يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ارتفاع القرار جبل بأكمله

22.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50644

⸱

أكتوبر 19, 2013

 , 
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

أصبح الزرد، والأسماك الاستوائية الصغيرة، نموذجا محببا لدراسة وظيفة الجين خلال التنمية الفقاريات والمرض. التعبير الزماني والمكاني من الجينات المستهدفة يمكن تحديده من خلال في الموقع التهجين. لدينا تحسين بروتوكول يسمح للكشف عن انخفاض النصوص وفيرة مع إشارة الخلفية غير محددة منخفضة.

الملخص

تركز هذه المقالة على جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) من الأجنة الزرد في. التكنولوجيا WISH يسهل تقييم التعبير الجيني سواء من حيث توزيع الأنسجة والمرحلة التنموية. وصفت البروتوكولات لاستخدام رغبة الأجنة الزرد باستخدام العقاقير تحقيقات RNA المسمى مع digoxigenin. يتم إنشاؤها من خلال دمج تحقيقات النيوكليوتيدات digoxigenin المرتبطة من خلال نسخ في المختبر من القوالب الجينات التي تم المستنسخة والخطي. تتم إزالة chorions من الأجنة التي تحصد في مراحل نمو محددة قبل الحضانة مع تحقيقات محددة. بعد إجراء الغسيل لإزالة الزائدة التحقيق، يتم تحضين الأجنة مع الأجسام المضادة لمكافحة digoxigenin مترافق مع الفوسفاتيز القلوية. من خلال توظيف ركيزة مولد اللون لالفوسفاتيز القلوية، يمكن تقييم التعبير الجيني محددة. ويمكن تبعا لمستوى التعبير الجيني يتم الانتهاء من الإجراء بأكمله في غضون 2-3 أيام.

المقدمة

برزت الزرد (دانيو rerio) كنموذج حيوان قوية لدراسة تطوير الفقاريات، والمرض، والسلوك، والمخدرات في فحص 1-3. ويمكن الحصول على الأجنة الزرد بأعداد كبيرة من معبر واحد. الإخصاب والتنمية يحدث الرحم السابقين والأجنة واضحة بصريا تتطور بسرعة. تحدث أحداث التنموية الهامة خلال أول 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). وهذا يشمل ظهور الجهاز براعم وبدء تمايز خلوي. ويمكن تحقيق ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن البروتينات من خلال Microinjection من الأجنة مع العقاقير morpholino (MO) [أليغنوكليوتيد أو مرنا على التوالي في مرحلة خلية واحدة أو اثنتين (0.75 HPF).

رغبة الأجنة الزرد يسهل الدراسة للتعبير المكانية والزمانية لجينات معينة من الفائدة. تطبيق تقنية WISH بعد Microinjection من الأجنة مع مرنا أو MO إلى الإفراط في EXPRوفاق سطيف أو مستويات بروتين معين ضربة قاضية يكشف تنظيم الفرق من الجينات الأخرى.

التغيرات في أنماط التعبير الجيني يمكن ربط مع التغيرات المظهرية وتكشف عن وظيفة الجينات المستهدفة خلال توالد الأعضاء في وقت مبكر. منذ تحقيقات يمكن إعداد وتخزينها في وقت مبكر، ويمكن تطبيق هذه التقنية ISH للكشف عن أنماط التعبير الجيني لا يقل عن 20 جينات في وقت واحد باستخدام لوحات ستة جيدا والعرف سلال مصنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جبل لالجامع في الموقع التهجين من الأجنة الزرد

1.1 إعداد الأجنة

  1. جمع الأجنة في المراحل التنموية المطلوبة. يرجى الاطلاع كيميل وآخرون. (5) لوصف مرحلة جنينية.
  2. إزالة chorions يدويا باستخدام ملقط (دومون الساعاتيون ملقط رقم 5).
  3. إصلاح الأجنة في محلول 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) تتكون في برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. غسل الأجنة مع برنامج تلفزيوني على الأقل 3X لمدة 5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة.
  5. الأجنة مخزن في الميثانول بنسبة 100٪ (MeOH) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى استخدامها لتطبيقها في المستقبل من التقنيات بما في ذلك جبل لالجامع في الموقع التهجين.
  6. تجميد الأجنة نظموا في النيتروجين السائل لاستخراج الحمض النووي الريبي وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  7. استخراج الحمض النووي الريبي من أجنة نظموا وتوليف [كدنا] PCR التضخيم لوالاستنساخ اللاحقة.

