Method Article

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

DOI:

10.3791/50680

⸱

December 9th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content"> نوضح استخدام الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM) لتصوير أنواع متعددة من الجزيئات المصنفة بالفلورسنت داخل الخلايا في وقت واحد. تنتج التقنيات الموصوفة توطين الآلاف إلى مئات الآلاف من البروتينات الفردية المسماة بالفلورسنت ، بدقة عشرات النانومتر داخل الخلايا المفردة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تطبيق الفحص المجهري فائق الدقة القائم على التوطين للحصول على خريطة مكانية (صورة) لتوزيع الجزيئات المفردة الفردية المسماة بالفلورسنت داخل عينة بدقة مكانية تبلغ عشرات النانومترات. باستخدام بروتينات الفلورسنت القابلة للتنشيط الضوئي (PAFP) أو القابلة للتحويل الضوئي (PSFP) المدمجة في البروتينات ذات الأهمية ، أو الأصباغ العضوية المقترنة بالأجسام المضادة أو الجزيئات الأخرى ذات الأهمية ، يمكن للفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM) تصوير أنواع متعددة من الجزيئات داخل الخلايا المفردة في وقت واحد. باستخدام النهج التالي ، يتم تصوير مجموعات من أعداد كبيرة (من الآلاف إلى مئات الآلاف) من الجزيئات الفردية في خلايا مفردة وتوطينها بدقة ~ 10-30 نانومتر. يمكن تطبيق البيانات التي تم الحصول عليها لفهم التوزيعات المكانية النانوية لأنواع البروتين المتعددة داخل الخلية. تتمثل إحدى الميزات الأساسية لهذه التقنية في الزيادة الهائلة في الدقة المكانية: في حين أن الحيود يحد من الدقة إلى ~ 200-250 نانومتر في الفحص المجهري الضوئي التقليدي ، يمكن ل FPALM تصوير مقاييس الطول أكثر من ترتيب من حيث الحجم أصغر. نظرا لأن العديد من الفرضيات البيولوجية تتعلق بالعلاقات المكانية بين الجزيئات الحيوية المختلفة ، فإن الدقة المحسنة ل FARM يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأسئلة التنظيم الخلوي التي لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا بواسطة المجهر الفلوري التقليدي. بالإضافة إلى تفصيل طرق إعداد العينات والحصول عليها ، نصف هنا الإعداد البصري ل FPALM. أحد الاعتبارات الإضافية للباحثين الراغبين في إجراء فحص مجهري فائق الدقة هو التكلفة: الإعدادات الداخلية أرخص بكثير من معظم آلات التصوير المتاحة تجاريا. تشمل قيود هذه التقنية الحاجة إلى تحسين وضع العلامات على الجزيئات ذات الأهمية داخل عينات الخلايا ، والحاجة إلى برامج ما بعد المعالجة لتصور النتائج. نصف هنا استخدام تعبير PAFP و PSFP لتصوير نوعين من البروتين في الخلايا الثابتة. كما تم وصف امتداد هذه التقنية إلى الخلايا الحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content"> بينما توجد الهياكل الخلوية على مجموعة واسعة من المقاييس المكانية ، فإن التصوير الفلوري للتنظيم الخلوي على مقاييس طول أصغر من ~ 250 نانومتر مقيد في الفحص المجهري التقليدي بسبب القيد المادي لحد الحيود. تم التغلب على هذا الحد مع ظهور الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM1) والتقنيات المماثلة2،3 ، والتي يمكنها توطين أعداد كبيرة من الجزيئات الفردية بدقة ~ 10 نانومتر ، لتوليد صور بدقة بضع عشرات من النانومتر. يعتمد FPALM على استخدام التحكم البصري لتنشيط وتعطيل مجموعات فرعية من الجزيئات (للحصول على وصف كامل ل FARM ، وإرشادات حول كيفية تنفيذ نظام التصوير هذا ، انظر Gould et al.4). تسمح هذه التقنية بتعيين التوزيعات المكانية لمجموعات كاملة من الجزيئات المفردة ، وبالتالي توضيح الهياكل البيولوجية عبر مقاييس الطول التي تمتد من عشرات النانومتر إلى عشرات الميكرون. تم الآن تكييف الفحص المجهري فائق الدقة القائم على التوطين (يشار إليه هنا باسم الفحص المجهري للتوطين) لمعالجة مجموعة من الأسئلة البيولوجية ، مع التطورات التكنولوجية التي تسمح ، على سبيل المثال ، بتصوير التوجهات الجزيئية الفردية باستخدام الاستقطاب FPALM ، أو P-FPALM5 ، التصوير الفلوري للجزيئات المفردة في ثلاثة أبعاد باستخدام Biplane FPALM6 أو تقنيات أخرى7-9، والتصوير الفلوري فائق الدقة للجزيئات المفردة في الخلاياالحية 10-12. كما تم تطبيق الفحص المجهري للتوطين على تصوير أنواع متعددة في الخلايا الثابتة13-16. في الآونة الأخيرة ، تم تصوير ثلاثة أنواع من البروتين في وقت واحد باستخدام FPALM في كل من الخلايا الثابتة والحية17. يمكن للفحص المجهري للتوطين تصوير عينات مصنفة بعدة طرق: تشمل الأمثلة البروتينات المعبر عنها بعلامات اندماج PAFP أو PSFP أو الأجسام المضادة أو الجزيئات المصنفة بأصباغ عضوية محبوسة أو أصباغ عضوية تقليدية. في حين أن استخدام الأصباغ الفلورية التقليدية يسمح بوضع العلامات على البروتينات في حالة عدم وجود علامة بروتين اندماج ، فإن الشروط المطلوبة عموما لاستخدام الأصباغ العضوية غير المحبوسة في التصوير فائق الدقة تتطلب غمر العينات في تقليل المخازنالمؤقتة 2. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب التوصيل داخل الخلايا لاقتران صبغة الأجسام المضادة عادة تثبيت الخلايا ونفاذية أغشيتها ، أو يتطلب أن تكون الخلايا الحية قابلة للاختراق من خلال التثقيب الكهربائي أو بعض الوسائل الأخرى. تحد متطلبات تقليل ظروف المخزن المؤقت ونفاذية الغشاء من مدى ملاءمة الأصباغ العضوية لتصوير الخلايا الحية ، على الرغم من أن التطورات الأخيرة سمحت بالاستخدام الفعال ل HaloTags و FPALM لتصوير هياكلالأغشية 18.

