يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

16.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50662

⸱

أغسطس 1, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

إنقاذ arenaviruses المؤتلف من cDNAs المستنسخة، وهو نهج يشار إلى عكس علم الوراثة، ويسمح للباحثين للتحقيق في دور الجينات الفيروسية منتجات محددة، فضلا عن مساهمة من المجالات الخاصة المختلفة والمخلفات، إلى العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الفيروسة الرملية . وعلى نحو مماثل، عكس تقنيات الوراثة في خطوط الخلايا وافقت عليها الهيئة (فيرو) لتطوير لقاح يوفر إمكانيات جديدة لتوليد لقاحات فعالة وآمنة لمكافحة arenaviruses المسببة للأمراض البشرية.

الملخص

تطوير وتنفيذ الفيروسة الرملية عكس علم الوراثة يمثل انفراجة كبيرة في مجال الفيروسة الرملية 4. استخدام نظم minigenome الفيروسة الرملية المستندة إلى الخلايا جنبا إلى جنب مع القدرة على توليد المؤتلف arenaviruses المعدية مع الطفرات محددة سلفا في الجينوم الخاصة بهم سهلت التحقيق في مساهمة المحددات الفيروسية إلى الخطوات المختلفة لدورة حياة الفيروسة الرملية، وكذلك في استضافة فيروس تفاعلات وآليات الفيروسة الرملية المرضية 1، 3، 11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير arenaviruses trisegmented أباح استخدام الجينوم الفيروسة الرملية للتعبير عن الجينات الغريبة إضافية من الفائدة، مما فتح إمكانية المستندة إلى التطبيقات الفيروسة الرملية ناقلات اللقاح 5. وبالمثل، وتطوير دورة واحدة arenaviruses المعدية قادرة على التعبير عن الجينات مراسل يوفر أداة تجريبية جديدة لتحسين سلامة الأبحاث التي تنطوي على HIGHLY المسببة للأمراض arenaviruses الإنسان 16. وقد اعتمد الجيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد حتى الآن على استخدام خطوط الخلايا القوارض 7،19، الأمر الذي يشكل بعض العوائق لتطوير إدارة الغذاء والدواء (FDA) المرخصة لقاح أو ناقلات اللقاح. للتغلب على هذه العقبة، ونحن هنا وصف الجيل كفاءة arenaviruses المؤتلف في خلايا فيرو وافقت عليها الهيئة.

المقدمة

Arenaviruses هي فيروسات يلفها مع bisegmented، السلبية تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم 3 التي تنتمي إلى عائلة الفيروسات الرملية. الجينوم الفيروسة الرملية بترميز أربعة بروتينات بطريقة ambisense من جزأين منفصلين 3 الفيروسية. لشريحة كبيرة (L) بترميز الحمض النووي الريبي بوليميراز RNA التي تعتمد على (L) وحلقة صغيرة (مثيرة للاهتمام حقا جين جديد) البروتين إصبع (Z) التي هي بمثابة القوة الدافعة الرئيسية للفيروس في مهدها. الصغيرة (S) الجزء بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري سطح (GP) (الشكل 1).

عدة أعضاء من عائلة الفيروسات الرملية هي المسؤولة عن الحمى النزفية القاتلة (HF) في البشر 3. من الشواغل مبدأ هي اسا فيروس (LASV) وفيروس جونين (JUNV)، التي من المعروف أنها تسبب ارتفاع معدل الوفيات في المرضى في المستشفى 8، 9. على الرغم من أن هذه الفيروسات تستوطن غرب أفريقيا والأرجنتين الريفية، على التوالي،هناك مخاوف متزايدة من استيراد LASV وJUNV إلى المناطق غير الموبوءة وذلك بسبب زيادة السفر 10. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن لا ترتبط عادة مع مرض شديد في البشر، ويعتبر فيروس التهاب السحايا المشيمي الفيروسة الرملية prototypic الليمفاوي (LCMV) الممرض المهملة كما كانت هناك حالات من العدوى القاتلة في مرضى نقص المناعة 6، 15 ويكون مسؤولا عن العيوب الخلقية والإجهاض العفوي في النساء الحوامل 2، 13. حاليا لا توجد وافقت عليها الهيئة لقاحات ضد arenaviruses والعلاج يقتصر على نيوكليوسيد التناظرية ريبافيرين، والتي لا تكون فعالة إلا جزئيا وغالبا ما ترتبط مع آثار جانبية كبيرة في الولايات المتحدة.