1.2 تخليق الحمض النووي الريبي مجسات Digoxygenin المسمى

  1. PCR التضخيم والاستنساخ الجيني لقالب التحقيق. الإعداد PCR تفاعل مع حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر كما هو مبين في الجدول 1. استخدام المزيد من الحمض النووي الجيني أو أقل [كدنا] في رد فعل PCR كقالب. تشمل 10 دقيقة وقت التمديد في 72 ° C أعقاب الدورة الأخيرة للتأكد من أن المنتجات رد فعل PCR هي طول كامل و 3 'adenylated من أجل تسهيل TOPO الاستنساخ.
الكاشف حجم
الحمض النووي القالب 100 نانوغرام
PCR العازلة (10X) 5 ميكرولتر
dNTPs (10 ملي) 2 ميكرولتر
الاشعال (10 ملي) 1 ميكرومتر كل
إضافة الماء إلى الحجم النهائي من 49.7 ميكرولتر
طق البلمرة (5 وحدة / & #956، L) 0.3 ميكرولتر
حجم رد الفعل 50 ميكرولتر

الجدول 1. رد فعل التضخيم PCR.

  1. تحقق من حجم المنتج PCR باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام. الحجم التقديري للمنتج PCR لتخليق التحقيق، على مقربة من 1 كيلو بايت.
  2. رعاية خاصة لتجنب تلوث نوكلياز من خلال تنفيذ التجربة تحت ظروف معقمة واستخدام المياه مجانا nuclease. في حال لوحظ منتجات متعددة، هلام تنقية المنتج PCR بحجم مناسب قبل الشروع في استنساخ باستخدام TOPO TA كيت الاستنساخ. تحسين رد فعل PCR للقضاء على مظهر من تلطيخ وشرائح متعددة.
  3. أداء رد فعل الاستنساخ TOPO كما هو مبين في الجدول 2. الجمع بين TOPO المتجهات وPCR المنتج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
الكاشف الخلايا المختصة كيميائيا الخلايا المختصة الكهربائية جديدة PCR ناتج التفاعل 1-4 ميكرولتر 1-4 ميكرولتر محلول الملح 1 ميكرولتر محلول الملح المخفف 1 ميكرولتر ماء ما يصل إلى إجمالي حجم 5 ميكرولتر ما يصل إلى إجمالي حجم 5 ميكرولتر TOPO النواقل 1 ميكرولتر 1 ميكرولتر الحجم النهائي 6 ميكرولتر 6 ميكرولتر

الجدول 2. رد فعل الاستنساخ TOPO.