FPALM كانت أول تقنية مجهرية للتوطين يتم تطبيقها على الخلايا الحية10. في الخلايا الحية ، بالإضافة إلى توفير خريطة مكانية تعتمد على الوقت لمواقع الجزيئات المصنفة ، يمكن ل FARM تتبع الجزيئات المفردة عبر إطارات متعددة ، والمسارات الجزيئية المحددة على مدى فترات زمنية من المللي ثانية19. وبالتالي ، يوفر FPALM الوصول إلى نطاقات زمنية قصيرة إلى حد ما ودقة نانوية.

يمكن استخدام

متعدد الألوان FPALM لمجموعة متنوعة من المجسات المختلفة ، بما في ذلك البروتينات القابلة للتنشيط الضوئي والأصباغ العضوية المحبوسة في أقفاص أو غير قفص. نقدم هنا تفاصيل حول البروتوكول والإعداد للتصوير المتزامن لنوعين من البروتين الفلوري ، Dendra2 و PAmCherry. أبلغنا عن نتائج التصوير PAmCherry المترافق مع بيتا أكتين (PAmCherry-actin) و Dendra2 المترافق مع الإنفلونزا هيماجلوتينين (Dendra2-HA) في الخلايا الليفية NIH-3T3. يمكن تبديل المكونات الموضحة في الإعداد بأجهزة أخرى أكثر ملاءمة لتصوير المجسات الأخرى. عندما يكون هذا هو الحال ، فقد حاولنا أن نكون صريحين في النص.

متعدد الألوان FPALM مثالي للإبلاغ عن التوزيعات المكانية لأنواع البروتين المتعددة في الخلايا الحية أو الثابتة. هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للتحقيق في العلاقات المكانية و / أو الديناميكية على المقاييس المكانية بطول النانومتر ، على الرغم من أن الصور ستبلغ عن التوطين على مجموعة من مقاييس الطول ، من عشرات النانومترات إلى عشرات الميكرونات. تتمثل إحدى الميزات الرئيسية ل FPALM متعدد الألوان في أن الإعداد غير مكلف نسبيا للبناء ، ومرن للغاية للاستخدام مع مجموعات المسبار المختلفة. توفر عملية بناء ومعايرة النظام من المكونات أيضا فهما كبيرا للعوامل التي يمكن أن تضر بجودة البيانات وقابليتها للتفسير ، وبالتالي نتائج البحث. نقوم هنا بتفصيل طرق الإعداد البصري ، وإعداد العينة ، والحصول على البيانات لأنواع البروتين المتعددة ، مع تركيبات اندماج PSFP و PAFP ، باستخدام FPALM. بينما يصف هذا البروتوكول تحليل الخلايا الثابتة ، فإن هذه الإجراءات قابلة للتطبيق بسهولة على تصوير الخلايا الحية.

يعد الإعداد البصري الموصوف هنا مثاليا للتصوير المتزامن ل PSFP Dendra2 و PAFP PAmCherry. يمكن استخدام العديد من المجسات الأخرى للتصوير متعدد الألوان. ومع ذلك ، قد تختلف المكونات الدقيقة المطلوبة ، اعتمادا على أطياف الإثارة والانبعاث للمجسات المختارة. يجب اختيار المرايا والمرشحات وأطوال موجات الليزر ثنائية اللون بناء على هذه الاعتبارات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرجى ملاحظة ما يلي: يمكن العثور على تمثيل تخطيطي للمكونات البصرية المشار إليها في هذا البروتوكول في الشكل 1.

< p class = "jove_title" >1. تحضير عينة الخلية

  1. خلايا الصفيحة بكثافة محسنة (بالنسبة لخلايا NIH-3T3 ، هذا ما يقرب من 2-5 × 104 خلايا / سم2) في آبار غرفة مكونة من 8 آبار. يجب أن تكون الخلايا مطلية بوسائط كاملة مناسبة لنوع الخلية ، على الرغم من أنه يجب أن تكون الوسائط خالية من المضادات الحيوية وبدون الفينول الأحمر ، مما يساهم في تألق الخلفية. لاحظ أن ظروف تجربة الخلايا ، مثل النطاق الأمثل لأرقام التمرير ، قد تختلف باختلاف خطوط الخلايا الفردية.
  2. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (أو في الظروف المناسبة لنوع الخلية) للسماح للخلايا بالالتصاق بالغطاء. الخلايا الشفافة مع الحمض النووي الخالي من السموم الداخلية لكل من بنيات أنواع البروتين (في هذه الحالة ، الحمض النووي ل PAmCherry-actin و Dendra2-HA). قم بتغطية العينة بمواد خفيفة غير منفذة مثل رقائق الألومنيوم. يجب أن يشمل التعدي الآبار التي تحتوي على كل من تركيبات الحمض النووي ، والآبار التي تحتوي على واحد فقط من كل من هذه الإنشاءات.
  3. احتضان لمدة 4-6 ساعات و 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (أو في الظروف المناسبة لنوع الخلية) ، قبل التغيير إلى وسائط كاملة (مع المضادات الحيوية ، بدون الفينول الأحمر) واحتضانها لمدة 16-48 ساعة للسماح للخلايا بالتعبير عن البروتينات المطلوبة.
    1. يمكن إصلاح الخلايا عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثم احتضانها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (تنبيه: سام) في PBS لمدة 15 دقيقة في RT ، ثم غسل 3x أخرى باستخدام PBS. ومع ذلك ، اعتمادا على البروتينات ذات الأهمية ، قد يؤدي هذا التثبيت إلى مجموعة كبيرة من الجزيئات الموسومة التي لا تزال متحركة. لتقليل الحركة بشكل أكبر ، تشمل طرق التثبيت البديلة استخدام الميثانول المبرد بنسبة 100٪ ، أو 0.2٪ جلوترالديهايد و 4٪ PFA في PBS لمدة >30 دقيقة عند 25 درجة مئوية20. في كلتا الطريقتين ، يجب غسل الخلايا باستخدام PBS على النحو الوارد أعلاه. لاحظ أن استخدام الجلوترالديهايد قد يزيد من تألق الخلفية أو التألق الذاتي في بعض ظروف التصوير ، وقد يتطلب علاجا بعد التثبيت باستخدام بوروهيدريدالصوديوم 21.
  4. يمكن الاحتفاظ بالعينة عند 4 درجات مئوية ، مغمورة في PBS ، مختومة في فيلم ذاتي الغلق ، لمدة تصل إلى 7 أيام قبل التصوير.
< p class = "jove_title" >2. محاذاة المجهر