إدخال العكسي القائم على البلازميد الوراثة 4 و الجيل من arenaviruses المؤتلف 7، 19 تقدمت إلى حد كبير مجال البحث الفيروسة الرملية. حاليا، تستخدم خلايا القوارض (مثل BHK-21) لينايرأوجه من arenaviruses المؤتلف ويرجع ذلك إلى أنواع محددة الفئران الحمض النووي الريبي بوليميراز I (POL-I) مروج توجيه النسخ الأولية للS وشرائح L. لكن الإنقاذ الفيروس في BHK-21 الخلايا ليست أسلوب معتمد لتوليد arenaviruses المؤتلف كمرشحين بذور اللقاح المحتملة. نحن هنا توثيق استخدام الإنسان POL-I المروج للانقاذ كفاءة من العالم القديم prototypic (OW) LCMV والعالم الجديد (NW) JUNV صريح # 1 السلالة في خلايا فيرو. باستخدام منهجية مماثلة، ونحن ولدت المؤتلف LCMV trisegmented (r3LCMV) وصريحة # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses التي تحتوي على اثنين من الجينات المشفرة أجنبية إضافية في اثنين من مختلف شرائح S RNA 5. هذا النظام الجديد التالي ليس فقط على بروتوكول استنساخه للغاية وبسيطة ولكن يمكن تنفيذها فورا في توليد arenaviruses المؤتلف لقاح محتمل أو البذور ناقلات اللقاح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الفيروسة الرملية ترنسفكأيشن الإنقاذ

واستند نظام الإنقاذ لدينا على استخدام كل من البلمرة الثاني البروتين البلازميدات التعبير ترميز البروتين النووي (NP) والحمض النووي الريبي التي تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز (L)، والعوامل العابرة المفعول الفيروسية اللازمة لتكرار الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني للجينوم الفيروسة الرملية 7، 19، والبلازميدات قادرة على توجيه التوليف بين الخلايا، عن طريق الحمض النووي الريبي بوليميراز الخلوية I (POL-I) من S و L الأنواع RNA antigenome 7. في دراساتنا نستخدم التعبير pCAGGs البروتين البلازميد، والذي يستخدم الدجاج المروج β-الأكتين وpolyadenylanation (PA) متواليات إشارة، وPOL-I الإنسان البلازميد، والذي يستخدم البلمرة الإنسان أنا المروج ومتواليات المنهي الفئران (الشكل 2) . يتم استنساخ S و شرائح الحمض النووي الريبي L في hpol-I البلازميد في التوجه antigenomic لإتاحة الفرصة لجيل من شرائح الحمض النووي الريبي الجينوم على النسخ بواسطة hpol-I. من أجل إنقاذ البرية تايPE المؤتلف LCMV (rLCMV) وصريحة # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP وL من كل فيروس وشارك في transfected مع بهم POL-I الإنسان منهما S وشرائح الحمض النووي الريبي L (الشكل 3). يتبع جيل المؤتلف LCMV trisegmented (r3LCMV) وصريحة # 1 (r3Candid # 1) بروتوكول مماثلة ولكن تم تقسيم الجزء إلى قسمين S مختلف البلازميدات POL-I S، كل ترميز مميزة الجين المراسل: في واحد، وقراءة مفتوحة NP تم استبدال الإطار (ORF) مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) الجين مراسل (hpol-I S GFP / GP) و، في الآخر، والسلائف بروتين سكري الفيروسي (GPC) يتم استبدال ORF مع Gaussia وسيفيراز (الحلاوة) الجين المراسل (hpol NP-I S / الحلاوة). ويتضح A التمثيل التخطيطي للبروتوكول في الشكل 4. تم تأسيس ترنسفكأيشن التالية وبروتوكول عدوى لمدة 6-لوحات جيدا.

