تحديد هيكل وتنسيق مجمعات الببتيد المعدنية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي 1D و 2D 1H
Summary
تم تحديد هيكل محلول الرنين المغناطيسي النووي لببتيد نموذج metallochaperone مع Cu (I) ، وتم وصف بروتوكول مفصل من إعداد العينة وجمع البيانات 1D و 2D إلى هيكل ثلاثي الأبعاد.
Abstract
النحاس (I) المرتبط ببروتينات نقل metalochaperone يمنع أكسدة النحاس وإطلاق الأيونات السامة التي قد تشارك في تفاعلات الأكسدة والاختزال الضارة. تم تحديد مركب Cu (I) لنموذج الببتيد لبروتين المعدن المرتبط بالنحاس (I) ، والذي يتضمن تسلسل MTCSGCSRPG (يتم الحفاظ على مسطرة) ، في محلول في ظل ظروف خاملة بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
الرنين المغناطيسي النووي هي تقنية مقبولة على نطاق واسع لتحديد هياكل محلول البروتينات والببتيدات. نظرا لصعوبة التبلور لتوفير بلورات مفردة مناسبة لعلم البلورات بالأشعة السينية ، فإن تقنية الرنين المغناطيسي النووي ذات قيمة كبيرة ، خاصة أنها توفر معلومات عن حالة المحلول بدلا من الحالة الصلبة. هنا نصف جميع الخطوات المطلوبة لتحديدات الهيكل ثلاثي الأبعاد الكاملة بواسطة الرنين المغناطيسي النووي. يتضمن البروتوكول تحضير العينة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ، وجمع البيانات ومعالجتها 1D و 2D ، وتخصيص الذروة والتكامل ، وحسابات الميكانيكا الجزيئية ، وتحليل الهيكل. الأهم من ذلك ، تم إجراء التحليل أولا بدون أي روابط معدنية محددة مسبقا ، لضمان تحديد هيكل موثوق به بطريقة غير متحيزة.
Introduction
تستخدم الببتيدات على نطاق واسع كنماذج بروتينية وأدوية محتملة وعوامل علاجية في حد ذاتها. ومع ذلك ، فإن صغر حجمها ودرجة مرونتها العالية غالبا ما يحول دون تحديد الهيكل بالأشعة السينية بسبب صعوبات التبلور.
يمكن استخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحديد هياكل الببتيد والتفاعلات. يمكن أن توفر الطريقة معلومات تتعلق بالهيكل المحلي والعام ، وتفاعلات الربط والتقارب المنخفض ، وهي قابلة للتطبيق على العينات الصعبة حيث يمكن إجراؤها في حالة المحلول.
يتم تحقيق نقل النحاس في الأنظمة البيولوجية عن طريق بروتينات النحاس الميتالوشابيرون داخل الخلايا التي تربط أيونات النحاس (I) على وجه التحديد وتوصيلها إلى البروتينات المستهدفة من خلال سلسلة من تفاعلات البروتين والبروتين ، لحماية الأيونات من الأكسدة ومنع إطلاق النحاس السام2-5. يتميز موقع الربط بالتسلسل المحفوظ ، MXH / TCXanyXanyC ، والذي أظهر بواسطة كل من الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات لربط النحاس (I) بواسطة روابط الثيولاتو الناعمة لبقايا السيستين ، على الرغم من اقتراح رابط خارجيإضافي 6-8. كانت العلاقة بين البنية والوظيفة لهذه البروتينات موضوعا لبحث مكثف9.
في الدراسة المقدمة هنا ، تم تصنيع نموذج الببتيد الذي يتضمن التسلسل المحفوظ للمعادن النحاسية وتفاعل مع النحاس (I) في ظل بيئة خاملة. يصف البروتوكول المقدم خطوات تحديد الهيكل بواسطة الرنين المغناطيسي النووي ، بما في ذلك إعداد العينات وجمع البيانات ومعالجة البيانات وتوليد الهيكل والتحليل الهيكلي. تم إجراء التحليل على خطوتين: تم إنشاء الهياكل الأولى بدون معلومات تتعلق بطريقة ارتباط الببتيد بأيون النحاس. بمجرد إنشاء أسلوب الربط تجريبيا ، تم إدخال هذه القيود لتوفير هيكل عالي الدقة. طريقة الربط هي النقطة الأساسية في النموذج وبالتالي تم تحديدها بطريقة غير متحيزة.
