Method Article

الخلايا الجذعية العلاجية البرمجة لتكوين الأوعية الدموية عن طريق تحلل البوليمر النانوية

DOI:

10.3791/50736

⸱

September 27th, 2013

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University , 2Department of Bioengineering, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة برمجة الخلايا الجذعية لoverexpress العوامل العلاجية لتكوين الأوعية الدموية باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل. وتشمل العمليات المذكورة التوليف البوليمر، بنقل العدوى إلى خلايا الجذعية المشتقة الدهنية في المختبر، والتحقق من صحة فعالية الخلايا الجذعية المبرمجة لتعزيز الأوعية الدموية في الفئران hindlimb نموذج نقص التروية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحكم في نمو الأوعية الدموية هو أمر حاسم لنجاح تجديد الأنسجة والتئام الجروح، وكذلك لعلاج الأمراض الدماغية مثل السكتة الدماغية والنوبات القلبية أو أمراض الشرايين الطرفية. النقل المباشر للعوامل النمو عائية لديه القدرة على تحفيز نمو أوعية دموية جديدة، ولكن كثيرا ما يرتبط مع القيود مثل عدم وجود استهداف ونصف العمر القصير في الجسم الحي. يوفر العلاج الجيني نهج بديل عن طريق تقديم الجينات ترميز العوامل عائية، ولكن غالبا ما يتطلب استخدام فيروس، ومحدودة بسبب مخاوف تتعلق بالسلامة. نحن هنا تصف استراتيجية وضعت مؤخرا لتحفيز النمو عن طريق الأوعية الدموية إلى الخلايا الجذعية البرمجة overexpress العوامل عائية في الموقع باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل. على وجه التحديد استخدام استراتيجيتنا الخلايا الجذعية كوسائل التسليم عن طريق الاستفادة من قدرتهم على الهجرة نحو الأنسجة الدماغية في الجسم الحي. باستخدام ناقلات البوليمرية الأمثل، والمستمدة الدهنية-تم تعديل الخلايا الجذعية لoverexpress الجينات عائية ترميز عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). وصفنا العمليات لتخليق البوليمر، وتشكيل جسيمات متناهية الصغر، الجذعية بنقل العدوى إلى خلايا في المختبر، فضلا عن أساليب للتحقق من صحة فعالية الخلايا الجذعية، معربا عن VEGF لتعزيز الأوعية الدموية في الفئران hindlimb نموذج نقص التروية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف العام من هذه التقنية هو تعزيز الأوعية الدموية العلاجية باستخدام الخلايا الجذعية المبرمجة غير فيروسي overexpressing العوامل العلاجية في موقع نقص التروية. تم تعديل الخلايا الجذعية خارج الحي الأولى باستخدام الجسيمات النانوية القابلة للتحلل تصنيعه في المختبر، ومن ثم زرعها في نموذج الفئران من hindlimb نقص التروية للتحقق من صحة إمكاناتها لتعزيز الأوعية الدموية والأنسجة إنقاذ.