  1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) خليط: إعداد 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام OptiMEM، وتبعاعلى الإنقاذ الفيروس، 10-12 ميكروغرام من LPF2000 (1 ميكروغرام / ميكرولتر) لكل ترنسفكأيشن (الجدول 1). ينصح نسبة 2.5 ميكروغرام لكل LPF2000 ميكروغرام من الحمض النووي. احتضان لمدة 5 - 10 دقيقة في RT. في هذه الأثناء، وإعداد خليط ترنسفكأيشن البلازميد في أنبوب microcentrifuge منفصلة (الخطوة 1.2).
  2. البلازميد الحمض النووي خليط ترنسفكأيشن: إعداد كوكتيل ترنسفكأيشن البلازميد في أنبوب microcentrifuge باستخدام المبالغ الموصى بها لكل الانقاذ فيروس (انظر الجدول 1). جلب الحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر مع OptiMEM.
  3. OptiMEM-LPF2000-DNA البلازميد خليط: إضافة 250 ميكرولتر من OptiMEM-LPF2000 خليط (الخطوة 1.1) في الحمض النووي البلازميد خليط ترنسفكأيشن (الخطوة 1.2). احتضان هذا الخليط لمدة 20 - 30 دقيقة في RT. وفي الوقت نفسه إعداد والعد 1 × 10 6 خلايا فيرو في رد الفعل ترنسفكأيشن. سيتم الخلايا transfected فيرو في التعليق.
  4. إعداد خلايا فيرو: فيرو سليتم تربيتها ليرة سورية في 100 ملم الأطباق. قبل البدء، وجلب 1X PBS، DMEM 10٪ FBS 1٪ وسائل الإعلام PS، وخليط التربسين EDTA-إلى 37 درجة مئوية.
    1. غسل الخلايا، مرتين، مع 5 مل من 1X PBS.
    2. يعرض للتريبسين الخلايا مع 1 مل من التربسين EDTA-والانتظار حتى فصل الخلايا (حوالي 5 دقائق). لطيف التنصت المطلوبة ربما لفصل الخلايا تماما من الأطباق.
    3. بعناية، resuspend الخلايا في 10 مل من DMEM 10٪ FBS 1٪ PS في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق عند 1،000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي.
    5. resuspend الخلايا في 10 مل من DMEM 10٪ FBS 1٪ PS وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وضبط تركيز إلى 1 × 10 6 خلية / مل. ولوحظ أن 0،5-1 × 10 6 خلايا فيرو في ترنسفكأيشن تنتج أفضل النتائج.
  5. مزيج LPF2000/DNA والخلايا: بعد 20 - 30 دقيقة غرفة الحضانة درجة الحرارة (الخطوة 1.3)، إضافة 1 مل من خلايا فيرو (1 × 10 6) (الخطوة 1.4) إلىالخليط البلازميد OptiMEM-LPF2000-DNA واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. البذور LPF2000/DNA-cell المزيج في 6 لوحات جيدا: يضاف خليط الحمض النووي LPF2000-فيرو (الخطوة 1.5) في الآبار من لوحة 6 جيدا. هز بلطف جيدا لوحة (6) والسماح للاحتضان بين عشية وضحاها ترنسفكأيشن في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  7. تغيير المتوسطة ترنسفكأيشن: حوالي 16-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام ترنسفكأيشن، إضافة 2 مل من وسائل الاعلام العدوى واحتضان الخلايا transfected ل48 ساعة إضافية.
  8. مرور الخلية: بعد 48 ساعة من الحضانة في وسائل الإعلام العدوى، وإزالة زراعة الأنسجة طاف (TCS) وتمرير الخلايا transfected في طبق 100 ملم. نادرا ما يحتوي على TCS الفيروسات المعدية وذلك لأن الخلايا transfected تحتاج حضانة إضافية لتوليد جزيئات الفيروس. لمرور الخلية:
    1. غسل الخلايا، مرتين، مع 2 مل من 1X PBS.
    2. يعرض للتريبسين الخلايا ث إيث 0.5 مل من التربسين EDTA-والانتظار حتى فصل الخلايا.
    3. resuspend الخلايا في 1 مل من DMEM 10٪ FBS 1٪ PS في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة، 4 ° C في microcentrifuge.
    5. resuspend بعناية الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام العدوى ونقل الخلايا إلى طبق 100 ملم. إحضار الحجم الكلي في لوحة، مع وسائل الاعلام المعدية، إلى 8 مل، وهو حجم كاف لمنع جفاف الخلايا وكذلك لتركيز الفيروس.
  9. يهز بلطف طبق 100 ملم وتستمر الحضانة من الخلايا فيرو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 72 ساعة.
  10. جمع TCS: بعد 72 ساعة حضانة، وجمع TCS في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2،500 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي. تم العثور على الفيروسة الرملية المعدية في TCS، حتى إزالته من حطام خلية بيليه وتخزين TCS في -80 درجة مئوية.
جنيه "> 2. تأكيد من المؤتلف الإنقاذ الفيروسة الرملية

