بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Summary

عرض فج هي تقنية قوية لالتقاط البروتينات أو الأنصاف البروتين الذي يتفاعل مع جزيء يجمد الفائدة. مرة واحدة وقد تم اتخاذ قرار من هذا النوع من مكتبة [كدنا] فج لخلق والشاشة، وبروتوكول الموصوفة هنا يسمح اختيار تقارب كفاءة مما يؤدي إلى تحديد interactors.

Abstract

باستخدام فج المؤتلف كما سقالة لتقديم مختلف أجزاء البروتين المشفرة بواسطة مكتبة [كدنا] المستنسخة إتجاهي إلى جزيئات الطعم يجمد هو وسيلة فعالة لاكتشاف التفاعلات. تم إلى حد كبير استخدام هذه التقنية لاكتشاف البروتين البروتين التفاعلات ولكن الطعم جزيء أن يكون الطعن ليس من الضروري أن يقتصر على البروتينات. وقد تم تحسين بروتوكول المعروضة هنا للسماح لعدد متواضع من الطعم ليتم عرضه في مكررات لتعظيم تحديد استنساخ مستقلة تقديم نفس البروتين. هذا يسمح بمزيد من الثقة التي تتفاعل البروتينات التي تم تحديدها هي interactors المشروعة للجزيء الطعم. رصد عيار فج بعد كل اختيار تقارب يوفر جولة المعلومات حول كيفية اختيار تقارب يسير فضلا عن فعالية الضوابط سلبية. إحدى وسائل titering فج، وكيف وماذا لإعداد مقدما للسماح هذه العملية في التقدم بكفاءة كماممكن، ويرد. ويسلط الضوء على سمات amplicons استرجاع التالية العزلة البلاك المستقلة التي يمكن استخدامها للتأكد من مدى تقدمت اختيار تقارب. وأوضح المتاعب تقنيات للحد من ايجابيات كاذبة أو لتجاوز تعافى بإصرار فج اطلاق النار. وتناقش وسائل للحد من التلوث الفيروسي اشتعال.

Introduction

لماذا استخدام عرض فج واختيار تقارب بدلا من غيرها من التقنيات المتاحة لا تعد ولا تحصى لاكتشاف والتحقيق تفاعلات البروتين مع جزيئات أخرى؟ عرض فج يمكن أن يدعي بعض المزايا الفريدة أكثر من غيرها من أساليب الكشف عن البروتين التفاعلات يجند ^1-3 بما في ذلك ما يلي:

ذخيرة واسعة جدا من جزيئات الطعم

السبب قبل كل شيء هو في تنوع الجزيئات قادرة على العمل كطعم في اختيار تقارب ^4. عرض فج هو وسيلة قوية جدا لعزل شظايا البروتين الذي يتفاعل مع البروتينات الأخرى، النيوكليوتيدات، والكربوهيدرات، الخ ⁵ أساسا، إذا يمكن تركيبها بوليمر / جزيء إلى دعم استرداده، فإنه يمكن فحص للتقارب مع فج البروتينات عرضها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الوصول إلى جزيء الطعم لتحديد ما إذا كان يحتفظ النشاط البيولوجي عندما يجمد ^6، إذا كانت الظروف المستخدمة لصاستخرج / القضاء على نشاطها فعالة أو ^6، وإدخال تعديلات ما بعد متعدية إلى الطعم قبل اختيار تقارب.

المقاومة فج لعوامل خارجية

والسبب الثاني لاستخدام العرض فج، غير أنه من الممكن أن بعض الطعوم قد تتطلب الإجهاد البيئي (الحرارة، وتركيزات عالية osmolyte، العوامل المساعدة محددة، الخ.) لالتقاط البروتينات التفاعل، أو قد تحتاج فج البروتينات عرض لتغييرها بطريقة أو بأخرى قبل اختيار تقارب. العامل الأساسي قيد الدرس هو التفاعل بين الطعم والبروتينات، وليس شرط أن يسمح التفاعل أن يحدث أو إذا كان فتاكة بالنسبة لكائن الاختبار. فج T7 بشكل خاص مناسبة تماما لمثل هذه الدراسات لأنها يمكن أن تحمل الظروف القاسية التجريبية على حد سواء سليمة وقابلة للحياة (على سبيل المثال الحد الأقصى للبقاء الحرارية نشرت T7 هو ~ 60 درجة مئوية ^7). كمثال على تغيير فج عرض المواليةالبروتينات، عند دراسة بروتيوم بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana لركائز البروتينية للانزيم إصلاح، بروتين Isoaspartyl الميثيل Transferease (PIMT)، وهو الفيروس المستخدمة في هذه الدراسات كانت "العمر" لمدة أسبوع واحد، وقبل كل اختيار تقارب الجولة، لتشجيع إدخال من isoaspartate (isoAsp) مخلفات في البروتينات عرضة ⁶ وهو أمر غير ممكن في الكائنات الحية التي يمكن التعرف وإصلاح / استقلاب مثل هذه التشوهات.

