماندرز لإجراء تحليل التوضع المشترك لمكونات متعددة من الغشاء الحيوي الرقيق (لم يتم قياس التوضع المشترك في هذه الدراسة).

9. التحليل الإحصائي

  1. استخدم تحليلات إحصائية بنماذج مختلطة منفصلة لمقارنة القيم المتوسطة للمؤشرات الهيكلية بين مجموعتي غسول الفم والمجموعة الضابطة (α=0.05). وفي هذه الدراسة، تم استخدام برنامج SAS لإجراء التحليل الإحصائي.

النتائج

تظهر النتائج الممثلة للمعالجات (غسولات الفم) ومجموعة الضبط غير المعالجة في الجدول 2، والشكلين 1 و2. يعرض الجدول 2 قيم المتوسط والانحراف المعياري لمعاملات بنية الغشاء الحيوي الرقيق: الحجم الحيوي (μm3) ومتوسط سمك الغشاء الحيوي (μm) والتي تم حسابها باستخدام برنامج ISA3D. وقد تم تظليل قيم المتوسط والانحراف المعياري باللون الأحمر لمعاملات بنية الأغشية الحيوية المعالجة بغسول الفم والتي اختلفت بشكل ملحوظ عن تلك الموجودة في مجموعة الضبط (p<0.05). وأظهرت نتائج التحليلات الإحصائية للنماذج المختلطة أن غسول الفم BIO أنتج بنيات غشاء حيوي تختلف بشكل ملحوظ عن مجموعة الضبط (p<0.05) في كلا المركبين الراتنجيين، بينما لم ينتج غسول الفم LTO فروقاً ذات دلالة إحصائية (p>0.05) في أي من المركبين الراتنجيين. وتظهر النتائج بوضوح أن المكونات الخلوية وخارج الخلوية للغشاء الحيوي المتبقية بعد المعالجة بنوعي غسول الفم كانت مختلفة. كما تجدر الإشارة إلى أن الأغشية الحيوية لبكتيريا S. mutans التي نمت على الركيزتين (PF وTP) اختلفت في بنيتها ثلاثية الأبعاد على الرغم من نموها في ظروف مماثلة وصقل كلتا الركيزتين بمواد كاشطة مماثلة.

يمكن تصور التوزيع المتزامن للمواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) والبروتينات والأحماض النووية داخل الغشاء الحيوي الرقيق من خلال عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج Volocity. يوضح الشكل 1 والشكل 2 نماذج ممثلة لإعادة بناء الأغشية الحيوية للمجموعة الضابطة التي نمت على مركبات الراتنج PF وTP، على التوالي. ويمثل اللون الأزرق مادة EPS داخل الأغشية الحيوية لبكتيريا S. mutans، بينما يمثل اللون الأخضر الأحماض النووية، ويوضح اللون الأحمر البروتينات. وقد تكون المساحات البينية مشغولة بالماء أو مكونات أخرى من الغشاء الحيوي غير المصبوغة بصبغات فلورية.

مخطط تشتت ثلاثي الأبعاد، تصور ديناميكي للبيانات، رسم بياني، أداة بحث تفاعلية، عرض تحليلي.
الشكل 1. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد نموذجية للغشاء الحيوي لبكتيريا S. mutans النامية على مركب ريزين PF في المجموعة الضابطة (التي لم تُعالج بغسول الفم). يتيح التراكب المتزامن للأصباغ الثلاثة داخل غشاء حيوي واحد التصور المتزامن لمكونات المواد البوليمرية خارج الخلية EPS (الصبغة الزرقاء)، والحمض النووي (الصبغة الخضراء)، والبروتين (الصبغة الحمراء) داخل الأغشية الحيوية لبكتيريا S. mutans. (1 Unit = 24 μm). انقر هنا لعرض الشكل بحجم أكبر.

تصوير ثلاثي الأبعاد للبنية الخلوية، مجهر فلوري، تحليل البيانات المكانية، رسم بياني علمي.
الشكل 2. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد نموذجية للغشاء الحيوي لبكتيريا S. mutans النامية على مركب ريزين TP في المجموعة الضابطة (التي لم تُعالج بغسول الفم). يتيح التراكب المتزامن للأصباغ الثلاثة داخل غشاء حيوي واحد التصوير المتزامن لمكونات المواد البوليمرية خارج الخلية EPS (الصبغة الزرقاء)، والحمض النووي (الصبغة الخضراء)، والبروتين (الصبغة الحمراء) داخل الأغشية الحيوية لبكتيريا S. mutans. (1 Unit = 24 μm). انقر هنا لعرض الشكل بحجم أكبر.

مركب الراتنجالنقطة 4TPH3
غسول الفمالمكونBV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBFالأحماض النووية279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
البروتينات298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total Careالأحماض النووية355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
البروتينات348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
المجموعة الضابطة (غير المعالجة)الأحماض النووية388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
البروتينات517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

الجدول 2. قيم المتوسط والانحراف المعياري للحجم الحيوي (BV) ومتوسط سمك الغشاء الحيوي (MT) للأغشية الحيوية المعالجة بـ BIO أو LTO، أو التي تركت دون علاج (المجموعة الضابطة). تم تظليل قيم المتوسط والانحراف المعياري باللون الأحمر للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المعالجة بغسول الفم والتي اختلفت بشكل ملحوظ عن تلك الموجودة في أغشية المجموعة الضابطة (p<0.05).