  1. ضع مقياس معايرة (شبكية) على مرحلة المجهر. باستخدام هدف 10X والمصباح للضوء المنقول ، قم بتوسيط الشبكة في وسط مجال الرؤية (FOV).
  2. إضاءة كولر. اضبط المجهر لإضاءة Köhler22. للبدء ، أغلق فتحة المجال والنظر من خلال العين التركيز على الشبكة. إذا كانت حواف فتحة المجال خارج نطاق التركيز البؤري، فاضبط ارتفاع المكثف حتى يتم التركيز البؤري على كل من فتحة العدسة الميدانية والشبكة.
  3. اضبط الموضع الجانبي لفتحة المجال حتى يتم توسيطها فيما يتعلق بمجال الرؤية. أغلق فتحة الحقل حتى تضيء الشبكة المركزية فقط على الشبكة.
  4. للحصول على محاذاة تقريبية لموضع الكاميرا (أي في المرة الأولى التي يتم فيها محاذاة الإعداد)، استخدم كثافة مصباح عالية مع إغلاق غالق الكاميرا، ولا تضع أي مكونات في المربع B (الشكل 1)، في المسار البصري حتى يتم الوصول إلى الخطوة 2.5. لا تضع L2 وL3 في مسار الكشف عند محاذاة الكاميرا لأول مرة. قم بتوسيط الصورة الشبكية تقريبا على غالق الكاميرا عن طريق ضبط الوضع الرأسي والأفقي للكاميرا (الشكل 2 ب). قم بتعطيل كسب EM ، وأطفئ أضواء الغرفة ، وافتح غالق الكاميرا.
  5. بعد تقليل شدة المصباح إلى مستوى لا يتلف مستشعر الكاميرا ، قم بعرض الضوء من الصورة الشبكية مباشرة على مستشعر الكاميرا (الشكل 2 أ). قم بتركيز الشبكة عن طريق ضبط مقبض تركيز المجهر أثناء عرض الصورة في وضع الفيديو المباشر داخل برنامج الاستحواذ. قم بتوسيط الصورة الشبكية على مستشعر الكاميرا عن طريق ضبط الوضع الرأسي والأفقي للكاميرا (الشكل 2 ب).
  6. ضع L2 وL3 في مسار الكشف بين فتحة العدسة والكاميرا (الشكل 2C). قم بمحاذاة L2 و L3 ، بحيث يكون L2 بعد بؤري واحد من النقطة المحورية لمنفذ خروج المجهر و L3 هو بعد بؤري واحد من مستشعر الكاميرا. وينبغي أن تكون المسافة بين L2 وL3 مساوية من الناحية المثالية لمجموع الأطوال البؤرية ل L2 وL3، ولكن يمكن تعديلها إلى حد ما لاستيعاب قيود المساحة. يجب أن تكون الكاميرا والعدسات على نفس ارتفاع منفذ الخروج.
  7. لاحظ أن الضوء المنبعث من المجهر يجب أن يتركز على L2 و L3. اضبط المسافة بين L2 والمجهر للتأكد من أن الصورة الشبكية في تركيز حاد على كل من الكاميرا ومن خلال العينين.
  8. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام ترجمات صغيرة (على سبيل المثال <1 مم) من L2 و L3 لتوسيط الصورة الشبكية على مستشعر الكاميرا.
  9. وحدة لونين. بمجرد تحسين موضع الكاميرا، قم بلصق المكونات الموضحة في المربع B (الشكل 1) في مسار الكشف. يمكن لصق هذه المكونات على حامل قابل للإزالة ، بحيث يمكن إدخال الوحدة بأكملها ل FPALM متعدد الألوان ، أو إزالتها لتطبيقات FPALM الأخرى التي لا تتطلب ذلك.
  10. في المرة الأولى التي يتم فيها تجميع هذه المكونات ، اضبط أطوال مسار كل قناة لتكون متساوية. قم بإسقاط الشبكة على شريحة الكاميرا ، واضبط M7 و M9 ، و / أو أغلق فتحة الاكتشاف (AP) لمنع التداخل المكاني بين القناتين. ركز صورة الشبكة في قناة الضوء المنعكسة.
  11. إذا لم تكن الصورة في قناة الضوء المرسلة في بؤرة التركيز ، فقم بترجمة M9 (وتدويرها إذا لزم الأمر) حتى يتم التركيز على الصورة الشبكية في وقت واحد في كلتا القناتين. لاحظ أنه يجب إزاحة القناتين بشكل جانبي من بعضهما البعض (الشكل 2 د). يمكن أن يؤثر هذا الإزاحة ، سواء كان أفقيا أو رأسيا ، على سرعة الاستحواذ. لمزيد من المعلومات، راجع دليل مستخدم الكاميرا.
  12. سجل لقطة لمقياس الشبكة (لاستخدامها لاحقا في حساب التكبير الكلي). باستخدام برنامج الكاميرا ، حدد منطقة الاهتمام المطلوبة. ستكون معدلات الإطارات الأعلى ممكنة بشكل عام لمنطقة أصغر ذات اهتمام.
فئة < ص = "jove_title" >3. محاذاة الليزر