التحكم في نمو الأوعية الدموية هو عنصر هام من عناصر نجاح تجديد الأنسجة، وكذلك لعلاج مختلف الأمراض الدماغية مثل السكتة الدماغية ونقص تروية الأطراف، واحتشاء عضلة القلب. وقد وضعت عدة استراتيجيات لتعزيز النمو الأوعية الدموية، بما في ذلك تسليم عامل نمو والعلاج القائم على الخلية. 1 على الرغم من فعالية لوحظ في نماذج الأمراض الحيوانية، وهذه الأساليب لا تزال تواجه القيود مثل ضرورة لجرعات supraphysiological للتسليم عامل النمو، أو عدم كفاية نظير الصماويالافراج من قبل خلايا وحدها. استراتيجية واحدة القدرة على التغلب على القيود أعلاه هو الجمع بين العلاج بالخلايا الجذعية والعلاج الجيني، حيث يتم برمجة الخلايا الجذعية وراثيا خارج الحي قبل الزرع إلى overexpress العوامل العلاجية مرغوب فيه. وقد تجلى هذا النهج في نماذج مختلفة بما في ذلك مرض نقص التروية hindlimb 2، 3 أمراض القلب والعظام الشفاء وإصابة 4 5 العصبية، الخ. ومع ذلك، فإن معظم تقنيات العلاج الجيني تعتمد على ناقلات فيروسية، والتي ترتبط مع مخاوف تتعلق بالسلامة مثل المناعية المحتملة والطفرات إقحامي. الحيوية بوساطة توصيل الجينات غير الفيروسية قد تغلب على هذه القيود، ولكن غالبا ما يعانون من انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن. لتسريع اكتشاف الحيوية رواية لكفاءة توصيل الجينات غير الفيروسية، واستخدمت دراسات حديثة الكيمياء اندماجي ونهج الفرز الفائق الإنتاجية. المكتبات بوليمر القابلة للتحلل مثل بولي (ES-β الأمينيةوقد وضعت النسب) (PBAE) وفرزهم، والتي أدت إلى اكتشاف البوليمرات الرائدة بشكل ملحوظ مع تعزيز كفاءة ترنسفكأيشن بالمقارنة مع نظيراتها التقليدية ناقلات البوليمرية. 6-7

هنا، نحن تصف تركيب PBAE والتحقق من قدرتها على بالنقل الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية (ADSCs) في المختبر، تليها زرع اللاحقة من ADSCs المعدلة وراثيا overexpressing عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) في نموذج الفئران من نقص التروية hindlimb . وتم تقييم نتائج من خلال تتبع مصير الخلية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي، وتقييم ضخه الأنسجة باستخدام الليزر دوبلر نضح التصوير (LDPI)، وتحديد الأوعية الدموية والأنسجة إنقاذ من قبل الأنسجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البوليمر التجميعي

  1. في غطاء الدخان، تزن من 3،523 ملغ من diacrylate بيوتانديول (C) ونقل إلى قارورة زجاجية تحتوي على التلألؤ بقضيب.
  2. قبل الحرارة 5 الأمينية-1-pentanol (32) إلى 90 درجة مئوية إلى ذوبان الملح، ثم في غطاء الدخان، تزن 1،533 ملغ من 32 وإضافة إلى قارورة التلألؤ تحتوي على C. هذا الأسلوب سوف يؤدي إلى نسبة المولي من C: 32 = 1:1.2.
  3. وضع على الفور القارورة تحتوي على كل الحلول على طبق من ذهب ضجة. تعيين سرعة ضجة في 600 دورة في الدقيقة.
  4. نقل قارورة التلألؤ إلى فرن وضعت في 90 درجة مئوية. تعيين سرعة التحريك إلى 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة. إذا كان يحصل على تمسك بقضيب، وانخفاض سرعة. بعد 4 ساعات، وانخفاض سرعة 300 دورة في الدقيقة لوالحفاظ على 90 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة أخرى.
  5. إضافة 5 غرام من C32 إلى 10 مل من رباعي هيدرو الفوران اللامائية (THF) في قارورة زجاجية تحتوي على التلألؤ بقضيب. التفاف في احباط ودوامة على ارتفاع حتى يذوب تماما.
  6. في كوب التلألؤ قارورة كونتا منفصلةining بقضيب، إضافة 10 ملم من Tetraethyleneglycoldiamine (122). إضافة 40 مل من THF.
  7. وضع كل من قوارير (C32 و 122) على طبق من ضجة لمدة 5 دقائق ثم تجمع معا. تغطية في احباط وترك في درجة حرارة الغرفة اثارة في 400 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. ويطلق على المنتج النهائي C32-122.
  8. تزن من 5 × 50 مل أنابيب فالكون لكل 5 ز دفعة من C32-122. لاحظ كتلة كل أنبوب في جهاز كمبيوتر محمول.
  9. نقل 30 مل من ايثر اللامائية إلى كل أنبوب 50 مل فالكون.
  10. نقل 10 مل من C32-122 لكل 50 مل أنبوب فالكون.
  11. أنابيب دوامة فالكون ثم بقوة الطرد المركزي في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: سوف البوليمر استخراج جمع عند قاعدة الأنبوب.
  12. تجاهل الحل العلوي وكرر الخطوات من 1.9 و 1.11 مرتين أخريين.
  13. وضع أنابيب مفتوحة تحتوي على استخراج C32-122 في المجفف وفراغ بين عشية وضحاها. محمية ضمان جميع الأنابيب من الضوء.
  14. تزن كل أنابيب تحتوي على C32-122 لتحديد كتلة النهائية للالبوليمر المستخرج.
  15. حل البوليمر المستخرجة في DMSO اللامائية بتركيز 100 ملغ / مل.
  16. تخزين البوليمر الذائب في -20 ° C محمية من الضوء والرطوبة.

