مقالة منهجية

ضربة قاضية الجينات على نطاق واسع في C. ايليجانس استخدام المكتبات تغذية الرنا المزدوج الجديلة لتوليد قوية لتخفيف من وظيفة الظواهر

DOI:

10.3791/50693

⸱

سبتمبر 25, 2013

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما الرنا المزدوج الجديلة التغذية في C. ايليجانس هو أداة قوية لتقييم وظيفة الجين والبروتوكولات الحالية للشاشات التغذية على نطاق واسع يؤدي إلى الكفاءة ضربة قاضية متغير. وصفنا بروتوكول محسنة لأداء نطاق واسع شاشات التغذية رني أن يؤدي إلى ضربة قاضية فعالة وقابلة للتكرار في التعبير الجيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تدخل الحمض النووي الريبي عن طريق تغذية الديدان البكتيريا معربا عن dsRNAs أداة مفيدة لتقييم وظيفة الجين في C. ايليجانس. بينما هذه الاستراتيجية يعمل بشكل جيد عندما يتم استهداف عدد صغير من الجينات لضربة قاضية، وشاشات التغذية على نطاق واسع تظهر الكفاءة ضربة قاضية المتغير، الأمر الذي يحد من فائدتها. لدينا فككت بروتوكولات ضربة قاضية رني المنشورة سابقا وجدت أن المصدر الرئيسي للانخفاض ضربة قاضية يمكن أن يعزى إلى فقدان البلازميدات الرنا المزدوج الجديلة ترميز من البكتيريا لتغذية الحيوانات. بناء على هذه الملاحظات، وقد وضعنا بروتوكولا التغذية الرنا المزدوج الجديلة أن يقلل إلى حد كبير أو فقدان يلغي البلازميد لتحقيق كفاءة وإنتاجية عالية ضربة قاضية. علينا أن نبرهن على هذا البروتوكول سوف تنتج قوية، تدق استنساخه من أسفل C. ايليجانس الجينات في أنواع الأنسجة المتعددة، بما في ذلك الخلايا العصبية، وسوف تسمح ضربة قاضية كفاءة في الشاشات على نطاق واسع. يستخدم هذا البروتوكول لتغذية الرنا المزدوج الجديلة المتاحة تجاريايصف مكتبة وجميع الخطوات اللازمة لتكرار مكتبة وأداء شاشات الرنا المزدوج الجديلة. لا يتطلب البروتوكول استخدام أي معدات متطورة، وبالتالي يمكن أن يقوم بها أي C. ايليجانس المختبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاريخيا، وشاشات جينية في C. وقد أجريت ايليجانس عن طريق التعامل مع الحيوانات المغير الكيميائية مثل إيثيل methanesulfonate لخلق طفرات عشوائية داخل الحمض النووي. ذرية أو grandprogeny الحيوانات mutagenized ثم يتم عزل هذا المعرض النمط الظاهري الشاذة المطلوب. ثم يتم التعرف على الطفرات المسؤولة عن التسبب في النمط الظاهري من خلال إجراء رسم الخرائط كثيفة العمالة أو عن طريق تسلسل جينوم دودة متحولة بأكمله. هناك العديد من المزايا لأداء مثل هذه الطفرات شاشات الكيميائية كما أنها تخلق آفات دائمة داخل الجينوم الدودة التي يمكن أن تؤدي في كل مكسب من وظيفة والخسارة من وظيفة الظواهر، ولكن الإجراء تعيين بطيئة ومكلفة.

تدخل الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط (dsRNAi) يوفر وسيلة بديلة لتحديد الجينات المسؤولة عن العمليات البيولوجية الهامة. في هذه الطريقة، يتم إدخال الرنا المزدوج الجديلة مطابقة تسلسل الترميز من الجين الذاتية في دودة.تتم معالجة الرنا المزدوج الجديلة في الجسم الحي لتوليد صغيرة (21-22 النوكليوتيدات) الرنا أن تكون بمثابة أدلة لإيجاد وربط mRNAs والذاتية مطابقة، واستهداف لهم لتدمير 1. هذا الإجراء سريع نسبيا، ولكن لأن الرنا المزدوج الجديلة يستهدف مرنا بدلا من الحمض النووي، ويلاحظ فقط الحد من وظيفة الظواهر باستخدام هذا النهج.

إدخال dsRNAs إلى حيوان لا يمكن أن يتحقق عن طريق الحقن المباشر للالرنا المزدوج الجديلة 2، عن طريق نقع الحيوانات في الرنا المزدوج الجديلة 3، أو عن طريق تغذية الحيوانات البكتيريا التي تعبر عن الرنا المزدوج الجديلة 4. كل من هذه الأساليب تسليم تتسبب في آثار ضربة قاضية النظامية لأن معظم خلايا الحيوان تعبير SID-1، قناة عبر الغشاء قادر على استيراد الرنا المزدوج الجديلة 5. كانت تستخدم أصلا لنهج الوراثة العكسية لضربة قاضية في التعبير عن الجينات فرد واحد في وقت واحد، وتطوير المكتبات التغذية اثنين يسمح الآن شاشات جينية واسعة النطاق. المكتبات الرنا المزدوج الجديلة المتاحة تجاريا تحتوي على درجة البكالوريوساستنساخ cterial تمثل 55٪ إما أو 87٪ من جميع C. ايليجانس الجينات 6، 7.