  1. قم بتشغيل ليزر القراءة والتنشيط. (تنبيه: يجب استخدام الليزر فقط بعد أن يخضع المشغلون لتدريب على السلامة بالليزر.) يجب أن تظل جميع أبواب المختبر مغلقة ، مع وجود الموظفين الأساسيين المدربين فقط داخل المختبر أثناء محاذاة الليزر. استخدم مصاريع SH1 و SH2 لحجب حزم القراءة والتنشيط على التوالي عندما لا تكون قيد الاستخدام ، ومرشحات ND لتخفيف قوى الليزر إلى مستويات آمنة (<1 ميجاوات). من المفيد تقليل جميع إضاءة الغرفة أثناء المحاذاة ، باستثناء الإضاءة اللازمة للسلامة.
  2. حظر حزم التنشيط والقراءة. قم بإزالة L1 من مسار الليزر.
  3. ضع بطاقة بيضاء متدفقة على M4. تحتوي معظم المجاهر المركبة التجارية على مصراع مدمج لمنع الإضاءة الواردة. إذا كان ذلك متاحا ، افتح غالق المجهر ، وركز حتى تظهر الصورة الشبكية على M4. إذا لم يكن مصراع المجهر الداخلي متاحا ، فاستخدم غالقا خارجيا في مكان مناسب يمنع جميع أشعة الليزر من دخول المجهر.
  4. توسيط ليزر القراءة في مجال الرؤية. قم بإلغاء حظر حزمة القراءة. قم بتوسيط شعاع القراءة على الشعيرات المتصالبة للصورة الشبكية على M4 عن طريق ضبط M1.
  5. قم بإسقاط الصورة الشبكية على M5 ، واضبط المرآة M4 حتى يتمركز الشعاع على الشعيرات المتصالبة للصورة على M5 ، بحيث يتم توسيط شعاع القراءة مع التقاطع الشبكي في كل من M4 و M5. قم بحظر شعاع القراءة.
  6. توسيط ليزر التنشيط في مجال الرؤية. قم بإسقاط الصورة الشبكية على M3 ، وقم بإزالة موسع الشعاع (BE) من مسار الليزر. قم بإلغاء حظر شعاع التنشيط.
  7. اضبط M2 لتوسيط شعاع التنشيط على الشعيرات المتصالبة للصورة الشبكية على M3. بمجرد التوسيط ، استبدل BE بين M2 و M3 ، واضبط موضع BE حتى يتمركز الشعاع على الشعيرات المتصالبة للصورة الشبكية على M3.
  8. باستخدام هدف 10X ، قم بعرض الصورة الشبكية على M5 ، واضبط مقبض تركيز المجهر إذا لزم الأمر للحصول على التركيز. اضبط زاوية DM1 حتى يتمركز شعاع التنشيط على الصورة الشبكية هناك. سد كلا الحزمتين.
  9. مع عدم وجود هدف في مكانه ، وفتح مصراع المجهر ، قم بعرض ليزر القراءة من خلال الفتحة الخلفية للمجهر. (تنبيه: تخلق هذه الخطوة خطرا على سلامة الليزر عن طريق توجيه شعاع ليزر متوازي في مسار رأسي غير محظور.) اضبط M5 حتى يخرج الشعاع مباشرة من المجهر ويهبط على السقف أعلاه مباشرة ، أو يتمركز على بطاقة موضوعة على حامل الهدف في البرج.
  10. اختياري: يمكن تسهيل تحديد المحاذاة الصحيحة عن طريق استخدام عينة من الصبغة في المحلول (في هذه الحالة ، الرودامين B عند ~ 100 ميكرومتر في الماء أو الميثانول بعمق >0.5 سم للأغراض البصرية) ، الموضوعة على مرحلة العينة مع وضع العدسة الموضوعية 60X في مكانها. إذا تمت محاذاة الحزمة بشكل صحيح ، فسيقوم الهدف بعرض مخروط من التألق محاذاة لمحور الهدف والمجهر. ستؤدي الانحرافات الصغيرة في وضع شعاع الليزر في الفتحة الخلفية الموضوعية إلى انقلاب المخروط بعيدا عن المحاذاة الرأسية البحتة.
  11. سد كلا الحزمتين. قم بتركيب L1 في مسار الليزر على مسافة مناسبة (أي بعد بؤري واحد) من الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية. مع وضع هدف 60X في مكانه ، اسمح لشعاع القراءة بالظهور على السقف. اضبط الوضع الأفقي والرأسي ل L1 (عموديا على اتجاه انتشار الليزر) حتى يتمركز الشعاع فوق المجهر. ملاحظة: في هذه الخطوة ، ستشكل الحزمة بقعة أكبر مما كانت عليه في الخطوة السابقة.
  12. سيؤثر الموضع المحوري ل L1 وبعده البؤري على حجم المنطقة المضيئة في العينة. بالمعنى الدقيق للكلمة ، يجب أن يأخذ حساب ملف تعريف الإضاءة في العينة في الاعتبار الحيود23. بشكل تقريبي ، ومع ذلك ، فإن وضع L1 على مسافة محورية بخلاف بعد بؤري واحد من المستوى البؤري الخلفي الموضوعي سيؤدي في كثير من الحالات إلى ظهور ملف تعريف إضاءة ليزر أصغر وأكثر كثافة مما كان عليه عندما يكون L1 على بعد بؤري واحد بالضبط من المستوى البؤري الخلفي. يمكن استخدام منطقة مضيئة أصغر لإنتاج كثافة ليزر أعلى لتطبيقات معينة ، مثل التصوير عالي السرعة ، على سبيل المثال.
  13. قياس ملف تعريف شعاع القراءة. مع وجود L1 في مكانه ، ضع عينة من محلول الصبغة المركز المناسب (في هذه الحالة ، Rhodamine B عند ~ 100 ميكرومتر في الماء) على المسرح.
  14. مع حظر ليزر التنشيط ، قم بإسقاط ليزر القراءة (اضبط ND1 للحصول على طاقة <<1 ميجاوات لجميع الحزم المكشوفة) من خلال هدف 60X وفي الصبغة ، و (مع تعطيل كسب EM) أرسل هذه الصورة إلى الكاميرا.
  15. ركز الهدف في العينة. في هذه الخطوة ، هناك حاجة إلى فتحة كبيرة بما يكفي للسماح بتصوير ملف تعريف الحزمة الكاملة.
  16. قم بترجمة نقطة الوصول بشكل جانبي بحيث يكون مركز ملف تعريف الحزمة ونقطة الوصول متحدة المركز. باستخدام برنامج الكاميرا، اختر منطقة الاهتمام للسماح بأصغر منطقة قراءة للكاميرا تغلف كلتا القناتين. سجل هذه الإحداثيات. سجل لقطة واحدة (هذا هو ملف تعريف حزمة القراءة).
  17. سيتم الحصول على الصور التي تعكس بشكل صحيح ملف تعريف الليزر في المستوى البؤري عندما تكون عينة محلول الصبغة رقيقة قدر الإمكان. يمكن إنشاء مثل هذه العينة الرقيقة عن طريق وضع قطرة من ~ 5 ul من محلول الصبغة بين شريحة المجهر والغطاء.
  18. قياس ملف تعريف شعاع التنشيط. منع ليزر القراءة. إسقاط ليزر التنشيط على العينة ؛ وعرض هذه الصورة على الكاميرا.
  19. إذا لزم الأمر ، استخدم كسب EM <100 واضبط DM1 حتى يتم توسيط الحزمة في كل مجال رؤية. سجل لقطة لملف تعريف شعاع التنشيط.
  20. قياس قوة كل شعاع. قم بإزالة محلول الصبغة وضع مستشعر مقياس الطاقة فوق هدف 60X (بدون وسائط غمر). قم بقياس قوة كل شعاع (التنشيط والقراءة) على حدة. لاحظ أنه يجب ضبط موضع عداد الطاقة بعناية للتأكد من أن كل طاقة الليزر المنبعثة تضرب مستشعر عداد الطاقة.
  21. لكل ليزر ، استخدم مرشحات الكثافة المحايدة (ND1 و ND2) لضبط الطاقة لإنتاج شدة في العينة المناسبة للتجربة.
  22. شدة ليزر القراءة للحصول على الصور. يجب أن تكون شدة ليزر القراءة عالية بما يكفي لإثارة الجزيئات المفردة وتبييضها ضوئيا خلال الفترة الزمنية لبضعة إطارات. القيم النموذجية هي 103-10 4 واط / سم2 (انظر أيضا Gould et al.4). تعتمد الكثافة في العينة على حجم منطقة الصورة ، وبالتالي فإن الطاقة المطلوبة لتحقيق الكثافة المطلوبة ستختلف من نظام إلى آخر.
  23. شدة ليزر التنشيط. يجب اختيار شدة ليزر التنشيط بحيث يكون عدد الجزيئات النشطة صغيرا (على سبيل المثال 1-100) في أي إطار اكتساب معين. بشكل تقريبي ، يتم الوصول إلى الكثافة المطلوبة عندما تكون أقرب مسافة بين الجزيئات النشطة أكبر قليلا من دقة الحيود المحدودة (انظر أيضا القسم 6 ، التصوير). مع انخفاض عدد الجزيئات المفردة غير النشطة ، يلزم وجود كثافة أعلى من ليزر التنشيط. الشدة النموذجية هي 10-1-10 2 واط / سم2.
  24. تحسين لوحة ربع الموجة. لوحة ربع الموجة (QWP) اختيارية ، ولكن زيادة درجة الاستقطاب الدائري لليزر القراءات والتنشيط باستخدام QWP يمكن أن يزيد من كثافة الجزيء في الصور النهائية. لتحسين QWP ، ضع مستقطبا بين QWP و M5. منع ليزر التنشيط. قم بإسقاط ليزر القراءة على مقياس طاقة فوق الهدف الجاف 60X.
  25. سجل زاوية QWP. اضبط المستقطب حتى الحد الأقصى ، ثم يتم تحقيق الحد الأدنى من القدرات. سجل كل من هذه القيم واحسب نسبة الحد الأدنى / الحد الأقصى. اضبط زاوية QWP وكرر هذه القياسات. في حين أنه من المستحسن الحصول على قيم قريبة من 1.0 ، فإن نسبة >0.8 كافية للتصوير.

