تصويب: بروتوكولات تحضير العينات والتصوير والتحليل لمجهر المسح ذي الحافة القاطعة

ملخص

تم إجراء تصحيح على بروتوكولات تحضير العينات والتصوير والتحليل للمجهر المسحي ذو الحافة السكينية. وقد أُجريت تعديلات هامة على بروتوكول صبغ نيسل (Nissl staining).

الملخص

تم إجراء تصحيح على بروتوكولات تحضير العينات والتصوير والتحليل للمجهر الماسح ذو الحافة الحادة. وقد أُجريت تعديلات هامة على بروتوكول صبغ نيسل.

البروتوكول

تم إجراء تصحيح على بروتوكولات تحضير العينات والتصوير والتحليل للمجهر الماسح ذو الحافة السكينة. تم تعديل بروتوكول صبغ نيسل من:

2. تحضير العينات: صبغة نيسل (Nissl)

1. يتم تخدير الفأر تخديراً عميقاً باستخدام الكيتامين والزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق، ثم يتم إجراء تروية عبر القلب باستخدام 50 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، يليه 250 mL من الفورمالين المتعادل المنظم بتركيز 10% (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، وأخيراً باستخدام 3.0 cc من حبر الهند غير المخفف.
2. تعد تروية الجسم بالكامل بالمحلول الملحي والمثبت ضرورية لتخليص الجهاز القلب الوعائي من الدم وتثبيت الأنسجة. كما أن التروية بحبر الهند ضرورية لملء الأوعية الدموية للجهاز القلب الوعائي بالكامل.
3. يتم بعد ذلك تجفيف الدماغ الناتج من خلال سلسلة من كحوليات الإيثيل المتدرجة (25%{}-100%)، ثم يتم طمره في بلاستيك الأرالدت وفقاً للبروتوكول المذكور في 1.8-1.9 أعلاه. أما إذا كان LR white هو وسط الطمر، فيتبع البروتوكول المذكور في 1.10 أعلاه.
4. يتم تخدير الفأر تخديراً عميقاً باستخدام الكيتامين والزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق، ثم يتم إجراء تروية عبر القلب باستخدام 50 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، يليه 250 mL من الفورمالين المتعادل المنظم بتركيز 10% (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، وأخيراً باستخدام 3.0 cc من حبر الهند غير المخفف.
5. تعد تروية الجسم بالكامل بالمحلول الملحي والمثبت ضرورية لتخليص الجهاز القلب الوعائي من الدم وتثبيت الأنسجة. كما أن التروية بحبر الهند ضرورية لملء الأوعية الدموية للجهاز القلب الوعائي بالكامل.
6. يتم بعد ذلك تجفيف الدماغ الناتج من خلال سلسلة من كحوليات الإيثيل المتدرجة (25%{}-100%)، ثم يتم طمره في بلاستيك الأرالدت وفقاً للبروتوكول المذكور في 1.8-1.9 أعلاه. أما إذا كان LR white هو وسط الطمر، فيتبع البروتوكول المذكور في 1.10 أعلاه.
7. يتم تخدير الفأر تخديراً عميقاً باستخدام الكيتامين والزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق، ثم يتم إجراء تروية عبر القلب باستخدام 50 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، يليه 250 mL من الفورمالين المتعادل المنظم بتركيز 10% (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، وأخيراً باستخدام 3.0 cc من حبر الهند غير المخفف.
8. تعد تروية الجسم بالكامل بالمحلول الملحي والمثبت ضرورية لتخليص الجهاز القلب الوعائي من الدم وتثبيت الأنسجة. كما أن التروية بحبر الهند ضرورية لملء الأوعية الدموية للجهاز القلب الوعائي بالكامل.
9. يتم بعد ذلك تجفيف الدماغ الناتج من خلال سلسلة من كحوليات الإيثيل المتدرجة (25%{}-100%)، ثم يتم طمره في بلاستيك الأرالدت وفقاً للبروتوكول المذكور في 1.8-1.9 أعلاه. أما إذا كان LR white هو وسط الطمر، فيتبع البروتوكول المذكور في 1.10 أعلاه.

إلى:

2. تحضير العينة: صبغ نيسل (Nissl)

1. يتبع هذا البروتوكول بدقة بروتوكول Mayerich et al.⁷
2. يتم تخدير الفأر تخديراً عميقاً باستخدام الكيتامين والزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق، ثم يتم إجراء تروية عبر القلب باستخدام 50 mL من المحلول الملحي الملحوق بالفوسفات (pH 7.4) في درجة حرارة الغرفة، يليه 250 mL من البارافورمالدهيد الملحوق بالفوسفات بتركيز 4% (pH 7.4) وهو بارد.
3. يتم بعد ذلك تروية الفأر بـ 100 mL من محلول صبغة الثيونين بتركيز 0.1% في ماء منزوع الأيونات، ويوضع الجسم في الثلاجة (4 °C) لمدة 24 ساعة.
4. بعد مرور 24 ساعة، يُستخرج الدماغ من القحف ويوضع في محلول جديد من الثيونين بتركيز 0.1% ويُترك في درجة حرارة 4 °C لمدة 7 أيام. كان الهدف من المدة الطويلة لهذا الإجراء هو ضمان التغلغل الكامل للثيونين في العينة التي تم تحضيرها ككتلة واحدة.
5. يتم بعد ذلك إزالة الصبغة من الدماغ وتجفيفه من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول، بدءاً من الإيثانول بتركيز 50% والماء، وزيادة التركيز وصولاً إلى إيثانول 100% على مدار فترة زمنية مدتها 6 أسابيع. تُحفظ تغييرات الإيثانول من 50% إلى 70% في الثلاجة (4 °C)، بينما تُحفظ جميع تغييرات الإيثانول التي تزيد عن 70% في درجة حرارة الغرفة.
6. بعد ثلاث تغييرات من الأسيتون (من 2-4 أيام في كل محلول في درجة حرارة الغرفة)، يتم بعد ذلك تضمين الدماغ في بلاستيك araldite وفقاً للبروتوكول المذكور في 1.8-1.9 أعلاه. وإذا كان LR white هو وسط التضمين، فيتم اتباع البروتوكول المذكور في 1.10 أعلاه.