للأسف، غالبا ما تؤدي شاشات التغذية على نطاق واسع في dsRNAi الكفاءة ضربة قاضية متغير 8-10. في حين أن المستوى المطلق للضربة قاضية من قبل رني لا تقاس بسهولة، ويجب أن يكون السبب في انخفاض الكفاءة ضربة قاضية لوحظ في الشاشات على نطاق واسع من قبل mRNAs والجينات المحددة المتبقية التي تفلت التحلل بواسطة رني. هذا، بدوره، يمكن أن يكون نتيجة مباشرة لفقدان الرنا المزدوج الجديلة البلازميد من البكتيريا تتغذى على الحيوانات في هذه الشاشات. دعم هذه الفكرة، الحيوانات التي تتغذى خليط من البكتيريا، والتي 50٪ فقط من البكتيريا التعبير عن dsRNAs ضد الجينات المستهدفة، تظهر خفضت بشكل كبير (إن وجدت) آثار ضربة قاضية مقارنة للسيطرة على الحيوانات التي تتغذى 11. مدى ضربة قاضية الجينات يصبح مصدر قلق بالغ عند تنفيذ شاشات dsRNAi حيث أن معظم الجينات في C. ايليجانس هي haplosufficient وبالتالي يجب تخفيض التعبير الجيني بنسبة 50٪ على الأقل رس يسبب خسارة من الظواهر وظيفة 12.

وقد استخدمنا بروتوكولات التغذية المنشورة سابقا لأداء شاشات واسعة النطاق، ووجدت نفس آثار ضربة قاضية متغير ذكرت من قبل الآخرين 8-10. في البحث عن الأسباب المحتملة، وجدنا أن ما يقرب من 60٪ من البكتيريا تتغذى على الحيوانات في الشاشة فقدت البلازميد الرنا المزدوج الجديلة. قمنا بتطوير مكتبة الازدواجية والفحص البروتوكول الذي يقلل بشكل كبير أو يلغي خسارة البلازميد ويحسن إلى حد كبير كفاءة ضربة قاضية. هذا البروتوكول هو مناسبة لأداء شاشات نطاق واسع في C. ايليجانس ويمكن استخدامها لفحص أي واحد من المكتبات الرنا المزدوج الجديلة متاحة تجاريا. باستخدام هذا البروتوكول، نجد أن الأساس 100٪ من البكتيريا تتغذى على الحيوانات خلال الشاشة الاحتفاظ البلازميد الرنا المزدوج الجديلة ترميز وتسبب خسارة قوية وتوغل للغاية من الظواهر الدالة في جميع الأنسجة فحصها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحديد الجينات المطلوبة لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة. كما لمراقبة الجودة اللازمة خلال الشاشة، ويتم تغذية الحيوانات على حد سواء الإيجابية والسلبية السيطرة البكتيريا، معربا عن الرنا المزدوج الجديلة لإثبات آثار رني في الأنسجة المستهدفة.

البروتوكولات نشرت التغذية الأخرى تنمو البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن بحضور إما 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين أو 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين 8-10. لقد وجدنا أن البكتيريا نما تحت أي من هذه الشروط تفقد البلازميد الرنا المزدوج الجديلة في الترددات العالية. في الواقع، لقد وجدنا أنه حتى عندما تزرع البكتيريا بين عشية وضحاها في تركيزات عالية جدا (تصل إلى 2 ملغ / مل) من الأمبيسلين أكثر من 50٪ من البكتيريا لم تعد تحتوي على البلازميد. في حين أن النمو في كربنيسيلين أدى عموما في الاحتفاظ أعلى من البلازميد، كان 25 ميكروغرام / مل ليست كافية لمنع فقدان البلازميد. بدلا من ذلك، وجدنا أن تركيزات كربنيسيلينكان مطلوبا ستعقد من 500 ميكروغرام / مل لمنع فقدان البلازميد خلال النمو في الثقافات السائل وكان مطلوبا 2 ملغ / مل كربنيسيلين لمنع فقدان البلازميد عندما كانت تزرع البكتيريا على ركائز صلبة أجار.

لأن الاحتفاظ البلازميد أمر بالغ الأهمية لنجاح ضربة قاضية، ويستخدم فقط عندما كربنيسيلين البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة يتم تربيتها في هذا البروتوكول. قمنا الأمثل بعناية تركيز كربنيسيلين المستخدمة في الثقافات نمو البكتيريا وصفها في هذا البروتوكول لضمان أن البكتيريا التي لا تحتوي على البلازميد لا تنمو في هذه الثقافات. ومع ذلك، كإجراء ومراقبة الجودة، ويتم تحديد الخسارة البلازميد في عدة خطوات من البروتوكول. ضربة قاضية لضمان كفاءة، يجب أن يحتوي على أكثر من 80٪ من البكتيريا في كل خطوة من هذه الخطوات الرنا المزدوج الجديلة البلازميد. إذا فقدت أكثر من 20٪ من البكتيريا في أي خطوة من بروتوكول البلازميد الرنا المزدوج الجديلة، والتحقق من جودة كربنيسيلين المستخدمة. كربنيسيلين ينبغي إعداد جديدة اليوم يتم استخدامه. إعداد كربنيسيلين الطازجة وتكرار الثقافة.