4. إنشاء عينة دائمة من الخرز لمحاذاة القناة

  1. خفف عينة من حبات الفلورسنت (قطرها من 40-100 نانومتر) 1:70 في ماء بدرجة HPLC. قم بتخفيف محلول المخزون هذا بنسبة 1:15 في ماء HPLC ، للحصول على حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر من تعليق الخرزة في الماء.
  2. قم بتغطية الغطاء بالسائل بولي إل ليسين. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة. استنشق لإزالة المحلول ، واغسل الغطاء ثلاث مرات بماء HPLC بدرجة عالية. استنشق كل آثار الماء من الغطاء واتركه حتى يجف عند RT.
  3. الماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخرزة على الغطاء. اترك هذا الغطاء لمدة 20 دقيقة في RT قبل غسله ثلاث مرات بماء HPLC. بدلا من ذلك ، اترك قسيمة الغطاء O / N في RT للسماح للتعليق بالجفاف.
  4. باستخدام ~ 20 ميكرولتر من ماء HPLC أو وسط التركيب ، قم بتركيب الغطاء على شريحة زجاجية. أغلق محيط الغطاء بطلاء أظافر شفاف. بمجرد أن يجف الملمع ، ضع الغطاء (ووسائط الغمر الموضوعية المناسبة ؛ إما الماء أو الزيت) على هدف 60X.

5. الحصول على الصور: عينة حبة التصوير لمحاذاة قنوات الكشف

  1. قم بإضاءة عينة الخرزة بشعاع ليزر القراءة بكثافة أقل بحوالي 10 مرات مما سيتم استخدامه للتصوير. مع ضبط كسب EM على 100 ، قم بعرض الصورة على الكاميرا ، واضبط التركيز البؤري حتى تظهر الخرزات في كلتا القناتين.
  2. إذا كانت الخرزات خافتة ، فقم إما بزيادة قوة الليزر أو كسب EM. يعد تقليل الضوضاء في صور الخرزة (عن طريق اكتشاف عدد كبير من الفوتونات ، أي ما لا يقل عن 5,000 في المجموع من كل حبة) أمرا بالغ الأهمية لتسجيل القناة بدقة. قم بتكوين الكاميرا لتسجيل 100 إطار، بنفس وقت التعريض الضوئي الذي سيتم استخدامه للتصوير اللاحق بتقنية FPALM.
  3. ابحث عن المناطق التي يتم فيها توزيع الخرزات في كل من مركز القنوات ومحيطها ، وحيث تكون كثافة الخرزة منخفضة بما يكفي بحيث يتم فصل الخرزات الفردية جيدا ويمكن تحديدها بشكل فردي.
  4. احصل على ما بين 10-20 مجموعة من الصور لمناطق مختلفة عند كثافات الخرز هذه. راجع قسم النتائج للحصول على تفاصيل حول استخدام صور الخرزة لمعايرة القناة.
< p class = "jove_title" >6. الحصول على الصورة: متعدد الألوان FPALM