خاملة أيضي

وعلاوة على ذلك، فإن فج وعادة ما تكون مقاومة للسموم الأيض والتدخل الجزيئات الصغيرة التي من شأنها، على الأقل، يؤدي إلى آثار عديد المظاهر على الكائنات اختبار عملية الأيض نشطة. بعد يغسل صرامة، تتم إزالة السموم قبل أن يتم إدخال كمية كبيرة من البكتيريا لعدوى حتى يتم تخفيف السم لمجموعة حميدة للبكتيريا أو تكرار فج لاحقة. أثناء التحقيق أهداف البروتين في إصلاح PIMTانزيم، وكان يستخدم S-Adenosyl الميثيونين (AdoMet) لتنشيط انزيم يجمد الدقيقة عيار لوحة جيدا للسماح الهدف التقاط البروتين في حين أن الاعتماد على S-Adenosyl الهموسيستين (AdoHcy) لإبطال نشاط انزيم وتوفير السيطرة السلبية مفيدة في تأمين مع العلم بأن الفيروس لن تتأثر سلبا من قبل أي AdoMet أو AdoHcy ^6. بالإضافة إلى ذلك، أعضاء معينة في وقت متأخر مرحلة التطور الجنيني الأسر وفرة (LEA) البروتين، والتحقيق في هذا المختبر، ومن المعروف أن تغيير شكلها في وجود مواد مضافة مثل السكروز ^8، والتي يمكن الحصول على تركيزات عالية مثل 200 ملم في بذور فول الصويا عند نقطة من النضج الفسيولوجي ^9. ولا يتوقع الفيروس أن تتأثر إضافة 200 ملي السكروز في كل جولة اختيار تقارب، وربما ضرورية لبعض تفاعلات البروتين LEA العميل، الذي ليس هو الحال بالنسبة للكائنات قابلة للحياة مستقلة اختبار ^10.

وقد ركز هذا المختبر على discoverinز البروتين البروتين التفاعلات في والبذور المجففة أو الإنبات الناضجة التي تكمن وراء آلية الحماية بروتيوم المخزنة خلال ¹¹ الجفاف أو إصلاح مكونات بروتيوم المخزنة التي هي عرضة للتشكيل isoAsp مرة واحدة وقد تشربوا البذور ^6. وبالتالي، فإن إنتاج وتنقية البروتينات المؤتلف المطلوبة كطعم في حالة نشطة، والتأكد من أنها تظل كذلك، قبل وبعد ويجمد أنها، على الرغم من صعوبة في كثير من الأحيان، هو حجر الزاوية في عملنا. لكن، وكما لكل سيناريو إنتاج البروتين المؤتلف هو مختلف، لن تكون موجهة الظروف الأمثل لإنتاج البروتين المؤتلف هنا. وحثت المستخدمين على محاولة، حيثما أمكن، لتحديد ما إذا كان البروتين يجمد لا يزال وظيفية (على سبيل المثال إذا كان هو انزيم، القيام فحص انزيم في الآبار وحة microtiter). هذا وسوف توفر بعض الثقة بأن الطعم هو النشطة بيولوجيا، وبالتالي، أن أي تفاعلات اكتشفت هيإلى حد ما أكثر عرضة لأهميتها البيولوجية.

Protocol

تصوير الرسم من الإجراء الموضح أدناه (الشكل 1) يسلط الضوء على اثنين من المكونات الأساسية لاختيار تقارب باستخدام مكتبة عرض فج: A) مكتبة [كدنا] فج العرض المحتمل لترميز البروتينات مع تقارب لوالطعم؛ B) الطعم المؤتلف المنقى البروتين. إنتاج الطعم (البروتين المؤتلف) وقد درست على نطاق واسع والأدب يحدد أفضل الممارسات لتأمين القابلة للذوبان، والبروتين المؤتلف نشطة من E. القولونية ^12-13، الخميرة حقيقية النواة ^{14، 15-16} الحشرات، النباتات ^{17-18، 19-20} أو خلايا الثدييات كثيرة.

في بروتوكول التالية، الموسومة hexahistidyl وقد استخدم البروتين المؤتلف كطعم. وهذا يسمح التحقق من أن البروتينات الطعم البقاء في الآبار بعد الحضانة وغسل الخطوات بين عشية وضحاها.

1. ELISA لاستبقاء البروتين المؤتلف في ويلز لوحة عيار مكروي

1. علامة لوحة microtiter مع الحبر الدائم، والمكلف الآبار والتي سوف تحتوي على تركيزات البروتين الذي. تنفيذ هذا في 3 مكررات من الآبار. وتشمل 3 مكررات من سلسلة تركيز السيطرة السلبية (البروتين الموسومة غير hexahistidyl؛ BSA يعمل بشكل جيد لأن هذا الاختيار الخلفية).
2. غسل لوحة على نطاق واسع بالماء وإزالة المياه عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب على 4 طبقات منشفة ورقية بين يغسل.
3. شل، في الآبار 3 الأولى، في 100 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 7.5، (أو عازلة للاختيار) أعلى تركيز من البروتين المؤتلف (10 ميكروغرام / مل). إضافة إلى الآبار الثلاث المقبلة البروتين المؤتلف في (1.0 ميكروغرام / مل)، الخ، وصولا الى 1.0 نانوغرام / مل. تفعل الشيء نفسه مع سلسلة تركيز BSA.
4. تغطية الأطباق مع الاغطية البلاستيكية وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
5. صباح اليوم التالي، وإزالة البروتين صفع لوحة رأسا على عقب 4-5 طبقات منشفة ورقية.
6. غسل الآبار 5X مع 200 ميكرولتر 1X TBS في كل مرة، وترك المخزن المؤقتفي الآبار ل~ 1 دقيقة في كل مرة وإزالة غسل العازلة صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية بعد كل غسل.
7. منع إليسا لوحة على شاكر دوارة باستخدام 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) BSA أو 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) في عرقلة كاشف TBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (أو الجلوس بين عشية وضحاها ثابتة عند 4 درجات مئوية إذا مريحة ) ملفوفة في غلاف بلاستيكي.
8. إزالة حل حجب الزائد عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. غسل 4X 1 دقيقة في كل مرة مع 200 ميكرولتر من 1X TBS، وإزالة الحل يغسل صفع لوحة رأسا على عقب.
9. تمييع خماسي HIS الأجسام المضادة الأولية 1/2، 000 في عرقلة العازلة وتسليم 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع لوحة ثابتة.
10. إزالة الأجسام المضادة الأولية من قبل صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. غسل 4X 1 دقيقة في كل مرة مع 200 ميكرولتر من 1X TBST. إزالة كل غسل عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب.
11. تمييع الضد الثانوية(عنزة مكافحة فأر الفوسفاتيز القلوية المكورات)، في عرقلة العازلة واحتضان 100 ميكرولتر في كل بئر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع لوحة ثابتة.
12. إزالة الأجسام المضادة الثانوية من قبل صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. غسل 4X 1 دقيقة في كل مرة مع 200 ميكرولتر من 1X TBST. إزالة كل غسل عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب.
13. وضع 200 ميكرولتر من شبه nitrophenylphosphate (pNPP) حل الركيزة في كل بئر. الركيزة هو الصلبة في -20 درجة مئوية حتى جعل مأخوذة واسترداد العدد المطلوب من مأخوذة اللازمة للكشف من الثلاجة قبل وقت كاف من الوقت حتى يتم إذابة تماما من قبل هذه المرحلة.
14. في 30 دقيقة وقف رد الفعل من خلال إضافة 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم M 3 إلى كل بئر.
15. قراءة الامتصاصية في 405 نانومتر على الفور على لوحة قارئ ELISA.