  1. دمج / تقديم المنتج الاستنساخ TOPO في واحدة الخلايا المختصة النار. Tوتسمى عملية تحوله.
  2. احتضان الخلايا تحولت عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل في 260 دورة في الدقيقة لضمان التعبير عن الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. لوحة مزيج التحول (50-100 ميكرولتر) على prewarmed لوريا Bertani (LB) لوحات أجار التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين وX-غال. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  3. تحديد وجود للإدراج على أساس مظهر أبيض أو ضوء المستعمرات الزرقاء. ناقلات TOPO يحتوي lacz الجين الذي يشفر β-غالاكتوزيداز. في وجود X-غال، وإنتاج β-غالاكتوزيداز يشكل اللون الأزرق. ويتم إنتاج DNA و ligated في البلازميد يعطل تشكيل β-غالاكتوزيداز والأبيض المستعمرات وظيفية. المستعمرات الأبيض أو الأزرق الفاتح المستعمرات تأكيد وجود إدراج.
  4. اختيار المستعمرات أبيض من لوحة آغار باستخدام نصائح ماصة معقمة ووضعها في أنبوب معقم 10 مل تحتوي على 4 مل من وسائل الاعلام LB والثقافة في 37 درجة مئوية في incuba الهزتور بين عشية وضحاها في 200 دورة في الدقيقة.
  5. تنقية DNA البلازميد باستخدام عدة DNA البلازميد وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
  6. [كدنا] خطي التالية تنقية البلازميد بواسطة هضم 5 ميكروغرام من [كدنا] لكل التحقيق مع انزيم تقييد المناسبة التي لها موقع فريد من نوعه يقع 3 '(لتحقيقات معنى) أو 5' (لتحقيقات العقاقير) إلى إدراج.
  7. تنقية DNA خطي باستخدام الفينول / كلوروفورم طريقة الاستخراج. إضافة حجم مساو من الفينول تدور / كلوروفورم، قمة الرأس بقوة لمدة 30 ثانية، لمدة 3 دقائق في 13،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العليا في أنبوب نظيف وإضافة حجم مساو من كلوروفورم. تدور لمدة 3 دقائق في 13،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العليا في أنبوب نظيفة. إضافة 10٪ خلات الصوديوم (3 M) وحجم 2.5x و من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الحمض النووي يعجل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة ليلة وضحاها. تدور لمدة 15 دقيقة عند 13،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة الإيثانول وغسل بيليه مع 75٪ من الإيثانول. بروتوكول يمكن وقفها، ويمكن ST الحمض النوويored في -20 درجة مئوية، واستؤنفت في اليوم التالي. تدور لمدة 10 دقيقة في 10،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف وتجفيف بيليه لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Resuspend وبيليه في 10 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC واحتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
  8. تقييم نقاء بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام باستخدام 1 ميكرولتر من الحمض النووي على 1٪ الاغاروز هلام والجري لحوالي 30 دقيقة.
  9. إعداد رد فعل التوسيم الحمض النووي الريبي. باستخدام ريبونوكلياز قنينة رد فعل حر، إضافة 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي القالب لتنقية العقيمة، ريبونوكلياز خالية، DEPC المعاملة، الماء المقطر مزدوجة إلى وحدة تخزين من 13 ميكرولتر. البرد القارورة رد فعل على الجليد وإضافة الكواشف التالية (انظر الجدول 3):
الكاشف حجم
NTP وضع العلامات خليط (10X) 2 ميكرولتر
برتقالي النسخإيه (10X) 2 ميكرولتر
حامي ريبونوكلياز المانع 1 ميكرولتر
RNA البلمرة أو SP6
الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 2 ميكرولتر
الحجم النهائي 20 ميكرولتر

الجدول 3. رد فعل التوسيم الحمض النووي الريبي.

  1. خلط الكاشف بلطف ثم تتجمع في قاع بواسطة الطرد المركزي وجيزة في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة واحتضان خليط التفاعل لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. إزالة قالب الحمض النووي عن طريق إضافة 2 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية الدناز أولا احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ووقف رد فعل عن طريق إضافة 2 ميكرولتر 0.2 M EDTA (8.0 درجة الحموضة).
  3. ترسيب المنتجات رد فعل من خلال إضافة 2.5 ميكرولتر 4 م LiCl و 75 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج الحل والحفاظ في -20 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة سR تخزينها في -20 درجة مئوية خلال الليل واستؤنفت البروتوكول في اليوم التالي.
  4. الطرد المركزي تعليق لمدة 30 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية، ثم يغسل بيليه مع 500 ميكرولتر الإيثانول 70٪ تخزينها في -20 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة أخرى، وجفاف لمدة 2 دقيقة، و resuspend في 50 ميكرولتر واحتضان في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. التحقق من جودة وسلامة التحقيق عن طريق تشغيل مل 1-2 على agarose هلام 1٪ لمدة 30 دقيقة. هذا ما يؤكده وجود منتج واحد على التوالي في حجم المتوقع على هلام.
  6. قياس تركيز لجنة التحقيق من خلال قياس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. العائد من هذا التفاعل هو حوالي 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (100-200 نانوغرام / ميكرولتر).