ويتحقق الكشف عن عملية انقاذ ناجحة من rLCMV وrCandid # 1 عن طريق وحدة التركيز تشكيل (FFU) مقايسة التألق المناعي (IFA). لمن النوع البري الانقاذ فيروس نستخدم الأجسام المضادة المحددة لNP الفيروسية. وr3LCMV وr3Candid # 1 ترميز اثنين من الجينات مراسل (GFP والحلاوة)، مما يتيح الكشف الفيروسية والمعايرة من دون الحاجة إلى الأجسام المضادة بواسطة المجهر مضان (GFP) و / أو التلألؤ (الحلاوة).

  1. تأكيد البرية من نوع المؤتلف الانقاذ الفيروسة الرملية: وقبل يوم المعايرة، وغسل خلايا فيرو مرتين مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين وإعداد لوحات 96-جيدا لتصل إلى 80 - 90٪ التقاء اليوم التالي (4 × 10 4 خلايا / جيد). يهز بلطف لوحات باليد للحصول على توزيع الزي الرسمي للخلايا. ثقافة الخلايا، بين عشية وضحاها، في الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2. التحقق من الخلايا تحت المجهر للتأكد من أحادي الطبقة، قبل المضي قدما في العدوى:
    1. تمييع متسلسل (10 التخفيفات أضعاف) الفيروس التي تحتوي على TCS تعافى من الخلايا transfected في طبق ملم 100 (الخطوة 1.10) في OptiMEM.
    2. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا فيرو المصنف، ويغسل مرتين مع 50 ميكرولتر من 1X PBS، وتصيب الخلايا مع 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف متسلسل (الخطوة 2.1). تصيب الخلايا لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    3. بعد الإصابة، وإزالة فيروس اللقاح، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام عدوى / بئر واحتضان الخلايا لمدة 16-18 ساعة. قد تحدث الفيروسية إعادة العدوى بعد 18 ساعة حضانة، والتي يمكن أن تؤدي إلى الإفراط في تقدير التتر الفيروسية.
    4. في 16-18 ساعة بعد العدوى، وإزالة TCS من كل بئر وإصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد 4٪ المخفف في برنامج تلفزيوني 1X، لمدة 15 دقيقة في RT.
    5. المقبل، وإزالة الحل تثبيت وpermeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 مخففة في برنامج تلفزيوني 1X، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. نضح الحل permeabilization، ثم غسل الخلايا 3 مرات انترنتال 1X PBS.
    7. منع الخلايا مع 2.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني 1X (عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة على RT. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون قد تم حظره الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، واستمر مع الحضانة الضد في اليوم التالي.
    8. وفي الوقت نفسه إعداد الأجسام المضادة الأولية. تمييع الأجسام المضادة الأولية رقم 1 الخاصة LCMV وصريح في عرقلة الحل، ثم الطرد المركزي الضد / عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة عند 3،500 دورة في الدقيقة. وحيدة النسيلة المضادة للLCMV NP الضد استنساخ 1.1.3 (1:30 تمييع) 16 وحيدة النسيلة المضادة للJUNV الأجسام المضادة NP-SA02 BG12 من BEI الموارد (1:500 تمييع) يمكن استخدامها للكشف عن rLCMV وrCandid # 1 ، على التوالي.
    9. بعد 1 ساعة الحضانة، ونضح عرقلة الحل وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    10. في هذا الوقت، وتمييع الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل، ثم الطرد المركزي الضد / عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة عند 3،500 دورة في الدقيقة. بوليوقد استخدم أرنب النسيلي المضادة للماوس مفتش FITC الضد الثانوية للكشف عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الأولية للحصول على صور لاحظ في الشكل 5.
    11. بعد 1 ساعة الحضانة، ونضح الأجسام المضادة الأولية، ويغسل 3 مرات مع 1X PBS، وإضافة الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    12. بعد 30 دقيقة الحضانة، ونضح الضد الثانوية ويغسل 3 مرات مع 1X PBS. الخلايا هي الآن جاهزة لللوحظ باستخدام المجهر مضان لكلا تحدد نجاح الانقاذ الفيروسية والمعايرة عن طريق عد التركيز تشكيل وحدة لكل مل (FFU / مل).
  2. r3LCMV وr3Candid # 1 الإنقاذ الفيروسية: منذ هذه الفيروسات التعبير عن اثنين من الجينات المراسل، من ينقذ يمكن رصدها بواسطة المجهر مضان للكشف عن GFP التعبير أو التعبير الحلاوة في TCS. يمكن تأكيد الإنقاذ أيضا التعبير عن الحلاوة في TCS. لعاير الفيروسات trisegmented، ونحن نتابع الخطوات 2.1 إلى 2.1.4، ولكن الخلايا لا تحتاج إلى به ثابتة لتحديد الانقاذ الفيروسية ناجحة بسبب التعبير GFP. وسيتم تحديد المعايرة للفيروس عن طريق عد FFU / مل. لتحديد نجاح الانقاذ الفيروسية من خلال التعبير الحلاوة والتعبير الحلاوة من TCS يمكن قياسها باستخدام عدة الفحص الحلاوة (Biolux Gaussia luciferase المراسل عدة الفحص، نيو إنجلاند Biolabs). وتحقيقا لهذه الغاية:
    1. الماصة 100 ميكرولتر من TCS في لوحة 96 جيدا أبيض (شقة وحات microtiter أسفل، فيشر العلمية).
    2. إعداد luminometer (LumiCount، باكارد العلوم البيولوجية).
    3. أضف 50-100 ميكرولتر الحلاوة حل الفحص (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) لكل عينة وقياس الحلاوة مراسل التعبير الجيني مع luminometer. كعنصر تحكم السلبية، وقد تم قياس التعبير الحلاوة من TCS من الفيروسات البرية من نوع الخلايا المصابة.