ملاحظة: إذا كان البروتين المؤتلف من الفائدة لا تعلق نفسها على الآبار، فمن الممكن لتغيير التكوين ه / الرقم الهيدروجيني للالعازلة كبير (درجة الحموضة عازلة كربونات 10.0) أو إضافة chaotropes (اليوريا) في محاولة لمساعدة البروتين المرفق إلى الآبار وحة microtiter. ومع ذلك، إعادة تأسيس أن البروتين المؤتلف: 1) لا يزال منضمة إلى الآبار وحة microtiter وفقا للشروط لاختيار تقارب و؛ 2) يحتفظ النشاط البيولوجي في أعقاب إزالة الحموضة العالية / chaotrope ينصح.

2. تزايد البكتيرية المضيف (BLT5403) لTitering

1. الأوتوكلاف (الشكل 2A) عشرة قوارير 250 مل مخروطي و 3 أنابيب الثقافة. جعل LB السائل وLB أجار للصب لوحات وسائل الاعلام الصلبة. بارد LB أجار إلى 50 درجة مئوية وإضافة الأمبيسلين إلى 100 ​​ميكروغرام / مل صب قبل asceptically في أطباق بتري في غطاء تدفق (الشكل 2B).
2. أيضا في غطاء تدفق (الشكل 2B) متتالية على LB، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (LB ^AMP100) لوحة أجار للمستعمرات واحد من BLT5403 من الأسهم يحتفظ بها في 15٪ (V / V)الجلسرين في -80 ° C (الشكل 2C). وضع لوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة للنمو (الشكل 2D).
3. في الصباح، وتطعيم 50 مل LB ^AMP100 في قارورة 250 مل مخروطي مع مستعمرة واحدة التقطت من لوحة. احتضان عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة في شاكر الأفقي (أرقام 2E و2F)، واستخدام مطياف لرصد كثافة الخلية في OD ₆₀₀ = 0،5-0،6 (الشكل 2H).
4. صب الخلايا في أنبوب 50 مل الصقر أو ما شابه ذلك، والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى استخدامها (الشكل 2G). سوف تبقى قابلة للحياة الخلايا عادة ل~ 1 في الاسبوع.
5. جعل 500 مل LB، ووضعه في قارورة Fernbach حيرة والأوتوكلاف ذلك. مرة واحدة فمن معقمة، ضع قارورة في 4 درجات مئوية (الشكل 2G) أو درجة حرارة الغرفة حتى ليلة "يوم واحد" أدناه.

ملاحظة: خلايا المضيف البكتيريةBLT5403، معربا عن مصدر المنقولة البلازميد من T7 البروتين قفيصة الأم التي بدونها T7 منتصف، وناقلات، نسخة منخفضة لا يمكن نسخ بنجاح، عرضة لهذا الفيروس للغاية. لا بد من تجنب التلوث. سوف يحدث تلوث في نهاية المطاف وعند هذه النقطة يجب أن تمحى جميع الأسطح في اتصال مع الفيروس / البكتيريا المصابة مع 70٪ (V / V) الايثانول أو نقيت باستخدام المنظفات (الشكل 2I). إذا كان هذا غير فعالة، لا بد من تطهير شامل لجميع الأسطح التي يمكن أن تحمل Envirocide (الشكل 2J). بدء BLT5403 الخلايا من الأسهم الفريزر كل جولة جديدة من اختيار تقارب للمساعدة في تخفيف التلوث من الأسهم في 4 درجات مئوية، وضمان وتستخدم خلايا نشطة في البروتوكول. مرشح حاجز نصائح ماصة ضرورية.