2. البذر الخلية

  1. ما قبل معطف قاعدة من T-150 قارورة زراعة الأنسجة مع 0.1٪ (وزن / المجلد) الجيلاتين. ينبغي أن تظل الجيلاتين في قارورة لمدة 30-45 دقيقة. طلاء الجيلاتين يساعد التصاق ADSCs.
  2. نضح الجيلاتين من قبل المغلفة T-150 قارورة.
  3. إضافة 4 × 10 6 ADSCs (≤ مرور 3) إلى القارورة في 20 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين و 10 نانوغرام / مل bFGF.
  4. ضع قارورة T-150 في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
  5. يبدأ الإجراء ترنسفكأيشن في اليوم التالي.

3. تحضير جسيمات متناهية الصغر وترنسفكأيشن

  1. الإجراء التالي هو لإعداد النانوية التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد 16.1 ميكروغرام لكل1.0 × 10 6 خلايا في البوليمر لالبلازميد نسبة وزن 30:1.
  2. تمييع DNA البلازميد (1 ملغ / مل، pVEGF165، ND، الولايات المتحدة الأمريكية Aldevron) إلى تركيز النهائي من 120 ميكروغرام / مل في خلات الصوديوم (25 ملم) في أنبوب 15 مل الصقر.
  3. تمييع C32-122 (100 ملغ / مل) إلى تركيز النهائي من 3.6 ملغ / مل في خلات الصوديوم (25 ملم) في الثانية 15 مل أنبوب فالكون.
  4. الجمع بين محتويات كل أنابيب فالكون في واحدة 15 مل أنبوب الصقر ودوامة فورا على ارتفاع لمدة 10 ثانية.
  5. السماح للأنبوب الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لتكوين جسيمات متناهية الصغر تحدث.
  6. في حين يحتضنها، استبدال المتوسطة في زراعة الأنسجة قارورة مع DMEM تستكمل 7.8 مل بالكامل في 1.0 × 10 6 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
  7. نقل الحل جسيمات متناهية الصغر إلى قارورة زراعة الأنسجة والميل إلى الأمام وإلى الوراء لنشر بالتساوي.
  8. ضع قارورة الثقافة الأنسجة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة.
  9. بعد 2 ساعة، استبدال nanoparticle تحتوي على وسائل الاعلام مع DMEM.
  10. بعد حضانة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، والخلايا جاهزة للحقن في الجسم الحي.