1.3 جبل لالجامع في الموقع التهجين

  1. DAY 1
    1. الإماهة
      1. إعداد سلال باستخدام شبكة من النايلون (أقل من 1 ملم حجم المسام) وأنابيب إيبندورف. بناء سلال من قبل cuttinز إيبندورف أنابيب (1.5 مل) لإزالة نهايات المخروطية. لتحديد سلال الفردية استخدام أنابيب ملونة مختلفة وإزالة الجزء العلوي الحافات من نصفهم.
      2. قطع قطعة صغيرة من شبكة من النايلون لتغطية نهايات قطع من أنابيب إيبندورف. عصا نهايات قطع من الأنابيب إلى شبكة من النايلون عن طريق تسخين لهم على صفيحة ساخنة الكهربائية (مجموعة بين متوسطة إلى عالية) في غطاء الدخان. مرة واحدة تبرد إزالة شبكة من النايلون الزائدة من سلال وتخزينها في الميثانول بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة.
      3. تحضير التخفيفات المتتالية من الميثانول في برنامج تلفزيوني (75٪ [المجلد / المجلد [الميثانول، و 50٪ [المجلد / المجلد] الميثانول و 25٪ [المجلد / المجلد] الميثانول) باستخدام الآبار الثلاثة الأولى من لوحات ستة جيدا تليها 100٪ PBST (الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.1٪ توين-20) في الآبار الثلاث المقبلة.
      4. الأجنة تخضع لفي الموقع إجراء التهجين باستخدام مخصص سلال مصنوعة كما هو مبين في Figurea 1A وب. استخدام الحلول ريبونوكلياز خالية حتى hybridizaالخطوة نشوئها في 6 لوحات جيدة (4 مل / جيد). ولتحقيق ذلك، تضع ما يصل إلى 6 سلال في أول بئر. المكان سلة مع حافة أولا تليها سلال دون الحافات في ألوان مختلفة مرتبة على التوالي. باستخدام هذا الترتيب ما يصل إلى 6 أنماط التعبير الجيني يمكن تحديد في وقت واحد.
      5. وضع الأجنة المجففة من مرحلة التطوير إلى نفس سلة (انظر الشكل 1).
      6. ترطيب الأجنة عن طريق تحريك سلال من بئر واحد في لوحة ستة جيدا في اليوم التالي (5 دقائق لكل خطوة). استخدام ستة آبار مليئة العازلة المناسبة. تتعرض الأجنة لتخفيف كل مرة. في هذه الطريقة يتم غسل الأجنة 6X، 5 دقيقة / غسيل. ويتحقق الإماهة من الأجنة المجففة عن طريق استبدال الميثانول مع برنامج تلفزيوني ومن ثم عن طريق غسل 3X مع 100٪ PBST.
    2. Permeabilization هضم الأجنة ممهى مع بروتين K (10 ميكروغرام / مل) في درجة حرارة الغرفة لجعلها قابلة للاختراق كما هو مبين في الجدول رقم 4 .
      المرحلة الجنينية (ساعة بعد الإخصاب) فترة الهضم (بروتين K)
      تصل إلى 6 15 ثانية
      6-12 30 ثانية
      12-18 3 دقائق
      24 12-15 دقيقة
      48 25-30 دقيقة
      72 40 دقيقة
      96-120 50 دقيقة

      الجدول 4. رد فعل Permeabilization.