3. اختيار تقارب

DAY ONE

1. علامة لوحة microtiter مع الحبر الدائم، والمكلف الآبار والتي سوف تحتوي على البروتوكول الاضافي الذيEINS / التعديلات. (ونظرا لقضايا التلوث، يتم استخدامها أبدا لوحات). تنفيذ هذا في 3 مكررات لكل من الآبار البروتين والعلاج.
2. غسل لوحة على نطاق واسع بالماء وإزالة المياه عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب على 4 طبقات منشفة ورقية بين يغسل. شل، في 100 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 7.5، (أو عازلة للاختيار) البروتين المؤتلف (10 ميكروغرام / مل) في ست آبار، أو BSA (10 ميكروغرام / مل) في ثلاثة آبار، ليصبح المجموع 9 آبار لأول جولة من اختيار تقارب. تغطية صحن مع غلاف بلاستيكي وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الشكل 2G).
3. تأكد من أن هناك 9 × 250 مل قوارير مخروطي (انظر 2.1 أعلاه) وتنظيفها، تعقيمها، وصفت بشكل مناسب (الترميز مع الشريط الملون يعمل بشكل جيد، الشكل 2F).
4. حساب حجم فج المحللة لاستخدامه في كل تستند بشكل جيد على عيار المكتبة المستخدمة وعدد فج ليتم عرضه.
5. تأكد من أن الخلايا BLT5403 جديدة تكون جاهزة للاستخداملtitering هذا الاختيار تقارب الجولة غدا (الشكل 3A).
6. ضمان ما يكفي من 1X TBS (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس قاعدة، ودرجة الحموضة 7.6) و 1X TTBS (TBS 1X + 0.05٪ (V / V) توين 20) متاحة لتنفيذ 10 × 200 ميكرولتر يغسل لعدد من الآبار المستخدمة . بالإضافة إلى ذلك، يحضن مسبقا على TTBS في درجة حرارة تقارب الاختيار. تأكد من أن نسخة احتياطية، مختومة، 50 مل من 1X أنبوب فالكون TTBS موجود في درجة حرارة تقارب مع اختيار كافية 1X TTBS.
7. 3 إعداد علاجات × 3 × 3 مكررات يثلث من 1.5 مل أنابيب إيبندورف (27 مجموع) مع 990 ميكرولتر من LB ^{100 AMP} كل وتسمية بشكل مناسب (على سبيل المثال 10 ^-2). هذه هي لاسترجاع البكتيريا المصابة من الآبار وحة microtiter غدا. بمناسبة التخفيف على جانب واحد من أنبوب (10 ^-2) وعدد تصاعدي على الجانب الآخر ("1"). لكل أنبوب إيبندورف، أيضا تسمية أنبوب واحد واحد البورسليكات LB ^{100 AMP} لوحة. في هذا ثالمنعم يوسف، يتم ترقيم لوحات وأنابيب الاختبار البورسليكات 1، 2، 3، 4، 5، الخ. لجعل titering أسرع. بعد ذلك عدد بسيط يمكن أن تكون مطابقة لتخفيف وعلاج على أنبوب إيبندورف (كان مثل أنبوب للرقم 12 على ثلاث نسخ الثالثة من النسخ المتماثل الأول من السيطرة BSA للتخفيف 10 ^-5). مخزن أنابيب إيبندورف وLB ¹⁰⁰ لوحات ^AMP بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أرقام 2G و 3B).

على سبيل المثال: بدء وضع العلامات 1.5 مل أنابيب إيبندورف لمدة ثلاثة 10 ^-2 التخفيفات من فج من تكرار BSA احدة كذلك 1، 2، و 3 (ثلاث قراءات ثلاث نسخ من عيار فج للنسخ المتماثل واحد)، ثم وضع علامة البورسليكات أنابيب الاختبار 1، 2 و 3 التي سوف تكون مختلطة البكتيريا المصابة ببكتيريا المعافين وكبار الاغاروز قبل صب على لوحات LB ^{100 AMP} أجار (الشكل 3C).

8. لد المسلسلilutions، والتسمية أنابيب إيبندورف، وإلى كل منهما، إضافة 900 ميكرولتر من LB ^{100 AMP.} مرة واحدة يتم إجراء التخفيفات الأولي (10 ^-2) من البكتيريا المصابة لكل بروتين / العلاج، والنسخ، وثلاث نسخ، وغدا، وسوف تكون مختلطة جيدا و 100 ميكرولتر اتخذت منها وإضافتها إلى أنبوب إيبندورف المناسبة التي تحتوي على 900 ميكرولتر LB ^{100 AMP} لتخفيف 10 ^-3 (أنابيب 4، 5، و 6 للسيطرة BSA تكرار واحد). وسوف تكون مختلطة جيدا هذه بدورها وسيتم استخدام 10 ^-3 التخفيفات لجعل 10 ^-4 التخفيفات (7، 8، 9). استخدام 10 ^-4 التخفيفات ل10 ^-5 التخفيفات (10، 11، 12)، وغيرها. للحصول على عيار لأول من مكررات BSA الثلاثة (الآبار).
9. نفس وسيتم ذلك من أجل النسخ المتماثل BSA اثنين (حسنا 2)، BSA تكرارها ثلاث (3 جيدا)، ومكررات ثلاثة من الطعم المسموم، وأخيرا مكررات ثلاثة من الآبار الطعم. في النهاية، يجب أن يكون هناك أنابيب صفت ومدمج 1-135 (135 هو ثلاث نسخ الأخيرة من تكرار الماضي من الطعم في تخفيف الحد الأقصى من 10 ^-6). تخزين هذه الأنابيب إيبندورف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الشكل 3C يظهر إيبندورف وأنابيب البورسليكات لجميع التخفيفات من يثلث من ثلاثة مكررات (الآبار الثلاثة) من جيش صرب البوسنة.
10. بدء 2 أو 3 أنابيب ثقافة الخلايا BLT5403 (التقطت من المستعمرات واحد من يشوبه طازجة بين عشية وضحاها لوحة LB ^AMP100؛ من الخطوة 2.2 أعلاه) نموا في احتضان شاكر (أرقام 2E و2F) باعتبارها الثقافة بين عشية وضحاها. إلى 500 مل LB (نقطة 2.5 أعلاه)، إضافة إلى 100 ​​الأمبيسلين ميكروغرام / مل ووضع قارورة Fernbach في المشبك في حاضنة تهتز لذلك سوف تكون عند 37 درجة مئوية والغازي في صباح اليوم التالي (الشكل 2F).