1. كيفية تحديد فقدان البلازميد

  1. إزالة عينة صغيرة من البكتيريا (كما هو موضح في كل خطوة ذات الصلة) وإضافته إلى 450 ميكرولتر الماء المعقم.
  2. استخدام 100 ميكرولتر من هذه العينة المخففة لخلق مزيد من 1:10، 1:100، و1:1،000 التخفيفات التسلسلي باستخدام الماء المعقم، وخلط الحلول بدقة بين التخفيف.
  3. انتشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على LB LB وAMP لوحات واحتضان هذه اللوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي، وتحديد لوحة LB الذي يحتوي على ما بين 100 و 500 المستعمرات البكتيرية. حساب عدد المستعمرات على هذه اللوحة وعلى المقابلة لوحة LB AMP (التي تحتوي على نفس التخفيف من البكتيريا).
  5. تحديد الخسارة البلازميد من هذه التهم مستعمرة. في المئة من البكتيريا التي لا تحتوي على البلازميد ويتم احتساب باستخدام المعادلة 1، وينبغي أن يكون أقل من 15٪ لفعالية الرنا المزدوج الجديلة نهدم.

figure-protocol-1"المعادلة 1" سرك = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. صنع لوحات المكتبة المكررة

لمحة عامة: إن مكتبة الرنا المزدوج الجديلة تصل من الشركة المصنعة (OpenBiosystems) كما 10،566 استنساخ البكتيرية في 96 لوحات جيدة. تخزين لوحات فورا في الفريزر -80 درجة مئوية. سيتم تكرار لوحات المكتبة الأصلي وجميع شاشات تغذية استخدام لوحات مكررة المكتبة كمصدر للبكتيريا. فإنه من المستحسن لتخزين الأصلي وتكرار لوحات المكتبة في المجمدات منفصلة. لينصح سهولة المناولة، وتكرار لوحات المكتبة 10 فقط في اليوم الواحد.

  1. إزالة لوحة مكتبة (ق) من الفريزر -80 درجة مئوية وإزالة ختم احباط بينما الثقافات لا تزال مجمدة. استبدال غطاء من البلاستيك لوحة المكتبة وتعيين لوحة على سطح مستو لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة (لا تزيد عن 30 دقيقة).

ملاحظة: لقد لاحظنا أن ع كبيرةercentage من البكتيريا وجدت في كل بئر من لوحات المكتبة الأصلية لا تحتوي على البلازميد. ومع ذلك، لأن البكتيريا المكتبة موردا ثمينا فمن غير المستحسن لاختبار لفقدان البلازميد في الثقافات مكتبة الأصلي.

  1. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 150 ميكرولتر من وسائل الإعلام الازدواجية المكتبة إلى كل بئر من القاع 96 شقة فارغة جيدا لوحة مكررة.
  2. مزيج من الثقافات البكتيرية مكتبة إذابة pipetting صعودا وهبوطا 4-5 مرات باستخدام ماصة الأقنية لتعيين 100 ميكرولتر. ثم إزالة 10 ميكرولتر من كل ثقافة مختلطة ونقل إلى الآبار المقابلة من لوحة مكررة. الاستمرار في نقل الثقافات من لوحة المكتبة لتكرار صنع لوحة معينة لتغيير نصائح ماصة لكل النقل.
  3. بعد أن تم نقل جميع الثقافات من لوحة المكتبة، تغطية الآبار من لوحة المكتبة الأصلي بورق لاصق جديد باستخدام الأسطوانة براير لضمان ختم شامل. استبدال غطاء من البلاستيك على لوحة ووضعه تستقيم في الفريزر -80 درجة مئوية حتى أعيد تجميدها مرة أخرى ثقافات (لا يقل عن 30 دقيقة). ثم نقل لوحات المكتبة الأصلي مرة أخرى إلى مربع تخزين المكتبة.
  4. يهز مكررة الثقافات لوحة مسطحة مكتبة لمدة 8-10 ساعة عند 37 درجة مئوية (450 دورة في الدقيقة على microshaker، مدار 3 مم).
  5. تحديد الخسارة البلازميد في كل لوحة مكتبة مكررة. وجدنا أن نسبة عالية من البكتيريا في كل بئر من لوحة المكتبة الأصلية لا تحتوي على البلازميد الرنا المزدوج الجديلة. فمن المهم أن هذه البكتيريا لا تسهم في النمو في المكتبة مكررة. لمنع نموها، ويستخدم على نسبة عالية من كربنيسيلين في وسائل الإعلام الازدواجية مكتبة (3 ملغ / مل). بعد ثقافة لوحة الازدواجية باستخدام هذه الشروط وجدنا أن أكثر من 90٪ من البكتيريا تحتوي على البلازميد الرنا المزدوج الجديلة. إزالة 10 ميكرولتر عينة من ثقافة جيدا ممثل كل لوحة مكررة وإضافته إلى 450 ميكرولتر الماء المعقم. باستخدام هذه العينات المخفف، وتحديد الخسائر البلازميد في كل مكتبة مكررةلوحة وفقا لخطوات 1،1-1،4. إذا لوحظ فقدان البلازميد كبيرة (> 20٪ من البكتيريا الموجودة في مكتبة مكررة لا تحتوي على البلازميد)، طبعة جديدة وسائل الإعلام الثقافة باستخدام كربنيسيلين الطازجة وتكرار بروتوكول من الخطوة 2.1.
  6. بعد الحضانة، ووضع ورقة لاصقة جديدة احباط مباشرة عبر الآبار لوحة مكررة، ووضع الأغطية على لوحة هذا احباط. وضع لوحات مكررة مكتبة تستقيم في الفريزر -80 درجة مئوية (30 دقيقة على الأقل) حتى المجمدة. مرة واحدة المجمدة، نقل لوحات إلى مربع تخزين مكتبة مكررة للتخزين على المدى الطويل.