4. Hindlimb نقص التروية الداخلي

  1. أجريت جميع التجارب وفقا لجامعة ستانفورد إرشادات جنة رعاية الحيوان واستخدام وافق بروتوكولات APLAC. توليد نموذج الفئران من hindlimb نقص التروية يتم تنفيذ كما هو موضح سابقا. 8 يرجى الرجوع إلى المرجع للحصول على تعليمات مفصلة. ويرد وصف موجز أدناه.
  2. ضع الماوس تحت التخدير مع 1-3٪ isoflurane والدواء عن طريق الاستنشاق والأكسجين معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة. ضمان عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص القدمين، وانخفاض في معدل التنفس، والخمول.
  3. إزالة الشعر من منطقة البطن وكل من المناطق hindlimb من الفأرة مع كريم الحلاقة.
  4. جعل شق في مركز وسطي الفخذ نحو خط الوسط ومن ثم قطع طريق المغطي منصة الدهون لالسابقينتشكل الشريان الفخذي.
  5. Ligate الشريان في موقعين: موقع القاصي (قريبة إلى الركبة) وموقع الداني (فقط البعيدة إلى الرباط الأربي).
  6. لإنشاء عملية ربط، فصل الشريان من الوريد وخيط من الحرير خياطة 5-0 حول الشريان. ربط قبالة الشريان مع اثنين من عقدة لجعل ربط.
  7. إزالة الشريان بين النقطتين ربط.
  8. غسل المنطقة الجراحية مع برنامج تلفزيوني ثم خياطة شق مغلقة.
  9. ويمكن الآن إزالة التخدير. إبقاء الحارة الماوس حتى إعادة الصحوة. للحصول على الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، 2-4 ملغ / كغ يدوكائين يمكن حقنها تحت الجلد في موقع شق قبل إعادة الصحوة. ويمكن أن تشمل مزيدا من إدارة الألم تسليم تحت الجلد من 0.05-0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين في 12 و 24 ساعة. رصد الحالة الصحية للالفئران مرة واحدة في اليوم لمدة سبعة أيام من خلال مراقبة التغيرات في نمط التنفس، وألم العلني أو الشدة، ولون البشرة.
  10. تأكيد hindlimb نقص التروية بواسطة الليزر دوبلر التصوير التروية.

5. حقن الخلايا

  1. عندما الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل والفئران مستعدون، وغسل الخلايا transfected مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين، الطرد المركزي، ومن ثم الاعتماد.
  2. الخلايا resuspend في مناطق ذات كثافة من 10 × 10 6 خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني.
  3. يجب فصل تعليق خلية في أنابيب إيبندورف منفصلة في حجم 110 ميكرولتر. وهذا يضمن أن كل الماوس يتلقى مبلغ مساو من الخلايا.
  4. وضع كل الماوس تحت التخدير (2.5٪ isoflurane و، 1 لتر / دقيقة معدل تدفق الأكسجين).
  5. تنظيف موقع الحقن مع مناديل الكحول.
  6. الاستفادة من وجود حقنة السلين 27 G، واستخلاص الخلايا صعودا وهبوطا في حقنة لضمان تحقيق وقف متجانسة. وضع 100 ميكرولتر من تعليق خلية في حجم الحقنة.
  7. حقن نصف تعليق خلية في المنطقة العضلة الضامة ومن ثم حقن النصف الآخر في منطقة عضلة ربلة الساق. على طريق الحقن، وترك الحقنة في مكان ما لا يقل عن 15-30 ثانية لمنع تسرب تعليق الخلية.
  8. الضوابط المناسبة لدراسة الحيوان ما يلي: 1) الخلايا transfected مع البلازميد غير الترميز (مثل البلازميد مع عدم وجود نشاط بيولوجي)، 2) الخلايا وحدها، و 3) برنامج تلفزيوني.
  9. عندما تكون كاملة الحقن، وإزالة الماوس من التخدير والدفء حتى الماوس إعادة يستيقظ.