  1. من المهم تصوير الخلايا التي تم تحويلها بواحد فقط من كل من التركيبات ، وكذلك تسجيل صور الخلايا بجميع البنيات. ستساعد هذه البيانات في إنشاء الرسوم البيانية ألفا لكل من المجسات المستخدمة ، وهي مطلوبة لتفسير البيانات متعددة الألوان.
  2. ابحث عن الخلايا التي تعبر عن مجسات قابلة للتبديل ضوئيا، إذا كانت قيد الاستخدام. تخلص من جميع إضاءة الغرفة. قم بإسقاط المصباح الزئبقي ، عبر الحامل القابل للطي (FM) ، على العينة (التي تحتوي على خلايا منقولة). قم بتغيير مكعب مرشح البرج إلى مكعب يحتوي على تركيبة المرآة / المرشح ثنائية اللون المناسبة للسماح بإثارة حالة التبديل الضوئي المسبق للملصق. على سبيل المثال ، بالنسبة لتصوير Dendra2 المسبق ، أو المجسات ذات الانبعاث الأخضر المحول مسبقا ، فإن أحد الخيارات ل DM4 هو ثنائي اللون الذي يعكس الضوء الأزرق (<488 نانومتر) وبالنسبة ل F5 هو مرشح يمرر الضوء من ~ 500-570 نانومتر ، مع حجب الضوء خارج هذا النطاق.
  3. باستخدام العين ، ابحث عن الخلايا التي تعبر عن المسبار المسبق للتصوير. على سبيل المثال ، ستظهر الخلايا التي تعبر عن Dendra2 باللون الأخضر. لاحظ أنه ليست كل المجسات قابلة للتحويل الضوئي ، واعتمادا على أطياف الانبعاث المسبقة التبديل ، قد تتطلب تلك التي تتطلب مجموعات من DM4 / F5 مختلفة عن تلك المدرجة هنا.
  4. بمجرد اختيار الخلية ، حرك FM لأسفل للسماح لليزر بالمرور إلى المجهر (حجب ضوء الزئبق من المسار). قم بتغيير برج المرشح إلى ذلك الذي يحتوي على ثنائي اللون المناسب للتصوير (في هذه الحالة ، يجب أن يعكس DM2 كلا من ليزر القراءة والتنشيط ، أثناء إرسال أطوال موجية أطول ، ويجب أن ينقل F1 الأطوال الموجية إلى اللون الأحمر لليزر ويتميز بشكل مثالي بقمع عال عند الطول الموجي لليزر).
  5. إذا كانت الخلايا لا تعبر عن مسبار قابل للتبديل الضوئي ، فابحث عن الخلايا عن طريق عرض الصورة على الكاميرا ، وباستخدام ليزر القراءة لإضاءة العينة. من المحتمل أن تكون الجزيئات المفردة مرئية (انظر الشكل 3) في العديد من الخلايا.
  6. لتمييز الخلايا المنقولة عن مضان الخلفية (والتي لا يزال من الممكن أن تظهر كجزيئات وامضة بشكل فردي) ، ولتأكيد أن الجزيئات قابلة للتنشيط الضوئي ، قم بإضاءة العينة لفترة وجيزة بطاقة منخفضة من ليزر التنشيط (عادة من الميكروواط). يجب أن يزداد عدد الجزيئات القابلة للتنشيط الضوئي المرئية تحت شعاع القراءة بشكل كبير ويظل مرتفعا لفترة قصيرة حتى بعد حظر إضاءة التنشيط مرة أخرى. لاحظ أن المجسات المختلفة قد تختلف اختلافا كبيرا في سطوعها وكفاءة تحويل الصور وطاقة الليزر المطلوبة للتنشيط24-27.
  7. قم بإعداد برنامج الكاميرا للحصول على سلسلة حركية عن طريق ضبط كسب EM على 200 واختيار العدد المطلوب من الإطارات (عادة 5,000-10,000) ، ووقت التعريض الضوئي (عادة ما يكون 10-30 مللي ثانية مناسبا). بينما يمكن ضبط كسب EM أعلى من 200 ، فإن زيادة كسب EM إلى زيادة الضوضاء.
  8. حظر شعاع التنشيط. قم بإلغاء حظر شعاع القراءة، وعرض صورة الخلية المضيئة على الكاميرا.
  9. تأكد من نقل الخلية (الخطوة 6.6). أثناء عرض الخلية، اضبط التركيز البؤري حتى يظهر المستوى البؤري المطلوب، وتصبح الجزيئات في تركيز بؤري حاد.
  10. لاختيار مستوى بؤري يصور بالقرب من الغشاء الخلوي السفلي ، قم بتحويل التركيز لأسفل حتى تختفي الجزيئات الفردية مرئية. بعد ذلك ، حرك التركيز تدريجيا لأعلى حتى تصبح الجزيئات مرئية لأول مرة.
  11. للتصوير بالقرب من الغشاء الخلوي العلوي ، استمر في تحويل التركيز لأعلى بالمقدار المطلوب ، مع ملاحظة المسافة باستخدام مقبض تركيز المجهر أو التركيز التلقائي. سيؤدي اختيار منطقة تركيز بين هذين الحدين إلى تصوير منطقة في منتصف الخلية.
  12. قم بفك حظر شعاع التنشيط ، وقم بإضاءة العينة بكثافة منخفضة (استخدم مرشحات ND2 لتخفيف الحزمة إلى كثافة منخفضة جدا ، حوالي <1 واط / سم2 في العينة).
  13. بدء الحصول على البيانات. مطلوب كثافة عالية من الجزيئات النشطة. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان بالنسبة لخطوات التحليل ألا تتداخل هذه الجزيئات مكانيا.