3. صنع نسخ المؤقتة للمكتبة على Omniplates

لمحة عامة: في البداية لإعداد الطعام لشاشة الرنا المزدوج الجديلة، يتم نقل البكتيريا من لوحات مكررة إلى مكتبة omniplates أجار الصلبة ونمت بين عشية وضحاها. لمنع فقدان البلازميد على وسائل الاعلام الصلبة، تحتوي على omniplates كربنيسيلين في 2 ملغ / مل. البكتيريا على هذه اللوحات يمكن استخدامها لفترةمن أسبوع واحد، وتظهر أي خسائر البلازميد. نحن لم اختبار لفقدان البلازميد في البكتيريا نمت على omniplates أطول من أسبوع واحد.

  1. إزالة لوحة مكتبة مكررة (ق) من الفريزر -80 درجة مئوية وخلع ختم احباط في حين أن الثقافات لا تزال مجمدة. بعد إزالة احباط، واستبدال غطاء من البلاستيك لوحة، وتعيين لوحة مكتبة مكررة على سطح مستو لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة (لا تزيد عن 30 دقيقة).
  2. تعقيم دبوس المكرر بوكل 96. يجب أن تشطف دبابيس من المكرر نظيفة مع الماء المقطر ثم تعقيمها قبل كل استخدام. لتعقيم المكرر، وضعه في حمام الإيثانول (3/4 في عميق في طبق بيركس) ثم حرق الإيثانول طلاء دبابيس قبالة باستخدام موقد بنسن. تسمح اللهب لاخماد ثم كرر.
  3. وضع المكرر تعقيمها في الآبار من لوحة مكررة إذابة واستخدامه لاثارة بلطف الثقافات. سوف كميات صغيرة من ثقافة التمسك دبابيس من المكرر.
    4. <لى> إزالة بعناية المكرر من الآبار من لوحة مكررة ووضعه (دبابيس أسفل) بلطف على سطح omniplate، والحرص على عدم اختراق سطح أجار. مغادرة وحدة النسخ المتماثل على سطح omniplate لمدة 3-4 ثانية بحيث يتم نقل البكتيريا من دبابيس من النسخ المتماثل على سطح أجار.
  4. إزالة المكرر وتسمح حجم صغير (2-3 ميكرولتر) من ثقافة البكتيرية لاستيعاب في أجار. احتضان omniplates مقلوب ل15-18 ساعة عند 37 درجة مئوية. هذه omniplates يمكن استخدامها في صباح اليوم التالي لتطعيم 96 الثقافات السائل جيدا. بدلا من ذلك، omniplates تحتوي على المستعمرات البكتيرية بين عشية وضحاها ويمكن تخزين ما يصل إلى سبعة أيام في 4 درجات مئوية.
  5. لوحات متماثلة نقل إضافية مكررة، شطف نصائح المكرر مع الماء المعقم وتكرار عملية التعقيم عن طريق وضع المكرر في الإيثانول والمشتعلة مرتين، كما كان من قبل. مرة واحدة للتعقيم، والمكرر يمكن استخدامها على لوحة مكررة المقبل.

4. إعداد البكتيريا لتغذية الديدان

Overview: مستعدون للبكتيريا والديدان تغذية ك 1 مل الثقافات السائل (في شكل جيد 96) باستخدام البكتيريا من omniplates. وتزرع هذه الثقافات بين عشية وضحاها السائل لتوليد الثقافات البكتيرية nonlogarithmic المشبعة. النمو بين عشية وضحاها يضمن أن جميع الثقافات سوف تحتوي على تركيزات مماثلة من البكتيريا وبالتالي سيتم تغذية جميع الديدان نفس الكمية من المواد الغذائية. ينبغي مراعاة عدم فقدان البلازميد أثناء هذا النمو.