ملاحظة: الجولة الثالثة والرابعة قد تتطلب التخفيفات التقريبية لتصل إلى 10 ^-10 حجم صالحاج إلى حجم لLB ^AMP100.

اليوم الثاني

11. صباح اليوم التالي، ضع تعقيمها، فارغة 9 × 250 مل قوارير مخروطي (واحد لكل وحة microtiter جيدا) في المشابك في احتضان شاكر. تطعيم 500 مل LB ^{100 امبير} مع 500 ميكرولتر من واحدة من الثقافات بين عشية وضحاها من الخلايا التي BLT5403 الليلة الماضية (انظر الخطوة 3.8 أعلاه)، وختم تشغيله النمو (37 درجة مئوية، 220 دورة في الدقيقة). بدوره على معمل (الشكل 2H) وتعيينها إلى قراءة الامتصاصية في 600 نانومتر.
12. إزالة لوحة microtiter من 4 درجات مئوية، وإزالة فيلم من البلاستيك، وإزالة أي البروتين غير منضم من لوحة عن طريق غسل 10X مع 200 ميكرولتر من 1X كل مرة TBS 7.5 درجة الحموضة وصفع لوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية بين يغسل. منع مع 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) BSA أو 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) في عرقلة كاشف TBS لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها في حالة مريحة) مع لوحة ملفوفة في غلاف بلاستيكي.
13. يغسل ليالي الحجبolution 10X مع 200 ميكرولتر من 1X كل مرة TBST، صفع لوحة رأسا على عقب على 4 طبقات من منشفة ورقية بين يغسل. فمن الممكن لإعادة ملء الآبار مع 200 ميكرولتر المياه في هذه المرحلة، تغطيتها مع غلاف بلاستيكي ووضعها في 4 درجات مئوية لتخزين لأقصى قدر من 1 في الاسبوع.

ملاحظة: بدء ثقافة قريبا بما فيه الكفاية أنه، في الوقت الذي فج المصابة BLT5403 من الانتهاء من اختيار تقارب مستعدون لإضافة الخلايا في 500 مل ما بين 0.6 و 1.0 OD _600. إذا كانت تنمو أبعد بكثير 1.0، قد لا يحدث تحلل بسبب قيود الموارد مع اقتراب خلايا الطور الثابت. إذا كانت الخلايا لا تحقيق لOD ₆₀₀ من 0.6 قبل على الأقل لإدخال فج، وتعدد العدوى يمكن أن تكون مرتفعة للغاية، مما أسفر عن مقتل بسرعة الخلايا، التي يمكن أن تؤثر على تمثيل المحللة. إذا كانت الخلايا لا تقترب حتى الان الى OD ₆₀₀ من 0.6 قبل الانتهاء من اختيار تقارب، شركة النفط الوطنية العراقيةulate القارورة مع أكثر BLT5403 من الثانية (أو حتى من الثاني والثالث على حد سواء) أنابيب الاختبار تهتز عند 37 درجة مئوية (الشكل 2F). إذا كان OD ₆₀₀ من 1.0 يقترب بسرعة أيضا، إيقاف سخان وشاكر وفتح غطاء لتبريد الثقافة وتجويع البكتيريا للأكسجين. تم إضافة يعاود التدفئة / الهز مرة واحدة في فج.

من هنا استخدام حاجز نصائح فلتر لتجنب فج التلوث المتبادل.