يعد التحديد الهيكلي للرنين المغناطيسي النووي للببتيدات النموذجية تقنية قيمة للغاية يستخدمها الكيميائيون وعلماء الأحياء. يمكن تطبيقه بسهولة نسبيا على الببتيدات المختلفة في ظل ظروف مختلفة ، وبالتالي قد يلقي الضوء على الآليات ذات الصلة10. يوفر فهم عملية توضيح الهيكل فهما أفضل لنقاط القوة والضعف في الهياكل المقترحة.
Protocol
1. تحضير العينة
- عينة Apo: قم بإذابة ما يقرب من 1-2 مجم من الببتيد في 450-500 ميكرولتر من مذيب الرنين المغناطيسي النووي المنزوع (المحاليل المفضلة للعينات البيولوجية هي 10٪ D2O في الماء أو d6-DMSO 11-12 إذا لم تذوب العينة في الماء أو تتفاعل معها).
- عينة متفاعلة مع النحاس: قم بإذابة ما يقرب من 1-2 مجم من الببتيد بكمية متساوية المولار من الملح المعدني في 450-500 ميكرولتر من مذيب الرنين المغناطيسي النووي.
- قم بتصفية المحلول باستخدام زجاج تلبيد أو ورق ترشيح أو أي تقنية أخرى تناسب المركبات قيد الفحص ولا تمتصها. هذا ضروري لإزالة أي جزيئات معدنية ، والتي ستؤثر على التجانس.
- انقل المحلول إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وأغلقه. تأكد من أن جودة الأنبوب تناسب قوة المغناطيس المستخدمة (لمزيد من التفاصيل انظر جدول المعدات).
- إذا كانت العينة حساسة للأكسجين ، فيجب أن تتم هذه الخطوات في بيئة خاملة وإغلاق الأنبوب لمنع الأكسدة.
2. جمع بيانات الرنين المغناطيسي النووي ومعالجتها13
- سجل أطياف 1D 1H للعينات المتفاعلة مع apo والنحاس ومقارنتها. يجب أن يظهر طيف الببتيد المحتوي على النحاس تغيرا كبيرا في التحول الكيميائي في منطقة الأميد ويتم حل القمم لأن الببتيد apo-الببتيد مرن ويظهر متوسط المطابقات ، ولكن عند التفاعل مع النحاس ، يكون لأميدات الببتيد المرتبطة بنية واحدة (الشكل 2).
- إذا لم يتغير الطيف ، يفترض أن التفاعل قد فشل.
- إذا تحولت العينة إلى اللون الأخضر ، فسوف يتأكسد النحاس في الغلاف الجوي ، مما قد يغير خصائص الربط الخاصة به.
- في كلتا الحالتين ، ستحتاج العينة إلى إعادة صنعها.
- ابحث عن ظروف درجة الحرارة المثلى لقياسات الرنين المغناطيسي النووي التي تعطي الحد الأدنى من التداخل بين بقايا الأميد ذات عرض الخط الضيق.
- قم بإعداد تجارب COSY14 أو TOCSY15 و NOESY16 أو ROESY17 NMR في ظل ظروف متطابقة (درجة الحرارة ، الأس الهيدروجيني ، إلخ) وتشغيلها بالتسلسل.
- ستكتشف تجارب COSY (الشكل 3) و TOCSY (الشكل 4) التفاعلات من خلال الروابط لتفاعلات البروتون والبروتون المجاورة ذات المدى الأطول ، على التوالي. يعطي طيف COSY معلومات عن ارتباطات HN-Hα بينما يعطي طيف TOCSY ، بالإضافة إلى معلومات عن HN والبروتونات الأليفاتية الأخرى H للمخلفات المترابطة.
- تكتشف تجارب NOESY و ROESY (الشكل 5) القرب عبر الفضاء دون الاعتماد على الروابط لإعطاء معلومات هيكلية. يتم الاختيار بين الاثنين وفقا للحجم الفعال للمركب وشدة المجال. تعطي بعض هذه المجموعات إشارات صفرية نظرية (الشكل 6) وسيتعين إجراء تجربة ROESY لاكتشاف تفاعلات NOE10،18.
- إذا كانت العينة في الماء ، فيجب أن تحتوي التجارب على عنصر قمع المياه. يتم تحقيق ذلك بكفاءة أكبر باستخدام التدرجات19. في هذه الحالة ، من المفيد إعادة تشغيل العينة ، بمجرد تعيينها ، في D2O النقي للحصول على تفاعلات مع وبين هيدروجين Hα.