  1. الاستغناء 1 مل من وسائط النمو البكتيري في كل بئر من 2 مل العميقة جيدا لوحة 96 جيدا باستخدام pipettor تكرار و 50 مل Combitip.
  2. وضع المكرر معقمة على سطح omniplates تحتوي على المستعمرات البكتيرية التي تم إنشاؤها في الخطوات 3،1-3،6 التأكد من أن دبابيس على اتصال مع كل من المستعمرات البكتيرية 96.
  3. نقل بعناية المكرر من سطح omniplate في لوحة بئر عميقة التأكد من أن المسامير لا تتخلص من الجانبين من الآبار العميقة حتى مغمورة في وسائل الاعلام النمو. نقلالمكرر ببطء في حركة مربع التالية الجدار داخل لوحة بئر عميقة لطرد البكتيريا في وسائط النمو. يجب الحرص على عدم لطخة وعبر تلويث الآبار.
  4. آبار المراقبة: للحصول على كل لوحة الثقافة 96 بئر عميقة جيدا إضافة البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن لبئر واحدة من شأنها أن تكون بمثابة مراقبة إيجابية لالنمط الظاهري ضربة قاضية المتوقعة والتي تحتوي على البكتيريا إضافة الرنا المزدوج الجديلة ناقلات الفارغة (pL4440) كعنصر تحكم السلبية إلى أخرى بشكل جيد . نعيد خط السيطرة البكتيريا مرة واحدة في الأسبوع على لوحات تحتوي على LB التتراسيكلين (15 ميكروغرام / مل) وكربنيسيلين (2 ملغ / مل) بحيث تبقى البكتيريا الطازجة والاحتفاظ البلازميد، معربا عن الرنا المزدوج الجديلة.
  5. باستخدام حلقة عقيمة بتلقيح إزالة مستعمرة واحدة معزولة جيدا من لوحة التحكم (حوالي نفس كمية البكتيريا التي حولتها المكرر) وتطعيم بئر فارغة في صحن عميق الثقافة أيضا. تسجيل موقف من البئر الذي تم تلقيح. بدلا من ذلك، في حلقة مع البكتيريا جويمكن نقلها إلى أنبوب إيبندورف تحتوي على 250 ميكرولتر وسائط النمو، vortexed وتستخدم بعد ذلك لتطعيم العديد من الآبار.
  6. يهز لوحات في آبار عميقة في موقف مستقرا عند 650 دورة في الدقيقة على microshaker (المدار: 3 ملم) عند 37 درجة مئوية خلال الليل. سيتم المشبعة الثقافات من صباح اليوم التالي. بغض النظر، يجب تركيز كربنيسيلين المستخدمة في هذه الثقافات منع فقدان البلازميد.
  7. تحديد الخسارة البلازميد في 1 مل الثقافات بين عشية وضحاها. وسوف تستخدم الثقافات مباشرة لتغذية الديدان للشاشة. من المهم أن أكثر من 80٪ من البكتيريا في كل ثقافة تحتوي على البلازميد الرنا المزدوج الجديلة. تحديد الخسارة البلازميد لثقافتين ممثل وفقا للخطوات 1،1-1،4. التوقع: سوف أكثر من 90٪ من البكتيريا في كل ثقافة تحتوي على البلازميد الرنا المزدوج الجديلة. لاحظنا أبدا فقدان البلازميد كبيرة في هذه الثقافات بين عشية وضحاها حتى عندما نمت إلى التشبع. ومع ذلك، إذا لوحظ فقدان البلازميد كبيرة (> 20٪)، وإعادة تشكيل وسائط النمو باستخدام كربنيسيلين الطازجة ومندوبأكل البروتوكول من الخطوة 4.1. الثقافات يمكن إعادة من omniplates الأصلي طالما أن omniplates أقل من 1-2 أسابيع من العمر.
  8. تستخدم مرة واحدة لبدء 1 مل الثقافات، يتم تخزين omniplates في 4 درجات مئوية حتى يتم الانتهاء من الشاشة، ويمكن استخدامها كمصدر للغذاء لبدء أي الثقافات إعادة الاختبار.
  9. بعد الحضانة بين عشية وضحاها من الثقافات، واستخدام متعدد القنوات 12 قناة ماصة لإزالة 150 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية من لوحة بئر عميقة وإخراج على سطح لوحة التغذية. فمن المهم أن لا يخترق سطح أجار أثناء نقل الديدان سوف تحفر كما ولا تتغذى على البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن. ويمكن أن يتم نقل أربعة آبار في كل مرة (الشكل 1). للقيام بذلك، ضع نصائح ماصة على كل قناة الثالثة للماصة الأقنية (كما أن هناك فقط 4 آبار في الصف في لوحة التغذية). بعد يتم نقل كل مجموعة من 4 آبار، تغيير جديدة، نصائح ماصة معقمة. وسوف كل لوحة 96 ثقافة عميقة جيدا تتطلب 96 نصائحلنقلها إلى ثماني لوحات التغذية 12 جيدا.
  10. متجر لوحات المصنفة تستقيم في ليلة وضحاها مظلمة حتى البكتيريا يمكن أن تمتص في أجار.