  14. حاول الحفاظ على كثافة الجزيئات القابلة للتنشيط الضوئي المرئية ~ 0.1-1 ميكرومتر -2 عن طريق ضبط ND2. عادة ، بالنسبة لمنطقة الصورة التي يبلغ قطرها ~ 10-20 ميكرومتر ، سيكون هناك ~ 10-100 جزيء مرئي في وقت واحد (انظر الشكلين 3 و 4 للرجوع إليها). نظرا لأن عدد الجزيئات غير النشطة المتبقية يتناقص على مدار عملية الاستحواذ ، فقد تحتاج طاقة ليزر التنشيط إلى الزيادة تدريجيا للحفاظ على الكثافة.
  15. إذا كان التصوير TIRF مطلوبا * ، فيجب تركيب كل من M5 و L1 على مرحلة ترجمة واحدة (TS ، الشكل 1) ليتم تحريكهما بشكل جانبي (أي في اتجاه عمودي على الليزر خلف مدخل المجهر مباشرة). عندما تتم ترجمة M5 و L1 ، فإن الليزر الذي يخرج من الهدف لأعلى من خلال العينة سوف ينقلب تدريجيا إلى جانب واحد (تنبيه: خطر سلامة الليزر).
  16. عندما تصل زاوية الليزر إلى 90 درجة من الوضع الرأسي ، سيختفي الليزر الناشئ نفسه ، وسينعكس ليزر القراءة الوارد إلى الخلف ، ويظهر كشعاع يخرج من الفتحة الخلفية الموضوعية ، ومضادا للحزمة الواردة ، ويتم إزاحته إلى الجانب.
  17. في الوقت نفسه ، سيصبح تألق الخلفية مخففا بالكامل تقريبا ، وسيتم تقليل سمك منطقة العينة التي تحتوي على جزيئات مفردة واضحة ومركزة بشكل كبير.
    * سيسمح TIRF بتصوير جزء رقيق من العينة الذي يبلغ ~ 100-500 نانومتر فوق الغطاء. يمكن تحقيق المستويات البؤرية للتصوير الموجودة في العينة بسهولة باستخدام إضاءة واسعة النطاق (القسم 3) ، ولكنها غير مناسبة ل TIRF.
  18. عند الانتهاء من الاستحواذ ، أغلق مصراع المجهر على الفور ، وقم بسد كلا الحزمتين. قم بتعطيل كسب EM ، واضبط الكاميرا لتسجيل إطار واحد ، واضبط منطقة قراءة الكاميرا على أقصى حجم لها.
  19. حظر قناة واحدة عن طريق وضع بطاقة فوق F3 أو F4. باستخدام مرشح التمرير الطويل (>580 نانومتر) المثبت على مصباح المجهر، قم بإضاءة العينة وعرض هذه الصورة على الكاميرا. سجل لقطة للخلية.
  20. اختياري: مع استمرار حظر قناة واحدة ، افتح الفتحة بحيث تكون مساحة كبيرة من العينة مرئية عن طريق إضاءة الضوء المرسلة. سجل لقطة. هذه الصور الضوئية المرسلة مفيدة جدا لعرض سياق صور FPALM المقابلة.
  21. تصوير الخلايا الحية. لتصوير الخلايا الحية ، قم بنقل الخلايا وفقا للخطوات 1.1-1.3 ولكن لا تصلح هذه العينات. بدلا من ذلك ، قم بمحاذاة الإعداد كما هو موضح أعلاه بالكامل ، ولكن قبل تصوير العينات ، قم بإزالتها من 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، واغسل 3x في PBS ، واغمر العينة في وسائط التصوير (على سبيل المثال PBS مع 20 ملي مولار جلوكوز). ستؤدي إزالة وسائط الثقافة والغسيل إلى تقليل الخلفية المرتبطة بمعظم الوسائط الخلوية.
  22. يمكن تصوير العينات في RT إذا رغبت في ذلك ، كما هو الحال في الخلايا الثابتة ، أو عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 باستخدام مرحلة الحضانة المثبتة على مرحلة المجهر. يجب غمر عينة واحدة من خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 في وسائط التصوير لمدة لا تزيد عن ساعة واحدة تقريبا. قد يكون من المفيد مراقبة كيفية استجابة الخلايا للانغماس في وسائط التصوير قبل التحضير لتجارب من هذا النوع ، لتحسين وقت الغمر وربما تكوين وسائط التصوير لتقليل اضطراب الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" > تشكل هيماجلوتينين الإنفلونزا (HA) مجموعات في حدود عشرات النانومتر إلى الميكرومتر ، وهذه المجموعات تتزامن بشكل متغير مع الأكتين (الشكل 5). تؤكد هذه التوزيعات المكانية التصوير على نطاق خشن لهذين البروتينين28 ، واعتماد التوزيعات المكانية HA على الأكتين19. يمكن استخدام صور FPALM متعددة الألوان لوصف كثافة ومساحة ومحيط هذه المجموعات ، ودرجة التوطين المشترك بين النوعين على حد سواء على المقياس النانوي والميكروي. دقة الصور التي تم الحصول عليها في حدود عشرات النانومتر1،17...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر التصوير فائق الدقة القائم على التوطين العديد من الإمكانات القوية للتصوير البيولوجي. يمثل الطريق من المكونات البصرية الفردية الموضوعة على الطاولة إلى مجهر وظيفي فائق الدقة قادر على تصوير أنواع فلورية متعددة في وقت واحد في عينة بيولوجية عددا من التحديات. بعض جوانب المحاذاة أكثر أهمية من غيرها. نسعى أدناه لتقديم إرشادات للمستخدمين المحتملين الذين يتعاملون مع أصعب جوانب المسار.