14. مرة واحدة يتم تلقيح القارورة، وضعت المكتبة فج (100 ميكرولتر) في مع البروتينات، وختم لوحة مع الاغطية البلاستيكية ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
15. في 55 دقيقة، تسجيل OD ₆₀₀ من الخلايا. الوقت هو مضاعفة تقريبا كل 20 دقيقة. العمل وفقا لذلك (انظر "ملاحظة" أعلاه).
16. في نهاية ساعة واحدة إزالة غلاف بلاستيكي من لوحة ويغسل فورا الرج فج في النفايات تتحول بسرعة ثم إضافة 200 ميكرولتر من 1X السلST. (استخدام multipipettor مع رئيس ميكرولتر 1 = 100 وpipettor تعيين على 2 [أي يسلم 200 ميكرولتر / المكبس الاكتئاب] لهذا ويذهب بسرعة). تحديد توقيت لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة، نفض عازلة في النفايات تحول، لوحة صفعة رأسا على عقب على منشفة ورقية ووضع مرة أخرى على مقاعد البدلاء (25 ° C لوحة). تكرار غسل الخطوات 10X.
17. بعد غسل ^ال 10، واتخاذ 200 ميكرولتر من BLT5403 الخلايا من أنبوب فالكون 50 مل في 4 درجات مئوية ووضعها في قاع البئر التي تمت إزالة غسل الماضي من TTBS. التفاف على لوحات في غلاف بلاستيكي وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحصول على أي فج لا تزال عالقة إلى الطعم لتصيب البكتيريا (انظر الملاحظة في المناقشة المتعلقة فج استرجاع بإصرار و / أو خلفية عالية من دون تمييز فج ملزمة).
18. في نهاية 20 دقيقة، بسط لوحات ويستغرق 10 ميكرولتر من البكتيريا BSA في 25 ° C تكرار بئر واحدة ووضعها في 990 ميكرولتر من LB ^{100 AMP} ملحوظ"1". كرر مرتين أكثر لذلك جيدا (أنابيب 2 و 3) مما أدى إلى 3 من يثلث 1/100 التخفيفات من فج من ذلك أيضا. هذا هو BSA نسخ متماثل واحد عينات ثلاث مرات. وسوف تستخدم هذه التخفيفات لتقدير متوسط ​​عيار ± SEM لأن تكرار BSA.
19. تفعل الشيء نفسه للنسخ المتماثل 2 و 3 من BSA (ثلاث عينات من ثلاث نسخ 10 ميكرولتر لكل منهما)، لآبار منسوخة ثلاثة من البروتين الطعم المسموم، وللبروتين الطعم. تعيين هذه 27 أنابيب إيبندورف جانبا والحصول على 170 ميكرولتر المتبقية من البكتيريا المصابة في الآبار المتزايد نحو تحلل.
20. إذا كانت البكتيريا في قارورة هو في OD ₆₀₀ = 0.6-1.0، صب 50 مل من الخلايا Fernbach قارورة في كل من تسع 250 مل قوارير مخروطي. تأخذ 170 ميكرولتر المتبقية من المصابين فج BLT5403 البكتيريا في النسخ المتماثل BSA 1 جيدا وإضافته إلى 50 مل الخلايا وضع علامة "BSA معدل تقييم 1" (الشريط الأصفر). نفعل ذلك لجميع الآبار التسعة ووضعها في حاضنة تهتز ( الشكل 2F).
21. رصد الخلايا في 37 درجة مئوية شاكر يحتضنها من وقت لوقت للتحلل (حوالي 3 ساعة من وقت التلقيح). جعل التخفيفات من 27 التخفيفات الأولي (10 ^-2) في المناسبة، وأنابيب إيبندورف المسمى خلال هذا الوقت.
22. لتنفيذ هذه التخفيفات من 27 التخفيفات الأولي من 3.12 أعلاه، واتخاذ 100 ميكرولتر من LB مع البكتيريا من أنبوب إيبندورف 1 (BSA تكرار واحد، الأول من عينات ثلاث نسخ من هذه 1/100 التخفيف من هذه البئر) وإضافته إلى 900 ميكرولتر من LB في أنبوب إيبندورف 4 (1 × 10 ^-4 التخفيف من تكرار BSA واحد، الأول من عينات ثلاث نسخ من هذه البئر).
23. تجاهل الطرف الحاجز مرشح عن واحدة جديدة قبل الحصول على 100 ​​ميكرولتر من LB مع البكتيريا من أنبوب إيبندورف 4 إضافة إلى 900 ميكرولتر من LB في أنبوب إيبندورف 7 (1 × 10 ^-5 التخفيف من BSA تكرار واحد، الأولى من ثلاث نسخ عينات من هذه البئر). تواصل التخفيفات (دالخاصة إلى 1 × 10 ^-6) لجميع يثلث جميع مكررات من جميع البروتينات والعلاجات (135 أنابيب في المجموع).
24. بمجرد هي lysed الخلايا، وجلب الثقافة إلى 0.5 M كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 5 مل من كلوريد الصوديوم M 5 الأسهم ونقلها إلى زجاجة الطرد المركزي المسمى.
25. أجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. صب طاف (الفيروس) في بيئة نظيفة، معقمة 50 مل أنبوب فالكون.
26. إضافة بضع قطرات من الكلوروفورم لطاف يصب في أنبوب فالكون.
27. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة الجولة المقبلة من اختيار تقارب.

4. اليوم الثالث

1. الأوتوكلاف أو تبييض جميع معدات المختبرات التي تم استخدامها في توليد هذا الاختيار تقارب جولة للتحضير للجولة القادمة.