- قم بتحسين مدة أوقات خلط TOCSY و NOESY أو ROESY عن طريق إجراء عدد من التجارب القصيرة للعثور على الحد الأقصى لتراكم الإشارة بأقل قدر من الخسارة لانتشار الدوران. تأكد من أن هذه هي المنطقة الخطية لمنحنى التراكم. تشمل القيم الشائعة للببتيدات في حقول 600 ميجاهرتز أوقات خلط تبلغ حوالي 100 مللي ثانية ل TOCSY و 150 مللي ثانية لتجارب NOESY أو ROESY.
- قم بإجراء تجارب 1D بين كل تجربة للتأكد من أن تكوين العينة يظل ثابتا طوال فترة الحصول على البيانات (الشكل 7).
- قم بمعالجة الأطياف باستخدام وظائف apodization المناسبة للحصول على أقصى دقة مع الحد الأدنى من فقدان قوة الإشارة ، مع إضافة عدم ملء البعد T1.
- قم بتصحيح خط الأساس في F2 ثم F1 بعد دالة متعددة الحدود تربيعية.
- قم بمعايرة التحول الكيميائي للأطياف بعناية وفقا لقمم المياه المتبقية أو DMSO في المذيبات المعنية وفقا لتحولها من المعايير المعروفة (TMSP أو TMS ، على التوالي).
3. ذروة التعيين والتكامل باستخدام SPARKY20
- قم بإعداد مجموعة من أطياف COSY و TOCSY المتراكبة على طيف NOESY أو ROESY (الشكل 8).
- قم بتعيين جميع قمم NOE في الطيف وفقا لمنهجية التخصيص التسلسلي التي طورها Wüthrich21.
- ابدأ بتعيين القمم التي تتداخل مع إشارات TOCSY في منطقة بصمة الإصبع ، حيث سيسهل ذلك إدخالات تعيين الذروة اللاحقة مع برنامج SPARKY (الشكل 9). سجل التحول الكيميائي للتخصيص (الشكل 10) ، و 3قيم JHNHα (الشكل 11).
- ترجمة القمم إلى قيود المسافة و 3قيم JHNHα إلى زوايا ثنائية السطوح.
- يمكن القيام بذلك عن طريق دمج القمم من داخل البرنامج وترجمتها إلى قيود المسافة باستخدام تفاعل المسافة المعروفة (مثل المسافة بين بروتونين من مجموعة الميثيلين أو ذرات الهيدروجين العطرية من الأحماض الأمينية العطرية).
- إذا تداخلت القمم ، ولا يمكن استخدام طرق التكامل ، فيمكن تصنيفها على أنها قوية – متوسطة – ضعيفة – ضعيفة جدا عن طريق التقدير البصري ، ويمكن ترجمة هذه التسميات إلى مسافات تصل إلى 2.5 و 3.5 و 4.5 و 5.5 Å ، على التوالي. هذا ليكون أكثر فاعلية في العمل مع الببتيدات.
- 3J HNHα القيم تدل على الزوايا ثنائية السطوح وفقا لمعادلة Karplus حيث يمكن أن تنتج معظم قيم الاقتران المعطاة من أكثر من زاوية ثنائية السطوح. يمكن أن تكون هذه مؤشرا على البنية الثانوية (الحلزونات أو الصفائح) أو الملف العشوائي أو المتوسطات المطابقة لها. لذلك ، من المهم استخدام القيود بعناية ، أو استخدامها كتأكيد للنتائج التوافقية.
4. حسابات الميكانيكا الجزيئية لتوليد مجموعة الهيكل باستخدام XPLOR22
- قم باستيراد قيود المسافة والزوايا ثنائية السطوح بالتنسيق الصحيح ل XPLOR. (الشكل 12، القيود المتبقية فقط). سيقوم XPLOR بالبحث في الفضاء التوافقي للعثور على الهياكل التي تلتزم بالقيود الكيميائية الهندسية الكنسية ، مثل أطوال الروابط ، والزوايا ، والتماثل ، وما إلى ذلك ، بالإضافة إلى قيود المسافة التي تم العثور عليها تجريبيا ، لإنشاء مجموعة لا يتم فيها انتهاك أي من المعلمات المذكورة أعلاه. سيشكل هذا فرقة البداية.
- سيكون تشغيل تحديد الهيكل الأول دون استخدام أي قيود على المعدن. سيوضح هذا المخلفات التي تشارك في ربط المعادن دون أي تحيز. انتقل إلى الخطوة 4.4.