3. مرور Supernatants زراعة الأنسجة

الانقاذ الفيروسية يعتمد على الكفاءة ترنسفكأيشن. وقد ثبت أن خلايا فيرولدينا الكفاءات ترنسفكأيشن أقل من خطوط الخلايا الأخرى 14. إذا التتر الفيروس في TCS منخفضة، تصيب الخلايا فيرو جديدة في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 0.01 (LCMV) أو 0.1 (صريح # 1) لمدة 72 ساعة لتضخيم الفيروس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وسوف يتم تأكيد الانقاذ بنجاح من الفيروسة الرملية البرية من نوع المؤتلف من خلال وجود مستضدات فيروسية باستخدام IFA (الشكل 5). في حالة الفيروسات trisegmented المؤتلف، يمكن تقييم نجاح الانقاذ الفيروسية من خلال مراقبة التعبير GFP بواسطة المجهر مضان (الشكل 6A). وسوف يتم تأكيد نجاح الانقاذ مزيدا من تقييم التعبير الحلاوة (الشكل 6B). وتم الحصول على نتائج ممثل توضح انقاذ ناجحة من الفيروسة الرملية من النوع البري وtrisegmented باستخدام بروتوك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أصبح جيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد نهج المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في العديد من جوانب مختلفة من علم الأحياء الفيروسة الرملية. نحن هنا توثيق تحسن حاسم في النظام الحالي عن طريق إجراء الفيروسة الرملية عمليات الإنقاذ في خلايا فيرو، مما يسمح للجيل محتمل من المرشحين لقاح وافقت عليها الهيئة ضد arenaviruses وناقلات اللقاح ضد الأمراض المعدية الأخرى.