5. Titering

1. عدد ما يصل الصلبة LB ¹⁰⁰ لوحات ^AMP كما أن هناك التخفيفات في ترتيب تصاعدي (يجب أن يكون هناك الآن 1 لوحة لكل أنبوب البورسليكات وإيبندورف أنبوب، ولكل منها نفس العدد). Pحزب التحرير لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية (الشكل 3D).
2. تذوب أعلى الاغاروز (1.0 غرام Bacto تريبتون، مستخلصات الخميرة ز 0.5، 0.5 غرام كلوريد الصوديوم، 0.6 غرام الاغاروز، وجعل ل100 مل، الأوتوكلاف) من خلال تخفيف أعلى غطاء زجاجة الاغاروز والميكروويف بالتناوب الزجاجة ويحوم عليه لأنها مزيج حتى أعلى الاغاروز قد ذاب تماما. وضع زجاجة في حمام الماء لتبرد إلى 50 درجة مئوية (الشكل 3E).
3. اتخاذ مل ماصة البورسليكات 10 مع مضخة ماصة المرفقة. إشعال الموقد بنسن. تحويل حامل الستايروفوم أنبوب فالكون أو برودة غطاء رأسا على عقب على مقاعد البدلاء ووضع لوحات LB100 AMP من 1 إلى 6 (الطازجة من الحاضنة 37 درجة مئوية) على ذلك، لوحة 1 العلوي (الشكل 4A). والستايروفوم تحافظ على لوحات دافئة.
4. وضع 250 ميكرولتر BLT5403 الخلايا من 4 درجات مئوية في كل من أنابيب الاختبار البورسليكات مرقمة أعد في يوم واحد أعلاه (القسم 3.7 وأرقام 4B و 4C). عتتراوح أنابيب البورسليكات مرقمة في نفس سلسلة تصاعدي كما التخفيفات في 1.5 مل أنابيب إيبندورف (الشكل 4A).
5. وضع 100 ميكرولتر من التخفيف في أنبوب إيبندورف 1 في 250 ميكرولتر من الخلايا في البورسليكات أنبوب اختبار 1 (أرقام 4D و4E). تسخين أول 5 من ماصة على اللهب قليلا (ليس كثيرا! ~ 3 صفعات، 4F الشكل) والغطس في الاغاروز أعلى المنصهر. سحب ما يصل 3 مل وتسليم بسرعة في أنبوب الاختبار على رأس خلية / فج (الشكل 4G).
6. مزيج من قبل عبها مع اصبع في حين عقد أنبوب مع جهة أخرى (الشكل 4H) وتصب محتويات على لوحة (الشكل 4I). إمالة لوحة واستخدام أنبوب اختبار لمطاردة الفقاعات والبقع الجافة حتى يتم تغطية لوحة كاملة من الاغاروز أعلى. ضعه جانبا، وتستقيم على مقاعد البدلاء لتبرد.
7. تجاهل أنبوب البورسليكات، إخراج طرف حاجز مرشح، والحصول علىواحدة جديدة وتستمر حتى تم مطلي جميع التخفيفات. استرداد LB ^{100 AMP} لوحات من الحاضنة مع استنزاف أنها ولكن ليس أكثر من 6 في وقت أو أنها تبرد والاغاروز أعلى يتصلب بسرعة كبيرة جدا.
8. مرة واحدة في أعلى الاغاروز صلبة، وتحويل لوحات رأسا على عقب (ومن المهم القيام بذلك). خلاف ذلك، وأجار / الاغاروز "يبكي"، يتكثف على الغطاء، يسقط باستمرار على الاغاروز أعلى وتدير أكثر من ذلك، مع الأخذ في فج معها مما يجعل من المستحيل عيار بدقة) وإما: 1) وضع لوحات في 37 درجة C حاضنة [أن يعود في وقت لاحق 4 ساعة لحساب عيار كما T7 هو العدوانية] OR: 2) اترك لهم رأسا على عقب على مقاعد البدلاء وأنهم على استعداد في صباح اليوم التالي لحساب عيار.
9. اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة للحماية ضد تحطيم الزجاج، أو الإصابة إذا كان كذلك، وضع سقف أعلى زجاجة الاغاروز مرة أخرى على فضفاضة والميكروويف الاغاروز أعلى حتى يغلي. القيام بذلك مرتين. ندعه يبرد، وتشديدقبعة وضعها بعيدا. تحويل حمام الماء إلى درجة حرارة المعتادة أو إيقاف تشغيله. وضع التخفيفات في الثلاجة 4 درجات مئوية. وسوف تكون هناك حاجة لتفسير التتر و / أو إعادة بعض titering.

6. تحديد وحساب عيار

1. دراسة وحة شكلت على لوحات وتجاهل تلك التي تحلل متكدسة (الشكل 5A على سبيل المثال 10 ^-2 التخفيف). تحديد أي من ما تبقى من التخفيفات المسلسل أنتجت قليلة بما فيه الكفاية لوحة لتمكين حصيلة دقيقة (أرقام 5A 5B والثانية). تسجيل عدد من هذه اللوحات لوحة (الجدول 1؛ الشكل 5B).
2. ضرب عدد من البلاك بنسبة التخفيف ثم تضاعف هذا العدد ب 100 للحصول على عدد الوحدات التي تشكل لوحة لكل مل من البكتيريا المصابة المأخوذة من الآبار (أي أخذت فقط 10 ميكرولتر من البكتيريا المصابة لكل من يثلث وقس هذا يجب مضروبا في 100 للحصول على التهم لكل مل). متوسط ​​عدد وحدات اللوحة تشكيل (PFU) في الملليمتر الواحد، (PFU / مل من البكتيريا المصابة غير مخفف اتخاذها للخروج من لوحة microtiter جيدا)، في جميع أنحاء يثلث ثلاثة المأخوذة من هذا أيضا.
3. تشكيل جراند متوسط ​​للاحصاءات لآبار تكرار ثلاثة وحساب الخطأ المعياري للمتوسط ​​هذا (الجدول 1). هذا هو ما سيتم تسجيلها في هذا الرقم من الزيادة في فج عيار كل جولة اختيار تقارب والعلاج (الشكل 5C).