- بالإضافة إلى قيود المسافة المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي ، أضف قيود ربط المعادن إلى المخلفات المحددة.
- أضف معلمات مناسبة لوصف أيون المعدن وطوبولوجيته.
- يجب وضع المعلومات الفيزيائية المناسبة (الكتلة وأطوال الرابطة مع الذرات الأخرى والزوايا ومعلمات التنافر غير المترابطة) في ملف المعلمة.
- أضف معلومات الربط إلى ملف المخطط: ما هي الروابط التي يتم تشكيلها وكسرها والرسوم الرسمية التي يتم تغييرها نتيجة للربط.
- قم بإنشاء مجموعة صغيرة من 10 أعضاء عادة.
- أدخل القيود تدريجيا ، بدءا من التفاعلات من العمود الفقري إلى العمود الفقري ، ثم من العمود الفقري إلى السلسلة الجانبية ، ثم التفاعلات من السلسلة الجانبية إلى السلسلة الجانبية ، والانتقال من التفاعلات بين المتبقية والمتسلسلة إلى التفاعلات ذات المدى الأطول بشكل متزايد. هذا يسهل تحديد الأخطاء في التكليف.
- أدخل طاقة NOE كجهد بئر مربع بثابت قوة ثابت يساوي 50 كيلو كالوري / مول • Å2. يجب أن يتم التلدين المحاكي ب 1,500 خطوة 3 fsec عند 1,500 كلفن و 3,000 خطوة 1 fsec أثناء التبريد إلى 500 كلفن. أخيرا ، قم بتقليل الهياكل باستخدام تقليل طاقة التدرج المترافق ل 4,000 تكرار ؛ هذه هي المتغيرات التي يمكن تغييرها داخل XPLOR.
- قم بإنشاء مجموعة نهائية من 50 عضوا عادة. قم بتنفيذ خطوات من الخطوة 4.4 على المجموعة بأكملها.
- أبلغ عن عدد كل نوع من أنواع تفاعلات NOE التي تم العثور عليها، كما هو موضح في الشكل 13.
- قم بإنشاء مجموعة من الهياكل التي تلتزم بالهندسة الكيميائية الكنسية والقيود التجريبية المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي.
- أبلغ عن العدد الإجمالي للمطابقات ، وعدد تلك التي تحتوي على انتهاكات للقيود المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي ، و RMSD للمجموعة بأكملها ، سواء العمود الفقري ، أو جميع قيم RMSD للذرة الثقيلة.
5. تحليل الهيكل
- تمثل المجموعة التي تم حلها المساحة التوافقية التي اعتمدها الببتيد أثناء قياس الرنين المغناطيسي النووي. قد تتغير المرونة المحلية في مناطق مختلفة من الجزيء ويمكن أن يعزى ذلك إلى أسباب هيكلية أو وظيفية (الغرض من التحليل الهيكلي هو تحديد الأساس الهيكلي للاستقرار وآلية العمل).
- قم باستيراد جميع مطابقات الهيكل إلى برنامج MolMol 23 لإنشاء مجموعة بداية (الشكل 14).
- افحص المجموعة لتحديد الاستقرار المحلي للجزيء.
- حدد قيم RMSD للعمود الفقري والسلسلة الجانبية عن طريق تحديد مناطق المخلفات الأربعة اللاحقة على طول التسلسل وجعل البرنامج يحسب RMSD إلى أدنى هيكل طاقة أو متوسط.
- حدد مناطق الجزيء التي تظهر الاستقرار المحلي (الشكل 15) عن طريق رسم RMSD المحلي كدالة للتسلسل.
- تراكب المجموعة على طول هذه المنطقة من الجزيء واستخدم هذه المجموعة لمزيد من التحليل (الشكل 16).
- اختر مطابقات منخفضة الطاقة تلتزم بالقيود المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي (غير منتهكة). ستشكل هذه “مجموعة الطاقة المنخفضة”.
- أبلغ عن عدد المطابقات في المجموعة ومعايير اختيارها وقيم RMSD كما هو محدد في الخطوة 4.6.1.
- إذا تم تحديد وضع الربط المعدني بالفعل ، فتابع إلى الخطوة التالية. خلاف ذلك: قم بتحليل المجموعة منخفضة الطاقة وتحديد السلاسل الجانبية المتبقية التي تكون على مقربة صحيحة من بعضها البعض لتتمكن من ربط أيون المعدن. بمجرد تحديدها ، ارجع إلى الخطوة 3.3 وأعد التحليل بما في ذلك بيانات ربط النحاس (الشكل 17 للمجموعة والشكل 18 للمطابقة منخفضة الطاقة).