خطوات حاسمة

تتطلب دقة الصورة المحسنة التي يوفرها FPALM والتقنيات المماثلة مزيدا من الاهتمام...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.T.H. و M.J.M. يحملان براءات اختراع في الفحص المجهري فائق الدقة. يعمل S.T.H. في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Vutara، Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا فيليب أندرسن وماثيو بارنت وشون كارتر على برمجة الكمبيوتر والمساعدة الفنية والمحادثات المفيدة وبات بايارد للمساعدة الإدارية. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة المعاهد الوطنية للصحة المهنية K25-AI65459 و NIH R15 GM094713 و NSF MRI CHE-0722759 و Maine Technology Institute MTAF 1106 و 2061 ، وصندوق التحسين الاقتصادي في مين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
غرف LabTek II حباتNunc
الفلورسنتحبات InvitrogenF-8801للمعايرة حبات
TetraspeckInvitrogenT-7279أربعة حبات ملونة للمعايرة
زيت الغمر الموضوعيZeiss518Fزيت الغمر لهدف NA العالي (اعتمادا على اختيار الهدف)
HPLC المياهفيشر ScientificW5-4
MediaATCC30-2003أو Cellgro 10-090
المضادات الحيويةGIBCO15070-063
مصلThermo ScientificSH30087.03
LipofectamineInvitrogen52887
Optimem IGIBCO11058-021
TrypsinMPBiomedicals1689149
بارافورمالدهيدفيشر AA433689M العلميتنبيه: سامة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Sci. 313, 1642-1645 (2006).
  4. Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).
  5. Gould, T. J., et al. Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies. Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).
  6. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
  7. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nat. 468, 580-584 (2010).
  8. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).
  9. Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy. Sci. 319, 810-813 (2008).
  10. Hess, S. T., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).
  11. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
  12. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).
  13. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).
  14. Shroff, H., et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).
  15. Bock, H., et al. Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters. Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).
  16. Bossi, M., et al. Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species. Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).
  17. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells. Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).
  18. Wilmes, S., et al. Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane. Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).
  19. Gudheti, M. V., et al. Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin. Biophys. J. , (2013).
  20. Tanaka, K. A., et al. Membrane molecules mobile even after chemical fixation. Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).
  21. Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
  22. Koehler, A. New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.
  23. Self, S. A. Focusing of Spherical Gaussian Beams. Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).
  24. Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy. Opt. Nanoscopy. 1, (2012).
  25. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat. Methods. 8, 1027(2011).
  26. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  27. Subach, F. V., Verkhusha, V. V. Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins. Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).
  28. Simpson-Holley, M., et al. A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions. Virol. 301, 212-225 (2002).
  29. Sternberg, S. R. Biomedical Image Processing. IEEE Computer. , 22-34 (1983).
  30. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).
  31. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).
  32. Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. Methods Cell Biol. 89, 329-358 (2008).
  33. Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).
  34. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).
  35. Mlodzianoski, M. J., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).
  36. Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy. J. Opt. , (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Photoactivation Localization MicroscopyMulticolor ImagingSuper Resolution MicroscopyPhotoactivatable Fluorescent ProteinsPhotoswitchable Fluorescent ProteinsTotal Internal Reflection FluorescenceNanometer Precision ImagingLive Cell ImagingFixed Cell ImagingOptical Setup Alignment

Related Articles