7. عزل لوحة، PCR، وتسلسل

1. في نهاية الجولة تقارب اختيار 4، حدد 18 فرد، واضحة المعالم، والمستعمرات وحة، وذلك باستخدام العقيمة باستور ماصة، مسواك، الأصفر غيض ماصة أو جهاز مماثل، جوهر هذه اللوحة من لوحات titering. في حالة استخدام الأنابيب أو نصائح، أولا الرطب الداخل مع تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 في أنبوب إيبندورف (الشكل 5D).
2. في حالة استخدام الأنابيب، وتأكد من أنبوب البورسليكات لا يحمل قطرات الزائدة من تريس، وخفض لمبة و، مع أنه لا يزال مضغوط، ودفع غيض ماصة البورسليكات من خلال لوحة معزولة جيدا الحق في طبق بتري البلاستيكية أدناه (الشكل 5E). الافراج عن لمبة مع طرف ماصة تزال في أجار / قمة الاغاروز وتمتص جوهر (الشكل 5F، انظر السهم).
3. طرد الأساسية إلى 100 ​​ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 في الأنبوب المناسب (الشكل 5G) ودوامة لفترة وجيزة.
4. حرارة 20 ميكرولتر من هذا الحجم عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
5. أجهزة الطرد المركزي لحجم ساخنة في 13،000 XG في جهاز للطرد المركزي الفوق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. يستغرق 3 ميكرولتر من طاف من هذه قسامة لاستخدامها في تفاعلات PCR مع T7 T7-UP-DOWN والاشعال.
6. لكل من لوحة معزولة 18، ​​حلول ساخنة، وجعل 50 ميكرولتر رد فعل PCR باستخدام درجة حرارة الصلب من 58 درجة مئوية و 35 دورات.
7. تشغيل 20 ميكرولتر من مجموعة شرق افريقياح رد فعل على 1٪ (ث / ت) agarose هلام يحتوي على 0.015٪ (ت / ت) بروميد إيثيديوم. تصور مع transilluminator باستخدام حماية العين المناسبة وقفازات النتريل المختبر. (تنبيه: بروميد إيثيديوم هو المغير قوية.) صورة الجل والتخلص من المواد الملوثة بشكل صحيح (أرقام 6A و6B).
8. إذا كان amplicons هي منتجات واحدة، وليس من ناقلات الفارغة (المنتج يعمل بالقرب من 100 سنة مضت على 1٪ (ث / ت) TAE agarose هلام؛ أرقام 6A 6B والسهام)، وتنظيف 30 ميكرولتر المتبقية للاستخدام كقالب التسلسل. إن لم يكن منتج واحد على هلام (الشكل 6B، لوحة 15)، وقطع الفرقة أبرز (ق) من الجل واستخراج الحمض النووي من الجل باستخدام عدة.
9. تسلسل amplicons التي ليست ناقلات الفارغة باستخدام التمهيدي T7-UP.
10. فحص كل تسلسل للأسلحة رابط و، من هذه المعلومات، وتحديد أين يقع بدء إدراج. استخدام باكذا المحلي محاذاة أداة البحث (الانفجار؛ المكتبة الوطنية للطب) لتحديد هوية [كدنا المشفرة، سواء إدراج في الإطار، وإذا كان الأمر كذلك، تم عرض ما جزء من البروتين الترميز تسلسل (CDS) والتي استولت عليها الطعم.

Results

أن تكون قادرة على إضعاف قدرة الطعم للتفاعل مع البروتينات عرض فج (أيضي تسمم الطعم) يوفر سيطرة سلبية قوية لهذه التقنية. كما أنه من المستحسن لتحديد ما إذا كان الطعم، عندما منضما إلى لوحة microtiter جيدا، يحتفظ ظيفتها. كل من هذه الشيكات سيزيد من الثقة بأن التفاعل، البروتينات عرض فج يستردها الطعم nonpoisoned مشروعة.

أخذ العينات الثلاث يثلث من كل بئر يضيف إلى حد كبير في الوقت والعمل تشارك في اختيار تقارب ولكنها توفر تق...

Discussion

عن طريق تشغيل التجربة في ثلاثة آبار منسوخة، فج المكتسبة بشكل مستقل من نفس البروتين ملزمة إلى الطعم يمكن تمييزها حتى لو كانت هي نفسها استنساخ (أي لا فرق في تسلسل النوكليوتيدات المنطقة CDS التي تم الحصول عليها ولكن كانت هذه استردادها من آبار مستقلة). خلاف ذلك، فإن الطريقة الوحيدة للتمييز بين فج ترميز البروتين نفسه ملزما للالطعم هو مستقل إذا كانت عكس المناطق كتب التي تختلف في بعض جزء من تسلسل النوكليوتيدات.

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
تريبتون	بيكتون ديكنسون	مستخلص الخميرة 211705
	بكتون ديكنسون	212750
أجار	بيكتون ديكنسون	214010
كلوريد الصوديوم	فيشر العلمي	BP358-10
منتجات أبحاث الاغاروز	الدولية	A20090
كاشف حجب	EMD Chemicals Inc.	69064
توين 20	فيشر Scientific	BP337-100
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر Scientific	BP359-212
كبريتات دوديسيل الصوديوم	فيشر Scientific	BP166-500
تريس بيس	فيشر Scientific	BP152-5
كلوروفورم	فيشر Scientific	BP1145-1
الإشريكية القولونية< / em> BLT5403	EMD للكيماويات	BLT5403	النمط الجيني: F- ompT hsdS< / em>B< / sub>< / strong> (rB< / sub> - mB< / sub> -) < / strong >gal dcm < / em > pAR 5403 < / sub >< / strong > (AmpR)
أمبيسلين ، منتجات أبحاث ملح الصوديوم	الدولية	A40040
بروميد الإيثيديوم	فيشر Scientific	BP102-1
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	شركة سيجما ألدريتش كورب.	A-9647
Penta-HIS الجسم المضاد الأساسي	Qiagen Inc.	34660
الماعز المضادة للفأر القلوية الفوسفاتيز المترافقة	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153<
em>para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP التمهيدي	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
التمهيدي	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR تنقية طقم	Qiagen Inc.	28104
طقم استخراج جل Qiaquick	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 مجموعة تسلسل الدورة	Invitrogen Life Technologies	4336917
كتلة التسخين	شركة بيرس للكيماويات (شركة ثيرمو فيشر العلمية)	18780
96 بئر لوحات ثقافة الخلايا Corning		Costar 3590
Isotemp حاضنة فرن	فيشر Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 &# 190; in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
قفازات ، نتريل	فيشر Scientific	19-170-010C
أنابيب معقمة 1.5 مل USA	Scientific Inc	1615-5500
10 مل ماصات البورسليكات	فيشر Scientific	13-678-25E
أنابيب ثقافة البورسليكات	فيشر Scientific	14-961-27
Uniskan I ، مختبرات مختبر ومختبرات التدفق لقارئ الألواح ELISA	، هلسنكي ، فنلندا	Type 362