- افحص المجموعة وحدد البنية الثانوية المحلية داخل الجزيء باستخدام معلمات البحث الافتراضية لبرنامج MolMol. يتم الاحتفاظ بالهياكل الثانوية عن طريق الرابطة الهيدروجينية وتشير إلى مناطق مستقرة من الجزيء.
- حدد الهيكل الثانوي لكل محدث (الشكل 19).
- قم بإنشاء جدول للنسبة المئوية للمطابقين للمجموعة التي تظهر كل بنية ثانوية.
- تحديد ما إذا كانت مناطق الهيكل الثانوي تتداخل مع المناطق التي تم تحديدها لتكون المناطق المستقرة بواسطة RMSD المحلي. هذا هو الحال في كثير من الأحيان.
- حدد الهيكل الثانوي لكل محدث (الشكل 19).
- تحديد المسافات والرابطة الهيدروجينية داخل الجزيء.
- قم باستيراد المجموعة إلى Chimera24.
- استخدم الوهم لتحديد المسافات داخل الجزيئات بين الذرات المشتبه في ارتباطها بالمعادن. احسب متوسط المسافات في المجموعة.
- استخدم الوهم لتحديد الروابط الهيدروجينية داخل الجزيئات في كل متوافق للمجموعة (الشكل 20) ، باستخدام معلمات الرابطة الهيدروجينية المريحة الافتراضية (بنسبة 20٪) من البرنامج.
- قم بإنشاء جدول للنسبة المئوية للمطابقين للمجموعة التي توضح كل رابطة هيدروجينية. تشير الروابط الهيدروجينية التي تتكرر في غالبية المطابقات إلى رابطة مستقرة تضيف إلى استقرار الهيكل.
- تحديد التفاعلات الكهروستاتيكية داخل الجزيء.
- تحديد التفاعلات بين السلاسل الجانبية المشحونة.
- قم بإنشاء جدول للنسبة المئوية للمطابقين للمجموعة التي تظهر كل تفاعل إلكتروستاتيكي.
- احسب توزيع الجهد الكهروستاتيكي باستخدام مجال القوة الكهرماني25 داخل برنامج دلفي26.
- اختر شكلا تمثيليا واحدا من المجموعة لإجراء حسابات الجهد الكهروستاتيكي.
- اشتقاق الجهد الكهروستاتيكي باستخدام معادلة بواسون-بولتزمان وحساب كولوم كامل. تشمل المعلمات المطلوبة القوة الأيونية للمحلول ، وقيم العزل الكهربائي للمحلول (80 للماء ؛ 40 ل DMSO) ؛ الببتيد الداخلي (عادة حوالي 5.0) ؛ حجم الشبكة (عادة 65’65’65 نقطة) ؛ والحد الأدنى للمسافة بين الببتيد وحافة الشبكة (10 Å). عادة ما تكون النتائج قوية جدا فيما يتعلق بهذه القيم حيث أن النتيجة الرئيسية يحكمها الببتيد نفسه (الشكل 21).
- افحص الجهد الكهروستاتيكي المعين على سطح فان دير فالس للببتيد (الشكل 22).
- افحص الأسطح المتساوية للجهد الكهروستاتيكي ، والتي تصف المواضع التي لها نفس الإمكانات. ابحث عن الأسطح المتساوية التي تشير إلى الأهمية البيولوجية ، مثل الأسطح الموجبة أو السلبية الممتدة التي قد تجذب أو تصد البروتينات أو الروابط الأخرى ، أو التوزيعات التي تشير إلى الأهمية ، مثل التوزيع البرمائي أو بقع ذات خصائص مختلفة (الشكل 23).
- لخص جميع النتائج الهيكلية لترى كيف تعزز بعضها البعض.
- كرر الخطوات 4.3-5.7.4 عند الاقتضاء.
Representative Results
Discussion
The contribution of structural information to understand binding mechanisms is well-accepted. Peptides are useful as models for protein binding and interactions; however they are not amenable to the main method for structure determination, X-ray crystallography. NMR is particularly useful for these systems, since the structures can be readily solved in solution. This is especially for the case of metallochaperone-mimetics that additionally require structure determination under an inert environment to prevent oxidation of the metal ion.