الإجراءات التجريب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ونحن نشكر أعضاء سابقون وحاليون في JCT والمختبرات LM-S من أجل تطوير وتحسين العكس الفيروسة الرملية تقنيات الوراثة والبلازميدات. كما نشكر سنيجانا ديميتروفا حصول على الدعم الفني. تم الحصول على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة إلى JUNV NP (SA02-BG12) من BEI الموارد (المعدية الدفاع البيولوجي والناشئة التهابات بحوث الموارد مستودع). كان مدعوما من قبل BYHC منحة GM068411 عدد من المؤسسات روث L. كيرشتاين جائزة الخدمة الوطنية للبحوث. EO-R هو فولبرايت-Conicyt (BIO 2008) وروتشستر لقاح زمالة (2012) المتلقية. يتم توفير الدعم EO-R الحالي بوضع زمالة ما بعد الدكتوراه للتنوع والتميز الأكاديمي من مكتب للتنمية كلية والتنوع في جامعة روتشستر. ويتم تمويل البحوث في LM-S مختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1 AI077719، R21NS075611-01، R03AI099681-01A1، ومراكز المعدية التميز لأبحاث الأنفلونزا والمراقبة (HHSN266200700008C)، ومركز جامعة روتشستر للنمذجة الدفاع البيولوجي المناعي (HHSN272201000055C).

وأيد البحوث في المختبر من قبل جي سي تي المنح RO1 AI047140، RO1 AI077719، وRO1 AI079665 من المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد والأساليب < / strong>
< قوي> خطوط الخلايا
< / strong> Vero E6 (الخلايا الظهارية الكلى الأخضر الأفريقي) يتم الاحتفاظ بها في 37 & درجة. حاضنة C مع 5٪ CO2< / sub> في DMEM 10٪ FBS 1٪ PS. تتوفر الخلايا من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC ، رقم الكتالوج CRL-1586).

Plasmids
< / strong> جميع البلازميدات ، باستثناء hpol-I L ، يمكن زراعتها عند 37 درجة ؛ ج ، لمدة 16-18 ساعة. نوصي بأن تنمو ثقافات hpol-I L عند 30 درجة. ج لمدة 24 ساعة. يتم تحضير البلازميدات باستخدام مجموعة البلازميد ماكسي (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit ، Omega Bio-tek) باتباع توصيات الشركة المصنعة وتخزينها عند -20 درجة مئوية. يتم تحديد تركيز بلازميد الحمض النووي المنقى عن طريق قياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر ، مع تقدير النقاء باستخدام نسبة 260: 280 نانومتر. تعتبر المستحضرات بنسب 1.8-2.0 260: 280 نانومتر مناسبة لأغراض إنقاذ الفيروسات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تأكيد تركيز البلازميد ونقاوته باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.

الفيروسات
< / strong> يمكن تنفيذ البروتوكول الموصوف لإنقاذ rLCMV (Armstrong 53b) و rCandid # 1 في ظل ظروف مستوى السلامة الحيوية (BSL) 2. يجب تعقيم المواد الملوثة ، بما في ذلك TCS والخلايا قبل التخلص منها. قد يتطلب إنقاذ فيروسات الساحة الأخرى مرافق BSL أعلى ، لذا يجب اتباع تدابير السلامة / الأمن المناسبة.

وسائط وحلول زراعة الأنسجة
< / strong >DMEM 10٪ FBS 1٪ PS: < / قوي> 445 مل وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين (PS). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيتم استخدام هذه الوسائط لصيانة خلايا Vero.

الوسائط المعدية: < / قوي> خليط 2 إلى 1 من OptiMEM و DMEM 10٪ FBS 1٪ PS. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيتم استخدام هذه الوسائط أثناء العدوى الفيروسية.

10X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): < / قوي > 80 جم من كلوريد الصوديوم ، 2 جم من KCl ، 11.5 جم من Na 2< / sub>HPO4< / sub>.7H2< / sub>O ، 2 غرام من KH2PO4. أضف ddH2< / sub>O حتى 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
1X PBS: < / قوي> تمييع 10X PBS 1:10 مع ddH2< / sub>O. تعقيم بالأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
2.5٪ BSA< / strong>: 2.5 جم من BSA في 97.5 مل من 1X PBS. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يستخدم هذا كحل حظر ل IFA.

المراجع

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.