6. التصوير تلألؤ بيولوجي

  1. لبدء التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، تخدير الفئران كما هو موضح أعلاه.
  2. تنظيف موقع الحقن مع مناديل الكحول.
  3. استخدام حقنة الأنسولين، تحميل 100 ميكرولتر من 15 ملغ / مل D-وسيفيرين (الركيزة ليراعة luciferase). الحفاظ على الركيزة بعيدا عن الضوء.
  4. الحقن داخل الصفاق لأداء، وعقد الفئران عن طريق الجلد من ظهورهم لسحب بشرتهم الأمامي مشدود. إدراج إبرة الغشاء البريتونى في منطقة البطن وحقن 100 ميكرولتر من الركيزة.
  5. ضع الماوس في غرفة التصوير IVIS luciferase المراسل تحت التخدير.
    6. صورة الفئران مع ومدة التعرض من 1.0 دقيقة. عندما يتم تعيين المعلمات، والبدء في الحصول على صور.
  6. عندما يتم الحصول على الصورة، بمناسبة المنطقة من اهتمام لقياس إشارة luciferase المراسل. في هذه الحالة، بمناسبة أطرافهم الدماغية في موقع الخلية الحقن.
  7. مواصلة لقياس إشارة luciferase المراسل كل 3-5 دقيقة حتى تصل إلى إشارة الذروة ويبدأ في الانخفاض. هذه هي القيمة المستخدمة للمقارنة عبر الفئران وعلى مدى عدة نقاط زمنية.
  8. عندما كاملة، وإزالة الفئران من غرفة والتخدير. الحفاظ على الفئران دافئ حتى إعادة الصحوة.

7. الليزر دوبلر الإرواء التصوير

  1. يتم إجراء دوبلر الليزر التصوير نضح كما هو موضح سابقا. 8 يوصف هذا الإجراء لفترة وجيزة هنا.
  2. قبل التصوير دوبلر يجب أن يكون الماوس حليق نظيفة في المناطق التي تغمر كل من hindlimbs ومنطقة البطن لمنع القطع الأثرية بسبب الشعر.
  3. عندما أعدت لدوبلر الصورة، ومذكرة التفاهمحد ذاته وينبغي تخدير كما هو موضح أعلاه.
  4. تدفئة الماوس إلى 36 درجة مئوية على طبق ساخن في حين رصد درجة حرارة الجسم عن طريق ترمومتر المستقيم.
  5. وضع الماوس على سطح غير عاكس أسود والحفاظ على تخدير بواسطة مخروط الأنف. يجب وضع الماوس على السطح الظهري مع أطرافه تتعرض بالتساوي.
  6. وضع جهاز استشعار ليزر دوبلر ما يقرب من 15 سم فوق الماوس وتوجيه مؤشر ليزر من أجهزة الاستشعار نحو المنطقة الأربية من الفأرة.
  7. عندما الماوس وأجهزة الاستشعار دوبلر في موقف والصور التي يمكن اتخاذها الاستفادة من البرامج LDPIwin عن طريق الضغط على زر ابدأ.
  8. يمكن أن تؤخذ القياسات نضح النسبي الذي يدل على حد سواء hindlimbs (الدماغية وغير الدماغية) والمنطقة من المصالح (ROI). فإن نسبة نضح المتوسط ​​من الدماغية إلى hindlimb غير الدماغية تشير نضح النسبية.