5. توليد L1 اعتقل C. ايليجانس يرقات

وتستخدم يرقات القبض L1 لبدء الثقافات دودة متزامنة على لوحات التغذية الرنا المزدوج الجديلة: نظرة عامة. يتم إنشاء هذه اليرقات التي كتبها تبيض السكان البالغين حامل لعزل البويضات السليمة ومن ثم السماح للفقس البيض في وسائل الإعلام S-كاملة دون طعام. في غياب الغذاء اليرقات L1 سوف تحاك اعتقال التنمية، وتوليد السكان متزامن من L1 اليرقات. خلال الشاشة، وإعداد اليرقات-L1 اعتقال جديدة كل أسبوع كما أصبحت هذه الحيوانات تجويع المرضى مع مرور الوقت، ويجب التخلص منها. اختيار الخلفية الوراثية للحيوانات المستخدمة في سلالة التغذية الرنا المزدوج الجديلة يمكن أن تختلف اعتمادا على التطبيق، لشاشات العصبية ERI-1؛ ينصح المسوخ لين-15B.

  1. اختيار 10-20 L4 لاrvae إلى ست لوحات منفصلة تحتوي على NGM حشيش OP50 البكتيريا والانتظار 6-7 أيام حتى لوحات تحتوي على العديد من البيض وضعت حديثا وحامل البالغين.
  2. إزالة الحيوانات والبيض من لوحات وذلك بإضافة 3 مل من الماء إلى السطح من كل لوحة واستخدام إصبع القفاز لإزاحة البيض والبكتيريا والحيوانات من سطح كل لوحة في الماء. تأكد من تغطية جميع المناطق في لوحة، مع إيلاء اهتمام خاص لالعشب البكتيرية. إزالة الماء والبكتيريا والديدان والبيض من كل لوحة باستخدام ماصة الزجاج ونقل إلى أحد العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي.
  3. إضافة 3 مل أخرى من الماء إلى السطح من كل لوحة، pipetting صعودا وهبوطا عبر السطح لإزالة جميع ما تبقى من البكتيريا والديدان والبيض. إضافة هذا المجلد إلى أنبوب 50 مل المخروطية.
  4. تدور في أنبوب مخروطي 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. يجب الديدان والبيض بيليه إلى أسفل الأنبوب ويجب أن تبقى البكتيريا العالقة. نضح بعناية جميع ولكن 4 ملمن السائل من أنبوب ويجري التأكد من تجنب الديدان مكعبات والبيض.
  5. resuspend الكرية دودة في الماء المتبقية ونقل إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي باستخدام ماصة الزجاج. لتبرزي حجم 10 مل مع الماء المعقم.
  6. تدور في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة كما كان من قبل. نضح طاف ترك 200 ميكرولتر المياه حتى لا تعكر صفو بيليه دودة / بيضة.
  7. إضافة 10 مل من الماء إلى المخروطية لغسل الديدان والبيض وتدور كما كان من قبل لإزالة البكتيريا إضافية.

ملاحظة: في الخطوات 5،8-5،11 الديدان ويتعرض البيض لمحلول التبييض. سوف التبييض تدمير الديدان وترك البيض دون أن يمسهم سوء نسبيا. ومع ذلك، إذا ترك البيض في محلول التبييض فترة طويلة جدا، وسوف يتم تدميرها أيضا. تحديد توقيت عند إضافة التبييض في الخطوة 5.8 أن تكون على يقين من أن البيض لا تزال تتعرض لالتبييض لأكثر من 10 دقيقة.

  1. إزالة كافة ولكن 200 ميكرولتر من طاف، ومرة ​​أخرى تجنب بيليه، ثم إضافة 10مل من محلول التبييض وبدء الموقت.
  2. احتضان الديدان والبيض في محلول التبييض لمدة 3-4 دقيقة، والخلط أحيانا من قبل انعكاس. ثم تدور في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية في جهاز للطرد المركزي الطاولة. البحث عن بيليه في أسفل الأنبوب، يجب أن تكون أصغر حجما وأكثر إحكاما من بيليه الأصلي، وربما تأخذ على ظهور اللون الأصفر.
  3. نضح الحل التبييض ترك 200 ميكرولتر وراء ذلك عدم تعكير صفو بيليه.
  4. إضافة 10 مل من محلول التبييض جديدة أخرى وعكس كما كان من قبل. عندما يقرأ توقيت 10 دقيقة، وتدور مرة أخرى ونضح الحل التبييض، وترك 200 ميكرولتر وراء بسرعة وإضافة 10 مل من الماء المعقم. دراسة الحل تحت المجهر تشريح. اليرقات والعديد من البالغين ينبغي أن يذوب في محلول التبييض، وترك معظمهم من البيض وراءها.
  5. تدور كما كان من قبل لمدة 45 ثانية، ومرة ​​أخرى نضح طاف حتى لا تعكر صفو بيليه. وينبغي أن تتضمن هذه بيليه في المقام الأول البيض وسوف تكون فضفاضة جدا.
  6. إضافة anotلها 10 مل من الماء، عكس لخلط، وتدور ونضح ترك القليل من الماء وراءها. فمن المهم لإزالة أكبر قدر ممكن محلول التبييض.
  7. إضافة 4 مل S-كاملة سائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي، resuspend والبيض ونقل إلى العقيمة 100 مل دورق مخروطي سعة. وضع القارورة في الحاضنة 20 درجة مئوية على مجموعة شاكر التحرك كان سريعا بما يكفي للتسبب محتويات القارورة في دوامة. هذا وسوف توفر تهوية كافية لدعم اليرقات L1 عندما تفقس. في غضون 15 ساعة فقط من البيض يجب أن تحاك إنتاج السكان متزامن اليرقات L1 القبض عليه.