The MTCSGCSRPG peptide, containing the conserved MT/HCXXC motif, bound Cu (I) as was evident by the significant change of spectrum from the apo-form to the peptide reacted with copper. The need for a ROESY experiment at the field of 600 MHz, due to a spectrum with null interactions in the NOESY spectrum, indicates a compact peptide, since our experience shows that smaller peptides of 6-7 residues fall in the null signal of the NOESY regime, but peptides of this size usually give adequate signal. In the ROESY spectrum 81 cross-peaks were observed, N of these were inter-residue cross-peaks and (81-N) were intra-residue cross-peaks. This is a small number of peaks compared to proteins, but is expected in small peptides; Particularly cyclic peptides, which tend to give a small number of interactions since all the sidechains point outward and undergo little interaction with one another.
As the metal itself cannot be detected directly by the 1H NMR measurements, one must conclude on the metal binding residues from the distances obtained between suspected donor atoms. To assure a reliable structure, no metal-ligand binding constraints should be added to the initial calculations. Previous studies have shown that forcing metal binding in an incorrect form may still lead to reasonable structural factors even if the structure is incorrect10.
The experiments gave highly nonviolated conformations in an ensemble of low RMSD. The low RMSD of a potentially flexible peptide lends further support for copper binding, which would reduce the conformational flexibility of the molecule. The RMSD values of the binding region were reduced to values around 0.05 Å, which shows tremendous stabilization as expected by the ring closure. The secondary bend and hydrogen-bonding found in the 3-7 region, also indicated binding in this region.
The negative charge obtained when two thiols bind the copper (I) peptide is offset by the N-terminal amine that was held proximate to the bound copper.
When inspecting the resulting distances between potential donor atoms, including the two cysteine residues and the methionine group, the ones located at positions most probable to bind metal were the sidechains of Cys3 and Cys6. Therefore, binding constraints were added between these residues and the metal center, and the resulting structure was evaluated. To further support the resulting structure, various additional control measurements that include preset bonds to other residues may be performed and the structural factors compared. This is especially important where the result of the model is unexpected. In previous studies using similar measurements using protein-mimetic peptides, unusual binding modes were observed, including methionine instead of cysteine7.
Excess copper is toxic to biological systems and copper transport is very tightly controlled. Therefore, it is interesting and mechanistically important to understand how copper is transferred from one protein to another. The transport cannot depend on simple release and acquire mechanism, but must somehow include both stronger and weaker modes of binding, much like how one would transfer an object carefully from the fingers of one hand to another. This type of study provides much information regarding the mechanism of copper binding in biological systems and can be used to further investigate many different aspects of metallochaperone activity in nature. The systems may be easily mutated and manipulated to mimic many different aspects of copper-binding in nature, and may be analyzed without using prior assumptions of the binding mode.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Avance DMX 600 MHz Spectrometer | Bruker | ||
| NMR sample tubes | Wilmad | 535-PP | |
| Glove box | MBraun | LM05-019 | |
| Lyophilizer | VirTis | benchtopK | |
| Peptide | BioChemia | Custom made | >95% purity |
| Copper (1) chloride | Aldrich | 224332 | |
| Hydrochloric acid | BioLab | 231-595-7 | |
| Sodium hydroxide | Gadot | 1310-73-2 | |
| d<sub>6</sub>-Dimethylsulfoxide | Aldrich | 236926 | |
| Deuterium oxide | Aldrich | 151882 |
References
- Robinson, J. A. Protein epitope mimetics as anti-infectives. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).
- Huffman, D. L., Function O’Halloran, T. V. structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).
- Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. Trace elements in human physiology and pathology. Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).
- Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. Structural Biology of Copper Trafficking. Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).
- Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).
- Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O’Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins. Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).
- Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA. Biochem. J. 424, 347-356 (2009).
- Hearnshaw, S., et al. A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ. Biochem. 48, 9324-9326 (2009).
- Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies. Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).
- Shoshan, M. S., et al. NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine. Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).
- Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change. J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).
- Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P – NMR and molecular dynamics. Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).
- Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. 2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).
- Bax, A., Davis, D. G. MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy. J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).
- Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).
- Bax, A., Davis, D. G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy. J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).
- Williamson, M. P. Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology. Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).
- Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions. J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).
- Wüthrich, K. . NMR of proteins and nucleic acids. , (1986).
- Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. . Comp. aspects study biol. macromol. by NMR. , (1991).
- Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures. J. Molecular Graphics. 14, 51 (1996).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Pearlmen, D. A., et al. AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules. Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).
- Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications. J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).