8. الأنسجة الحصاد الداخلي

  1. عندما أعدت لحصاد الماوس تيسرفع دعوى لالأنسجة و / أو المعالجة الكيميائية الحيوية، ينبغي أن يتم التخلص الماوس. هنا، هو الموت الرحيم الماوس من خلال تعريض إلى 5٪ لمدة 3-5 دقيقة isoflurane و، ثم القتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. قطع الجلد المغطي المحيطة hindlimb محيطي في منطقة البطن القاصي والداني إلى hindlimb. يتم قطع الجلد من بطني إلى السطوح الظهرية، مثل أن الجلد يمكن سحبها إلى الوراء على مدى hindlimb في القدم.
  3. عند سحب الجلد مرة أخرى، يمكن أن بترت أطرافهم خلال استخدام مقص تشريح حادة لقطع في مفصل الحوض وعظم الفخذ.
  4. تؤخذ اثنين الأنسجة الرئيسي للتحليل: العضلات المقربة وسطي وعضلات الساق.
  5. لالأنسجة، تضمين واحد أو كلا الأنسجة في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) لcryosectioning.
  6. لتحليل الكيمياء الحيوية، وجمع واحد أو كلا الأنسجة إلى 1.5 مل إيبندورف ويغرق في حمام من النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل. يمكن أن تكون العيناتتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة التجهيز المستقبل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند خلط معا، البوليمر موجبة الشحنة (C32-122) والمشحونة سلبا البلازميد الحمض النووي ذاتيا في الجسيمات النانوية. قد يتم تأكيد تشكيل جسيمات متناهية الصغر من خلال التحليل الكهربائي أي complexation بين C32-122 والبلازميد الحمض النووي سيمنع تعبئة الحمض النووي خلال الكهربائي. يخدم البوليمر بمثابة كاشف ترنسفكأيشن لتسهيل امتصاص المعززة من الحمض النووي في الخلايا المستهدفة والتعبير اللاحقة من البروتينات ترميز (الشكل 2). يمكن transfected الخلايا مع أي الجينات العلاج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تقرير طريقة لبرمجة الخلايا الجذعية البالغة لoverexpress العوامل العلاجية باستخدام غير الفيروسية، والجسيمات النانوية القابلة للتحلل. هذه المنصة هي مفيدة بشكل خاص لعلاج الأمراض حيث يمكن الخلايا الجذعية بشكل طبيعي المنزل، مثل نقص التروية والسرطان. 9-10 وعلاوة على ذلك، ومنصة غير الفيروسية تسليم الجينات يسمح للمن overexpression عابرة من العوامل العلاجية، والتي هي مناسبة لمعظم تجديد الأنسجة والجرح عمليات الشفاء. عملية ترنسفكأيشن يعتمد على إدخال الحمض النووي في الخلايا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أنوه جمعية القلب الأمريكية الوطنية للتنمية منحة عالم (10SDG2600001)، برنامج ستانفورد بيو X التخصصات المبادرة، وبرنامج ستانفورد للأبحاث علماء الطبية للحصول على التمويل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMInvitrogen11965
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen10082
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogen15070
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسيPeprotech100-18B
1،4-Butanediol Diacrylate (90٪)Sigma Aldrich411744اختصار: C
5- أمينو-1-بنتانول (97٪)ألفا إيسار2508-29-4اختصار: 32
تتراإيثيلين جليكولدياميني> 99٪)العلوم البيولوجية الجزيئية17774اختصار: 122
أسيتات الصوديومG-BiosciencesR010
فوسفات مخزن محلول ملحيInvitrogen14190-144
Tetrahyofuran اللامائي (> 99.9٪)سيجما ألدريتش401757
إيثيل الأثير اللامائي (> 99٪)فيشر علميةE138-4
DMSO لامائية (> 99.9٪)سيجما ألدريتش276855
الجيلاتينسيجما ألدريتشG9391
التربسين-EDTAإنفيتروجين25200
D-luciferinGoldBio
درجة حرارة القطع المثلى (OCT)Tissue-Tek4583
الفئران المضادة للفأر CD31BD Pharmingen550274
Alexa فلور 594 مضاد للفئران IgGInvitrogenA11007
ثنائي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deveza, L., Choi, J., Yang, F. Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases. Theranostics. 2, 801-814 (2012).
  2. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).
  3. Mangi, A. A., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).
  4. Lee, J. Y., et al. Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2. Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).
  5. Park, K. I., et al. Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury. Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).
  6. Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).
  7. Yang, F., et al. Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors. Gene Ther. 16, 533-546 (2009).
  8. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J. Vis. Exp. , e1035(2009).
  9. Ceradini, D. J., et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat. Med. 10, 858-864 (2004).
  10. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).
  11. Sunshine, J., et al. Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy. Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).
  12. Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery. Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).
  13. Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
  14. Eltoukhy, A. A., et al. Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity. Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).
  15. Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).
  16. Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333(2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stem Cell ProgrammingBiodegradable Polymeric NanoparticlesTherapeutic AngiogenesisVEGF OverexpressionAdipose Derived Stem CellsPolymer SynthesisNanoparticle FormationStem Cell TransfectionHindlimb Ischemia ModelBioluminescence Imaging

Related Articles