المناقشة

يجب إجراء الحصول على صور CLSM بالطريقة والشكل اللازمين لقياس الأغشية الحيوية وتحليل التحديد المشترك ، بحيث يكون توزيع شدة الإشارة في كل صورة تمثيلا موثوقا به لتوزيع كل فلوروكروم في مكدس الأغشية الحيوية. يجب تمييز شدة الإشارة عن الضوضاء والخلفية10،11 ، وعدم التأثر بالتألق الذاتي من الركيزة ، ولها الحد الأدنى من النزيف بسبب التداخل الطيفي بين الفلوروكرومات المستخدمة11. الضوضاء هي قيد لا مفر منه للفحص المجهريالفلوري 11 ، ويمكن أن تكون جودة الصورة محدودة في بعض الأحيان لأسباب فنية أو لوجستية. يعد تحديد الفلوروكرومات ذات الحد الأدنى من التداخل الطيفي أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذه الطريقة ، ولكنه قد يكون معقدا. علاوة على ذلك ، فإن القياس الكمي للفلوروكرومات المتعددة يشكل مشكلة متعددة العوامل. لذلك ، ليس من المستغرب أن عددا قليلا جدا من التحقيقات نجح في تحديد التوزيع المتزامن لأكثر من مكونين داخل هياكل الأغشية الحيوية.

كان الهدف من هذه الدراسة هو الإبلاغ عن منهجية تتكون من خطوات متميزة ولكنها مترابطة للقياس الكمي والمقارنة بين التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية داخل الأغشية الحيوية. يسمح فحص نمو الأغشية الحيوية الموصوف بنمو الأغشية الحيوية على الركائز ذات الصلة وينتج هياكل أغشية حيوية قابلة للتكرار ، كما هو موضح في النتائج الواردة في الجدول 1. يؤدي الجمع بين التلوين المتزامن الجديد ل EPS والبروتينات ومكونات الحمض النووي مع قياس المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد إلى توزيعات قابلة للقياس الكمي للمكونات داخل الأغشية الحيوية. يمكن التحليل البصري النوعي للتوزيع المتزامن ل EPS والبروتينات والحمض النووي داخل الأغشية الحيوية من خلال إعادة بناء البقع المتراكبة داخل كل غشاء حيوي. يحتوي برنامج ISA3D12 على العديد من المعلمات الهيكلية الفريدة مثل البعد الكسوري والتجانس ومعامل خشونة الأغشية الحيوية بالإضافة إلى المعلمات المقاسة تقليديا مثل المسامية وسمك الأغشية الحيوية لتعزيز القياس الكمي للهياكل ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية. يسهل التحليل الإحصائي للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المقارنات ذات الصلة للأغشية الحيوية في ظل ظروف تجريبية محددة مثل الفعالية المضادة للبكتيريا / المضادة للحشف (على سبيل المثال بعد العلاج بغسول الفم) أو بمرور الوقت (التأثيرات الزمنية).

قامت هذه المنهجية بتحديد ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات رئيسية داخل S. mutans الأغشية الحيوية التي نمت على الركائز ذات الصلة ، وبالتالي التغلب على تحديين للتقييم المتزامن لمكونات الأغشية الحيوية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد فعالية العلاجات المضادة للبكتيريا أو التدابير المضادة للحشف ضد مكونات الأغشية الحيوية المتعددة ، كما هو موضح باستخدام غسول الفم في هذه الدراسة. علاوة على ذلك ، يمكن استبدال غالبية البروتوكولات الموضحة أعلاه ببروتوكولات لتصنيع الركائز ذات الصلة ومقايسات نمو الأغشية الحيوية للكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة. لذلك ، فإن هذه الطريقة لها تطبيق واسع لأنها تسهل مقارنة الهياكل / الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للأغشية الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي في مجموعة متنوعة من التخصصات بما في ذلك العلوم الطبية وطب الأسنان والجيولوجيا والبحرية.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. الإنتاج والوصول المجاني إلى هذه المقالة برعاية Leica Microsystems.

شكر وتقدير

تم توفير تمويل هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR 1R15DE019566-01A1. د. تم الاعتراف ب Jim Henthorn (مختبر OUHSC Flow and Image Cytometry Parkatory) لتقديم المساعدة الفنية في الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر. تم تقدير الدكتور فرناندو إستيبان فلوريز (قسم مواد طب الأسنان) لتقديم المساعدة الفنية أثناء تصوير هذا الفيديو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
باكتو أجاربيكتون وديكنسون وشركاه214010
باكتو تود هيويت مرقبيكتون وديكنسون وشركاه249240
مستخلص الخميرة ، حبيباتEMD Millipore1.03753.0500
باكتو تريبتونبيكتون وديكنسون وشركاه211705
OmniPur السكروزEMD Millipore8510
كلوريد البوتاسيوم ، كاشف ACS ، 99.0-100.5٪سيجما ألدريتشP3911-500G
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدة ، & ge ؛ 99.0٪ ، كاشف ACSسيجما ألدريتشP0662-500G
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS9888-500G
فوسفات الصوديوم ، أحادي الأساس ، أحادي الهيدراتEMD MilliporeSX0710-1
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان ، 99.8 + ٪ ، كاشف ACSسيجما ألدريتش252859-500G
كونكانافالين أ ، أليكسا فلور 647 مترافقإنفيتروجينC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 أو S6653
Biot & egrave ؛ ne PBF شطف الفمGlaxoSmithKlineN / A
Listerine Total CareMcNeil-PPC، Inc.غير متاح

المراجع

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Streptococcus Mutans
الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.