    3. Postfixation وPBST الغسلات
      1. إصلاح الأجنة التي يحتضنها في بارافورمالدهيد 4٪ (وزن / المجلد) في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 20 دقيقة.
      2. إزالة بارافورمالدهيد المتبقية عن طريق غسل الأجنة 3X، 5 دقيقة / غسيل، في PBST 1X.
    4. أستلة تحضير خليط أستلة (125 ترايثولامين ميكرولتر و 27 ميكرولتر أنهيدريد الخليك في 10 مل ده 2 O) والأجنة احتضان مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما. للحد من نشاط إنزيم الفوسفاتيز الذاتية، وإعداد خليط أستلة جديدة عند الاقتضاء. لإزالة الزائدة كاشف، وغسل الأجنة مرتين في PBST (10 دقيقة / غسيل)
    5. Prehybridization Prehybridize الأجنة عن طريق نقل الأجنة من سلال إلى 1.5 مل العقيمة أنابيب إيبندورف واحتضان مع 200 ميكرولتر مزيج التهجين لمدة 2-4 ساعة في 70 ° C حمام الماء.
    6. Preadsorption من الأجسام المضادة إزالة حوالي 50 أجنة من السلال ونقلها إلى 1.5 مل العقيمة أنابيب إيبندورف. احتضان مع anti-DIG-AP (1:500) الأجسام المضادة باستخدام عرقلة العازلة (1X PBST، 2٪ مصل العجل [المجلد / المجلد]، 2 ملغ / مل ألبومين المصل البقري [BSA]) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-4 ساعة، ومن ثم تخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل. إزالة من الحاضنة في الصباح علىد تسمح الأجنة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
    7. التهجين إضافة 100-200 نانوغرام من التحقيق الى الأجنة prehybridized واحتضان بين عشية وضحاها في 70 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. DAY 2
    1. SSC (سيترات الصوديوم المالحة) الغسلات
      1. مكان أنابيب 50 مل من الخليط التهجين (HM)، 2X SSC و0.2x SSC في كوب مع الماء في 70 درجة مئوية حمام المياه وprewarm لهم لمدة 20 دقيقة على الأقل. إزالة خليط التفاعل التهجين التي تحتوي على لجنة التحقيق، إضافة 1 مل من خليط التهجين prewarmed للأنابيب واحتضان لمدة 15 دقيقة في 70 درجة مئوية. ملء لوحات ستة جيدا مع التخفيفات مختلفة من HM prewarmed في 2X SSC عن طريق استبدال 100٪ خلال HM 50٪ إلى 25٪ HM لإزالة الكواشف الزائدة.
      2. في الوقت الذي تنتظر، وملء لوحات ستة جيدا مع 2X SSC لغسيل والاحتفاظ بها في 70 درجة مئوية.
      3. بعد 15 دقيقة مكان الأجنة من أنبوب إلى سلال أبقى في لوحة جيدا ستة مليئة التخفيفS من HM مع 2X SSC وغسل الأجنة المهجنة عن طريق تحريك سلة من بئر واحد إلى التالي (15 دقيقة لكل منهما في 70 ° C حمام الماء). غسل الأجنة 2X، 15 دقيقة / غسيل، في 100٪ 2X SSC في 70 درجة مئوية.
      4. مجموعة حمام مياه أخرى في 65 درجة مئوية. ملء لوحات ستة جيدا مع 0.2x SSC للصرامة ارتفاع يغسل لتجنب التهجين غير محدد من النص مع التحقيق.
      5. بعد أن يتم غسلها مرتين مع الأجنة 2X SSC عند 70 درجة مئوية، واتباع كل منهما 30 دقيقة أخرى يغسل في SSC 0.2x عند 65 درجة مئوية.
    2. PBST الغسلات إعداد لوحات ستة جيدا مع التخفيفات المتتالية من 0.2x SSC في PBST كما يلي: 75٪ (المجلد / المجلد) 0.2x SSC، 50٪ (المجلد / المجلد) 0.2x SSC، 25٪ (المجلد / المجلد) 0.2x SSC، والاثنين الباقيين الآبار مع PBST 100٪. غسل الأجنة المهجنة عن طريق تحريك سلة من بئر واحد إلى التالي (5 دقائق لكل خطوة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الروك).