وينبغي بذل القبض اليرقات L1 جديدة كل أسبوع خلال الشاشة. مرة واحدة أحرز الدفعة الأولى، يمكن أن تبدأ دفعات لاحقة وذلك بإضافة 500 القبض L1 اليرقات (من دفعة في الأسبوع الماضي) إلى كل من أربعة القياسية المصنفة 6 سم لوحات (التي تحتوي على 100 ميكرولتر الثقافة بين عشية وضحاها من OP50)، وحضنت في 20 ° C لمدة 4 أيام. في اليوم الرابع يجب أن يحتوي على لوحاتيمكن تبييض العديد من البيض والكبار وحامل لإعداد البيض الطازج لأكثر متزامنة اليرقات L1.

6. نقل معتقلين L1 اليرقات على لوحات التغذية

لمحة عامة: لإجراء الشاشة الرنا المزدوج الجديلة، يتم نقل اليرقات 20-30 L1 القبض على لوحات التغذية الرنا المزدوج الجديلة. سيتم وحظت آثار ضربة قاضية في وقت مبكر مثل اعتقال اليرقات أو الفتك بعد أن تغذية الحيوانات على البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن مدة 2-3 أيام. اعتمادا على الشاشة التي أجريت، يمكن ملاحظة الظواهر المطلوب إما في الحيوانات الأصلي وضعت على لوحة التغذية (الحيوانات P0) أو في ذريتها (الحيوانات F1). وعرض النمط الظاهري تعتمد على عدد من المتغيرات بما في ذلك perdurance من البروتين المشفرة بواسطة الجينات التي تم ترسيتها التعبير والوقت خلال التنمية التي تتطلب الجينات في المصالح. وينبغي بدء الرضاعة الثقافات الرنا المزدوج الجديلة مع الحيوانات فقط 20-30 تسمح الملاحظة كل من P0 وF1 الظواهر أمامimals استنفاد مصدر الغذاء.

لسهولة نقل الحيوانات إلى 20-30 لوحات التغذية، أولا تحديد تركيز L1 القبض على الحيوانات في الثقافة L1 القبض عليه.

  1. خلط دورق مخروطي يحتوي على L1 اليرقات القبض على توزيع الحيوانات.
  2. إزالة قسامة 10 ميكرولتر ومكان قطرة من الحكمة على لوحة غير المصنف 6 سم NGM في 4-5 قطرات أسفل وسط لوحة التأكد من أن جميع وسائل الإعلام وطرد من ماصة.
  3. باستخدام نهاية غيض ماصة نشر نقاط من دودة تعليق لتشكيل خط متواصل واحدة من السائل الذي يمتد القطر من لوحة.
  4. باستخدام مجهر تشريح، عد جميع الحيوانات ابتداء من الساعة واحدة من نهاية خط السائل والمتابعة والانتقال إلى الطرف الآخر قبل أن يمتص السائل في لوحة والحيوانات تفريق. قد يتطلب هذا إعادة التركيز المستمر لنطاق تشريح للتأكد من أن يتم إهمال أي الحيوانات.
  5. كرر هذا لمدة ثلاثة 10 ميكرولتر منفصلةمأخوذة ومتوسط ​​الأرقام الثلاثة لتحديد متوسط ​​عدد الديدان في ميكرولتر من دودة التعليق وتسجيل هذا الرقم مباشرة على قارورة مخروطي.

7. تبدأ شاشة التغذية

لمحة عامة: لتبدأ الشاشة الرنا المزدوج الجديلة، تضاف 20-30 القبض على اليرقات L1 إلى كل بئر من 12 جيدا لوحات التغذية التي تحتوي على العشب رقيقة من البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن. لوحات تغذية تحتوي على معيار وسائط النمو الخيطية (NGM) وتستكمل مع 500 ميكروغرام / مل كربنيسيلين (لمنع فقدان البلازميد) و 1 ملي IPTG (للحث على التعبير الرنا المزدوج الجديلة). ويسمح لإطعام الحيوانات وتطوير لعدة أيام في 20 درجة مئوية. نظامين التغذية نموذجية للحيوانات هي 3 أيام عند أداء شاشة P0 و6-7 أيام عند إجراء الشاشة F1. مدة الرضاعة، ومع ذلك، يمكن أن تختلف تبعا للالظواهر محددة سعى في الشاشة.

