Method Article

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

DOI:

10.3791/50708

⸱

August 7th, 2013

 , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة تحليلية لتقدير عمر الغلوتامات في الأغشية نجمي من التسجيلات الكهربية من التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتوجد أعلى كثافة من نقل الغلوتامات في الدماغ في الخلايا النجمية. الغلوتامات زوجين نقل الحركة من الغلوتامات عبر الغشاء مع الرئيسين نقل 3 نا + و 1 H + ومكافحة نقل 1 K +. يمكن رصد التيار القياس المتكافئ التي تم إنشاؤها بواسطة عملية النقل مع خلية كاملة التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية. يتشكل مدار الساعة من الحالية التي سجلتها مدار الساعة من الملف الشخصي الغلوتامات تركيز التي تتعرض لها الخلايا النجمية، حركية نقل الغلوتامات، وخصائص تيار كهربي السلبي للأغشية نجمي. نحن هنا وصف الطرق التجريبية والتحليلية التي يمكن استخدامها لتسجيل التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية وعزل بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من جميع العوامل الأخرى التي تشكل الموجي من التيارات نقل نجمي. الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم لتقدير مدى الحياة سو فلاش uncaged وsynaptically صدر الغلوتامات في الأغشية نجمي في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي أثناء الصحة والمرض.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا النجمية هي واحدة من أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ مع على شكل نجمة التشكل ونتوءات غشاء غرامة التي تمتد في جميع أنحاء neuropil وتصل المجاورة اتصالات متشابك 1،2. هي معبأة غشاء الخلية في الخلايا النجمية "مكتظة مع جزيئات نقل الغلوتامات 3. في ظل الظروف الفسيولوجية، نقل الغلوتامات ربط بسرعة الغلوتامات في الجانب خارج الخلية من غشاء وتحويلها إلى السيتوبلازم الخلية. من خلال القيام بذلك، ونقل حفاظ على انخفاض تركيز القاعدية من الغلوتامات في الفضاء خارج الخلية 4. يتم وضع نقل الغلوتامات في عمليات نجمي غرامة المتاخمة لاستثاري نقاط الاشتباك العصبي في مكان مثالي لربط الغلوتامات صدر خلال الأحداث متش....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد شريحة

  1. إعداد 500 مل تشريح الحل / التخزين التي تحتوي على (مم): 119 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 0.5 و CaCl 2، 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O، 4 MgCl 2، 26.2 NaHCO 3، 1 ناه ​​2 ص 4، و 22 الجلوكوز، 320 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 7.4
  2. استخدام كوب 250 مل لإعداد غرفة الانغمار لشرائح، وملء مع تشريح الحل / تخزين 200 مل، الحارة في حمام الماء عند 34 درجة مئوية، وفقاعة مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نجاح النهج التحليلي الموصوفة هنا يتوقف بصورة حاسمة على الحصول على التسجيلات الكهربية ذات جودة عالية من التيارات نقل من الخلايا النجمية في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي. في الماوس شرائح الحصين الحادة، والخلايا النجمية يمكن تحديدها بسهولة تحت Dodt إضاءة أو IR-DIC لما لها من جسم الخلية الصغيرة (O = 10 ميكرون) ونواة بارزة (الشكل 1). يمكن تقدير المميز على شكل نجمة التشكل مع epifluorescence، متحد البؤر، أو ليزر ثنائي الفوتون المجهر، عند إضافة fluorophore مثل اليكسا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف نهج تجريبي للحصول على التسجيلات الكهربية من الخلايا النجمية، بروتوكول التحليلية لعزل التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية وطريقة رياضية لاشتقاق بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من التيارات نقل نجمي.

نجاح التحليل يعتمد على القدرة على الحصول على نوعية عالية تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا النجمية وعلى دقة خوارزميات المناسب يستخدم لوصف التيارات نقل. يعتمد التحليل deconvolution على الافتراضات التالية.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية برنامج بحوث جماعية (NS002986). كما كتب مخطوطة وتنفيذ تحليل deconvolution. وضعت دكتوراه النسخة الأولية من تحليل deconvolution وعلق على النص.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CGP52432Tocris1246
(R ، S < / em>) -CPPTocris173
DPCPXTocris439
LY341495 ملح ثنائي الصوديومTocris4062
MSOPTocris803
NBQX ملح ثنائي الصوديومTocris1044
D ، L-TBOIATocis1223
PicrotoxinSigmaP1675
MNI-L-glutamateTocris1490
Alexa 594Life TechnologiesA10438
أقطاب مصفوفةشركة فريدريك هيرMX21AES (JD3)
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتWorld Precision InstrumentsPG10165-4
مجتذب ماصة زجاجية صغيرة مزدوجةالمرحلة NarishigePC-10
Loctite 404 لاصق فوريTed Pella46551
Xe lampRapp OptoElectronicFlashMic
Igor Pro 6Wavemetrics
اختيارية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glutamate ClearanceAstrocytic Transporter CurrentsDeconvolution AnalysisWhole cell Patch clampTBOA AntagonistSynaptic StimulationBrain Slice PreparationElectrophysiology RecordingsTransporter Current IsolationFlash uncaged Glutamate

Related Articles