    3. الأجنة يحضن مسبقا حضن مسبق لمدة 3-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الكحولCKING العازلة (1X PBST، 2٪ مصل العجل [المجلد / المجلد]، 2 ملغ / مل BSA).
    4. الحضانة مع المضادة للDIG جسم الأجنة احتضان بمحلول مكون من الأجسام المضادة-DIG-AP (1:5،000) في عرقلة العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
  3. DAY 3
    1. PBST الغسلات إعداد لوحات ستة جيدا مع 4 مل / جيد PBST. غسل الأجنة المحتضنة عن طريق تحريك سلال في لوحة ستة جيدا تحتوي على PBST 6X لفترات من 15 دقيقة. ويمكن تخزين الأجنة عند 4 ° C واستؤنفت البروتوكول في اليوم التالي.
    2. Prestaining Prestain الأجنة عن طريق الغسيل 2X لمدة 15 دقيقة مع prestaining العازلة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف قبل الحضانة في وجود BCIP (الفوسفات 5 برومو كلورو-4-3-indolyl) وNBT (زرقة النتروتترازوليوم). BCIP وNBT هي ركائز استخدامها لتطوير اللون من النشاط الفوسفاتيز القلوية. منذ مرفقة تحقيقات مع القلوية ال الفوسفاتيزالتنمية (ه) من اللون الأرجواني يدل على التعبير عن الجينات المستهدفة. ويمكن تخزين الأجنة عند 4 ° C واستؤنفت البروتوكول في اليوم التالي.
    3. تلطيخ
      1. احتضان الأجنة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع BCIP وNBT لمدة 30 دقيقة.
      2. رصد رد فعل تلطيخ كل 30 دقيقة باستخدام stereomicroscope. أوقات رد الفعل تختلف من 15 دقيقة 16 ساعة وهذا يتوقف على مستوى التعبير الجيني. أوقات رد الفعل هي أقصر عن الجينات التي أعرب عنها للغاية وتعد لالجينات التي أعرب عنها ضعيفة. سوف تحقيقات بمعنى كشف الإشارات إذا كانت الجينات في المصالح عن العقاقير التكميلية (AS) النصوص.
    4. يتم التوصل إلى وقف رد الفعل بعد شدة تلطيخ المطلوب، توقف عن رد الفعل عن طريق نقل سلال تحتوي على أجنة إلى الآبار التي تحتوي على حل توقف (1X PBS، ودرجة الحموضة 5.5، 1 ملم EDTA، 0.1٪ توين). هذا سوف تجنب مزيد من اللون التنمية. شطف الأجنة لمدة 10 دقيقة 2X على الكرسي الهزاز مع AG لطيف itation في درجة حرارة الغرفة.
    5. Postfixation
      1. احتضان الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ (وزن / المجلد) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
      2. غسل الأجنة (5 دقيقة / غسيل) ثلاث مرات مع PBST من أجل إزالة بارافورمالدهيد المتبقية. تخزين الأجنة ثابتة في حل توقف في الظلام في 4 درجات مئوية.
    6. تصاعد مستمر، والمراقبة، والحصول على صورة
      1. نقل الأجنة إلى لوحة ستة جيدا تحتوي على الجلسرين 100٪ باستخدام الحد الأدنى من حجم ممكن من برنامج تلفزيوني. وضع لوحة ستة جيدا على الكرسي الهزاز وتستنهض الهمم بلطف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      2. وضع الأجنة في 100٪ الجلسرين ومن ثم مراقبة إشارة تحت stereomicroscope.
      3. الحصول على صور وباستثناء ما المشاجرة تنسيق ملف أو أي نوع آخر الذي يسمح لإنتاج صور ذات جودة عالية من خلال استخدام برنامج الصور مثل فوتوشوب (الشكلان 3-6).