  1. استخدام تعليق اليرقات L1 اعتقال والماء المعقم لإعداد ذلكlution تحتوي على 2،000 الديدان / مل. وسوف كل لوحة التغذية 12 جيدا تتطلب 120 ميكرولتر من تعليق هذه الدودة. مزيج دقيق لضمان التوزيع حتى من الحيوانات ونقل الحيوانات إلى خزان معقم للpipetting ل.
  2. باستخدام ماصة الأقنية اقامة مع نصائح في كل موقف الثالث (انظر الشكل 1) نقل 10 ميكرولتر من الحل دودة مباشرة على العشب البكتيريا من لوحات التغذية. والحرص على عدم اختراق سطح آغار، والديدان سوف تحفر في أجار وليس تتغذى على البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن.
  3. التعديل الحل دودة في الخزان (قبل الخوض برفق حول) بعد كل صفين من لوحات التغذية، والديدان تسوية بسرعة. تواصل الاستغناء تعليق دودة حتى يكون جميع لوحات التغذية الديدان. دراسة عدد قليل من الآبار في وقت مبكر تحت نطاق تشريح للتأكد من أن كل بئر هو الحصول على 20-30 الديدان.
  4. متجر لوحات تستقيم في مربع مرطب في حاضنة 20 درجة مئوية. في اليوم التالي، وبعد التعليم الجامعيوقد استوعبت جمهورية مقدونيا تعليق في لوحة، عكس لوحات والعودة إلى هوميدور عند 20 درجة مئوية. الحيوانات على هذه اللوحات يمكن ملاحظتها بعد 3 أيام (على الظواهر P0) ومرة ​​أخرى بعد 6 أيام (للالظواهر F1).

ملاحظة: لقد تم اختبار البكتيريا التي تبقى على لوحة التغذية بعد 7 أيام من النمو دودة لفقدان البلازميد واحتفظ ما يقرب من 100٪ البلازميد الرنا المزدوج الجديلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ستبدأ P0 الظواهر ضربة قاضية لتظهر بعد 2-3 أيام من تغذية الحيوانات الرنا المزدوج الجديلة معربا عن البكتيريا. وتشمل بعض الظواهر في وقت مبكر اعتقال اليرقات والفتك وينبغي التقيد في 2-3٪ من جميع الآبار التغذية. كما سيتم لاحظ هذه الظواهر نفسها في حيوانات الجيل F1. وجود البيض F1 التي لا يفقس هو النمط الظاهري F1 مشتركة أخرى، ومعا، وسيتبع هذه الظواهر الثلاث في ما يقرب من 10٪ من جميع الآبار في شاشات F1.

استخدمنا بروتوكول ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفناها البروتوكول الذي يستخدم مكتبة التغذية الرنا المزدوج الجديلة المتاحة تجاريا لأداء شاشات واسعة النطاق في C. ايليجانس. نحن نقدم جميع التعليمات لتكرار المكتبة واستخدامها بفعالية. علينا أن نظهر أن هذا النهج قادر على تحديد الجينات المسؤولة عن العمليات البيولوجية المختلفة في أنسجة مختلفة من الحيوانات. في حين أن الظواهر وصفنا هنا يمكن ملاحظتها بسهولة (UNC، جي، وDpy)، هذا البروتوكول يمكن تكييفها للبحث عن الجينات اللازمة لأي ما يقرب من العملية البيولوجية. على سبيل المثال، وق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعاهد الوطنية للصحة MH097163. وقدمت بعض سلالات من قبل CGC، الذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة مكتب برامج البنية التحتية للبحوث (P40-OD010440).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>كاشف / مادة< / قوي
>96-well Falcon لوحة مسطحة القاع فيشر Scientific353072
رقائق لاصقةمعقمة الولايات المتحدة الأمريكية Scientific 2923-0100
Nunc omniplateFisher Scientific267060
2.0 مل عميق 96 بئر من مادة البولي بروبيلين ماستربلوك الولايات المتحدة الأمريكية العلمية5678-0285أغطية قابلة للتعقيم
لألواح الآبار العميقة الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية5665-6101
50 مل combitipsالولايات المتحدة الأمريكية العلمية4796-5000ملفوفة بشكل فردي
خزانالولايات المتحدة الأمريكية العلمية2977-8500ألواح قابلة للتعقيم
بتقنية التعقيم 12 بئر الولاياتالمتحدة الأمريكية العلميةCC7682-7512ملفوفة بشكل فردي
مكتبة تغذية dsRNAOpenBiosystemsمتجر RCE1181-80 درجة ؛ C
أمبيسلينفيشر ScientificBP1760-5
التتراسيكلينفيشر ScientificBP912-100
Carbenicillinيسمح 2-4 أسابيع للتسليم www.biochemicaldirect.com< / a>
Bacteriolgical Agar Ultra Pure grade A Affymetrix10906لألواح
براير الأسطوانةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية9127-2940
B & # 8211 ؛ كيل 96 دبوس النسخ المتماثلفيشر ساينتفيك05-450-9قابل للتعقيم
توماس سيانتمايك1231A933 مم مدار
12 قناة ماصة متعددة القنوات (0.5-10 & ل)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية7112-0510
12 قناة ماصة متعددة القنوات (30-300 مو ؛ ل)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية7112-3300
مكرر بالإضافة إلى الماصة اليدويةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية4026-0201
الدودة < TD colspan = "4" >< قوي > المعدات < / قوي > ميكروشاكر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  4. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  5. Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
  6. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  7. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  8. Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
  9. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
  10. Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
  12. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
  13. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
  15. Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
  16. Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
  17. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
  18. Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
  19. Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
  20. Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
  21. Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
  22. Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
  24. Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
  25. Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831(2012).
  26. Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة