Method Article

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

DOI:

10.3791/50729

⸱

September 5th, 2013

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. وتشمل البروتوكولات الحالية لمعالجة هذه الأسئلة فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. العد مستعمرة وحماية الجنتاميسين فحوصات تقييم الجدوى فقط من السكان البكتيرية كامل وغير قادر على تحديد الجدوى البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام المجهر الإلكتروني لتحديد الجدوى من البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن التوطين في الخلايا المضيفة. ومع ذلك، في كثير من الأحيان بكتيريا عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات، مما يجعل من الصعب تقييم الجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة. وقد وضعت هذه المقايسات أصلا لتقييم بقاء النيسرية البنية في العدلات الإنسان الأساسية، ولكن ينبغي أن يكونpplicable إلى أي تفاعل الخلية البكتيريا في استضافة. الجمع بين هذه البروتوكولات الأصباغ الفلورية غشاء نفاذية (SYTO9 و4 '،6-diamidino-2-phenylindole [دابي])، والتي وصمة عار جميع البكتيريا، مع الأصباغ غشاء كتيمة الفلورسنت (يوديد propidium وSYTOX الأخضر)، والتي يمكن الوصول إليها فقط ل البكتيريا غير قابل للحياة. قبل permeabilization الخلية حقيقية النواة، يتم إضافة الجسم المضاد أو كاشف الفلورسنت لتحديد البكتيريا خارج الخلية. وبالتالي هذه المقايسات تميز جدوى من البكتيريا تمسكا وداخل الخلايا حقيقية النواة. ويرد البروتوكول أيضا لاستخدام الأصباغ جدوى في تركيبة مع الأجسام المضادة لعلامات الفلورسنت خلية حقيقية النواة، من أجل تحديد توطين التحت خلوية من البكتيريا الفردية. الأصباغ البكتيرية الجدوى مناقشتها في هذه المقالة هي تكملة الحساسة و / أو بديل لتقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية لتقييم جدوى البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن مكان البقاء على قيد الحياة البكتيريا في الخلية المضيفةق.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك ديناميكية التفاعل والتطور المشترك بين البكتيريا والمضيفين التي يقيمون فيها. وقد تطورت البكتيريا العضيات الالتزام، ونظم إفراز و / أو القدرة على إنتاج السموم التي تمكن العدوى الإنتاجية الخاصة بهم من أكلة المضيف والخلايا غير البلعمية. يجب على البكتيريا أيضا يتعامل مع الاعتراف والأنشطة المضادة للميكروبات الجهاز المناعي المضيف. ويتألف الجهاز المناعي مجموعة من المكونات الفطرية والتكيفية بما في ذلك الحواجز الفيزيائية والكيميائية، الخلايا المناعية، ونظام مكمل، وغيرها من عناصر الحصانة الخلطية. بينما العديد من أنواع البكتيريا هي عرضة للقتل والتطهير من قبل المضيف المناعي استجابة متعددة الطبقات، تطورت بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تقييم البكتيرية الجدوى مع يوديد propidium وSYTO9

  1. تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا من الفائدة. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية.
  2. شطف بلطف خلايا مرة واحدة في 0.1 م 3 - (N-morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف)، ودرجة الحموضة 7.2، يحتوي على 1 ملم MgCl 2 (اجتماعات الأطراف / MgCl 2).
  3. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام البروتوكولات المحددة لدراسة بقاء N. البنية بعد التعرض لالإنسان الأساسية العدلات 5،26. أصيب العدلات مع N. البنية ومعالجتها مع بروتوكول 1، وذلك باستخدام الخضراء الفلورسنت SYTO9 الجدوى صبغ والحمراء الفلورسنت يوديد propidium (الشكل 4A). أضيفت الأصباغ في وجود سابونين، والتي تعزل الكولسترول لpermeabilize تفضيلي أغشية البلازما الخلية المضيفة، وليس N. الأغشية البنية. قد تحتاج المنظفات الأخرى لفحصها إذا أغشية البكتي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقدمة هنا نوعان من البروتوكولات التي تستخدم الحمض النووي ملزمة والأصباغ جدوى بالتزامن مع كتين الفلورسنت لتحديد البكتيريا الحية والميتة وتعلق داخل الخلايا البشرية. لأن كلا من بروتوكولات تميز بفعالية الحية من البكتيريا الميتة، واختيار أي بروتوكول لاستخدام يعتمد على الهدف من التجربة. يستخدم بروتوكول الأولى يوديد propidium للكشف عن البكتيريا غير قابل للحياة وSYTO9 للكشف عن البكتيريا سليمة. هو مبين في الشكل 4A هي صورة ممثل البروتوكول 1 ينطبق على العدلات الإنسان المصا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بنك آسيا سميرنوف ولورا Gonyar لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وأيد منح R00 R01 TW008042 وAI097312 لAKCMBJ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة AI007046 T32.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
21 جم 3/4 إبر فراشة لجمع الدمBecton Dickinson367251 
أنابيب جمع الدم مع هيبارين الصوديوم 10 ملبكتون ديكنسون366480 
مياه معقمة للريباكستر07-09-64-070 
ديكستران 500سيجما31392 
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS641& nbsp ؛
سكر العنبريكا للكيماوياتRDCD0200 
Dulbecco's PBS no Ca2+ أو Mg2+Thermo ScientificSH3002802 
حل FicollGE Healthcare17-1440-03 
حمض الخليكفيشر العلميBP2401 
أغطية زجاجية دائرية مقاس 12 ممفيشر ساینتيفك12-545-80 12CIR-1 
لوحات 24 بئر CorningIncorporated3524  ؛
مصل بشري مجمعةسيجماS7023  ؛
RPMIMediatech15-040-CV 
مصل الأبقار الجنينيThermo ScientificSH3007103 
إنترلوكين -8 R& D Systems208-IL / CF  ؛
MOPSSigmaM3183 
MgCl2Fisher ScientificBP214 
بروبيديوم يوديدلايف تكنولوجيزL7007 أو L7012  ؛
SYTO9Life TechnologiesL7007 أو L7012 
سابونينفلوكا التحليلية47036 
Alexa Fluor 647 مقترنة بفول الصويا ليكتينLife TechnologiesL-32463  ؛
DAPISigmaD8417 
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020 
الفأر المضاد ل CD63الدراسات التنموية بنك الورم الهجينH5C6& nbsp ؛
Alexa Fluor 555 طقم وضع العلامات على الأجسام المضادةLife TechnologiesA20187 
مقياس الدم برايت لاينهاوسر العلمي1492 
ملقطEMS78320  ;
سورفال ليجند RT + الطردالمركزي الحراري العلمي75004377 
شركة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77(2011).
  3. Simons, M. P., Nausee....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyBacterial ViabilityHost Cell AssociationMembrane PermeabilityPropidium IodideSYTO9 DyeSubcellular LocalizationExtracellular BacteriaIntracellular BacteriaViability Dyes

Related Articles