"jove_title"> 2. انقر نقرا أنا ن التهجين الموضعي

  1. لتحقيق مزدوج وصفها الطريقة الموصوفة أعلاه من 1.1 - 1.3.1.7 ويستخدم لكنه يشمل حضانة في وقت واحد من كل من digoxygenin وفلوريسئين تحقيقات المسمى خلال التهجين.
  2. اتبع نفس الإجراء لتهجين آخر يغسل وهي SSC ويغسل PBST (الخطوات 1.3.2.1 و1.3.2.2) وحضانات حجب (الخطوة 1.3.2.3). إجراء التفاعلات الأجسام المضادة وتلطيخ كما بالتسلسل المبين أدناه.
  3. احتضان الأجنة مع الأجسام المضادة AP-يقترن المضادة للdigoxigenin (1:5،000) في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
  4. غسل واحتضان مع BCIP-NBT (الخطوات 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
  5. بعد الكشف، وغسل الأجنة مرتين مع PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  6. احتضان الأجنة عند 65 درجة مئوية في PBST مع 1 ملم EDTA لمدة 30 دقيقة لإبطال نشاط الأجسام المضادة لمكافحة digoxigenin.
  7. احتضان الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ تليها الإماهة في 75٪، 50٪، و 25٪ الطرافة الميثانولح PBST والعودة إلى PBST لمدة 1 ساعة.
  8. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها مع AP-يقترن فلوريسئين (1:2،000) في عرقلة العازلة عند 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
  9. غسل الأجنة مع PBST (الخطوة 1.3.3.1) والأجنة قبل وصمة عار 2 مرات لمدة 15 دقيقة مع العازلة قبل تلطيخ (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.2) في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف قبل الحضانة في حضور سريع الأحمر . بروتوكول يمكن وقفها، ويمكن تخزينها الأجنة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف واستؤنفت في اليوم التالي.
  10. حل واحد لوحي الأحمر سريعة في 2 مل من تلطيخ العازلة مباشرة قبل الاستعمال.
  11. بدء رد فعل تلطيخ عن طريق وضع الأجنة في المخزن المؤقت تلطيخ مع كاشف الأحمر سريعة.
  12. وقف رد فعل تلطيخ عندما يتم الوصول إلى كثافة تلطيخ المطلوب. قد يستغرق من بضع ساعات في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم أو يومين ليلة وضحاها عندما تلطيخ في 4 درجات مئوية. وقف رد فعل على الفور ما اذا شدة تلطيخ لا مواصلة تطوير أو يبدأ في إظهار غير محددإيتي عند مقارنة بالكنترول معنى.
  13. اتبع الإجراءات المذكورة أعلاه للحصول على الخطوات المتبقية وهي تثبيت آخر، تصاعد مستمر، والمراقبة والحصول على الصور (steps1.3.3.5 و1.3.3.6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام بروتوكول مع 50 الأجنة في سلة (لكل جين / لكل حالة تجريبية) لا يمكن أن يتحقق هذا النمط من التعبير هذا الجين في تجربة واحدة. تقريبا كل الأجنة تظهر أنماط التعبير مماثلة لجينات معينة. وترد أمثلة ممثل الموقع تلطيخ التهجين في في أرقام 3-6.

فقد تم تصنيع كل من العقل ومكافحة الشعور riboprobes من cDNAs المقابلة لPC5.1، PC5.2 6، 7 SCL/tal-1، غاتا-1 8،9، FLK / ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد قمنا بتطوير أساليب محسنة لتصور الحمض النووي الريبي مع ارتفاع القرار. الإجراءات في الموقع التهجين تتم باستخدام بسيطة سلال مصنوعة خصيصا مع قيعان مسامية (الشكل 1). تتم معالجة الأجنة باستخدام حلول ريبونوكلياز خالية في 6 لوحات جيدا في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف معقمة.

يتم إجراؤها على فصل الأجنة سلال من مختلف أنابيب إيبندورف الملونة. وتستخدم سلال مع أو بدون حافة لسهولة التوجه والتعرف على ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Taq PolymeraseInvitrogen10342053
TopoTA - مروج مزدوج pCRII-TOPOInvitrogenK4650-01
HQ طقم تنقية البلازميد الصغيرInvitrogenK2100-01
AgaroseRoche11 685 660 001
Not1 و HindIII إنزيمات التقييدInvitrogen15441-025 ، 15207-012
الفينول المشبع العازل ،15513039Invitrogenيحفظ عند 4 درجات مئوية. العينين والجلد والجهاز التنفسي مهيج ومشتبه في أنها مادة مسرطنة. يجب توخي الحذر أثناء المناولة.
الكلوروفورمفيشرC607-1مادة مسرطنة سامة ومشتبه بها. العمل تحت غطاء الدخان.
Rocheالخالي من RNase4716728001قم بإعداد كميات صغيرة وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
مزيج وضع العلامات DIG-RNA مع Sp6 و T7 و T3 RNA PolymeraseRoche11277073910
RNase InhibitorRoche10777-019
3.0 M أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.5)فيشر50-751-7355
100٪ إيثانولكحول
ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)سيجما40718-25 ملDEPC هو مهيج للعين والجلد والجهاز التنفسي. تجنب ملامسة الجلد والعينين. استخدم نظارات السلامة والقفازات والقناع.
هيدروكسيد الصوديومفيشرSS255-1
EDTA 0.5 م (درجة الحموضة 8.0)فيشر50-751-7404
أنظمة أحواض السمكلملح المحيطغير متوفر / A
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)فيشرFL-03-0900
بارافورمالدهيد (PFA)سيجماP6148-1KGتحضير وتخزين في -20 درجة ؛ C مثل 40 مل من الحصص للاستخدام لاحقا. PFA سام. استخدم نظارات السلامة والقفازات وقناع الغبار.
فينيلثيوكاربومايد (PTC)سيجماP7629-25GPTC شديد السمية. استخدم نظارات السلامة والقفازات وقناع الغبار.
ميثانولفيشرA947-4
دومون (صانع ساعات) ق) نمط الملقط رقم 5أدوات
الدقيقة مجموعة ثقافة الخلايا ذات الستة آبارSarstedt83.1839
السلال مصنوعة من شبكة النايلون وأنابيب Eppendorfالتحضيرلصنع السلال ، قم بقطع أنابيب Eppendorf (1.5 مل) مع أو بدون حواف لإزالة الطرف المخروطي. قطع شبكة النايلون إلى قطع صغيرة تتوافق مع حجم   النهايات المقطوعة لأنابيب Eppendorf. ضع الأنابيب مع شبكة النايلون التي تغطي الطرف المقطوع على كهربائي   ؛ لوح ساخن حتى يلتصق كل من الأنبوب وشبكة النايلون ببعضهما البعض (يتم تنفيذها في غطاء الدخان). اقطع الشبكة الزائدة من السلال واحفظها في الميثانول بنسبة 100٪ حتى تستخدمها.
بولي أوكسي إيثيلين أوربيتان مونولورات (توين 20)سيجماP1379-500ML
بروتيناز KFermentasEO0491
أنهيدريد الخليكسيجما242845
ثلاثي إيثانول أمينسيجما90279-100 مل
فورماميد ، درجة نقاء عاليةSigmaF9037
AG501-X8 راتنجBio Rad142-6424
حامض الستريك أحادي الهيدراتسيجماC0706-500G
ملح الصوديوم الهيبارينسيجماH3393-25KU
عازلة سترات الصوديوم الملحية (SSC)SigmaS6639
tRNA من نوع الخبازين من نوع الخميرة XSigmaR5636-1ML
NaClFisherS640-500
Tris-HClFisherBP153-1
MgCl 2< / sub>FisherS25403
Levamisole HydrochlorideSigma31742
N ، N-Dimethylformamide
اللامائي (DMF)		Sigma227056مهيج وسام وقابل للاحتراق والماخي المشتبه به. تعامل مع ملابس السلامة المناسبة بما في ذلك القفازات والنظارات الواقية.
5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP)سيجماN6639حماية هذا المحلول من الضوء.
نيتروبلو تيترازوليوم (NBT)سيجما840 واطحماية هذا الحل من الضوء.
الألبومين من مصل الأبقار ، الجزء المنقى V (BSA)SigmaA8806
شظايا الأغنام المضادة للديجوكسيجينين-AP شظايا فابروش1093274910
الجلسرينسيجماG5516-500ML
96 ألواح زراعة الخلايا الجيدةSarstedt83.1835
Tg (mnx1: GFP) ml2 / Tg (hb9: GFP) ml2ZIRCTg (mnx1: GFP) ml2
أنظمة أكواريومالمحيط الفوريةN / A
طقم استنساخ عالي النقاء DNAse I تجاري الفورية محلول العلوم الداخلي

المراجع

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
  3. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
  4. Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
  5. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  6. Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
  7. Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
  8. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
  9. Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
  10. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
  11. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  12. Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
  13. Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
  14. Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
  15. Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
  16. Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
  17. Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
  18. Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156(2005).
  19. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
  20. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

K BCIP NBT
ارتفاع القرار جبل بأكمله
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.