العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

CD4 + T الليمفاوية (خلايا تي) تلعب دورا حاسما في الدفاع المناعي بوساطة نظام ضد الكائنات الدقيقة المعدية. على العكس، كما يرتبط ارتباطا وثيقا مع خلايا T ظهور وتطور أمراض المناعة الذاتية مثل مرض السكري من النوع 1، الذئبة الحمامية، والتهاب المفاصل الروماتويدي. CD4 + الخلايا اللمفية تي تصبح تفعيلها من خلال مجموعة من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) التفاعل مع مستضد وما شابه ذلك / مجمع التوافق النسيجي الرئيسي الثاني (MHCII) جزيئات، والتفاعلات مستقبلات CD28 مع B7.1/B7.2 بروابط ^15. بالإضافة إلى توفير التحفيز TCR وCD28 شارك في التحفيز، والخلايا العارضة للمستضد أيضا توفير بيئة خلوى، والذي يحدد الدولة تمايز تي اللمفاويات، وبالتالي توجيه استجابة الخلايا اللمفاوية T لمستضد معين. التفاعلات الممرض متميزة / خلية مستضد تقديم خلق بيئات خلوى متميزة، والتي تحرف الخلايا اللمفية تي أسفل مسارات متميزة تركز على ايليmination من مسببات المرض الشروع. للأسف، T مسارات الخلايا اللمفاوية المستجيب، صممت في الأصل للقضاء على غزو مسببات الأمراض، ويمكن أن توجه ضد أنسجة خطأ الذاتي ^15. وبالتالي، فهم أفضل من كل دولة التمايز متميزة CD4 + T الخلية فرعية أمر بالغ الأهمية لفهمنا لكيفية لتعديل التوازن بين القضاء على مسببات الأمراض والتسامح في تقرير المصير.

بالإضافة إلى الاستجابة Th1، الاستجابة Th2، ومحرض T التنظيمية مسارات تمايز الخلايا، الخلايا الليمفاوية T السذاجة ويمكن أيضا أن تكون مدفوعة من قبل السيتوكينات أسفل مسار TH17. بينما TH1 الخلايا مسببات الأمراض بين الخلايا المقاتلة، وخلايا الاستجابة Th2 القضاء على مسببات الأمراض خارج الخلية، والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) تقليل الاستجابات الالتهابية ^{1، 16؛} خلايا TH17 تلعب دورا هاما في القضاء على البكتيريا والفطريات خارج الخلية. يتم الرمز الخلايا TH17 عموما تعبير عن النسخ عامل النسب المحددة RORγT وإنتاج IL-17A، وهو ما يعزز تفعيل الضامة والعدلات ^{1، 7.}

قد تورطت في عدة خلايا TH17 اضطرابات المناعة الذاتية، ونماذج القوارض المرتبطة بها. على سبيل المثال، فقد ثبت أن IL-23 (الذي هو مطلوب للحفاظ على النمط الظاهري TH17)، ولكن، لم يكن IL-12 المذنب المركزي في التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، نموذج المرض القوارض لMS. وفيما بعد تبين أن التخفيضات في إنتاج IL-17 ترتبط بالوقاية EAE ^{2 و 6 و 17.} علاوة على ذلك، وقد ارتبطت الخلايا TH17 الذين يعانون من اضطرابات المناعة الذاتية الأخرى بما في ذلك التهاب المفاصل والذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ^{10، 16.} IL-23 P19 ناقصة ^{- / -} عرضت الفئران لديها أعداد قليلة جدا من الخلايا TH17، ومقاومة للتطوير ليس فقط EAE، ولكن أيضا التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين، وهو نموذج لالتهاب المفاصل الروماتويدي ^{10، 18.} بالإضافة إلى ذلك، الفئران التي عولجت مع تحييد الأجسام المضادة IL-17A الخلفإيه عثر على بداية التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين أيضا أن يكون القرار من تلف المفاصل ^18. تجدر الإشارة إلى أن دور الخلايا TH17 في تطور أمراض المناعة الذاتية ويبقى أن توصف بأنها أظهرت الأبحاث الحديثة أيضا دورا وقائيا من الخلايا TH17 في النوع 1 من مرض السكري ⁹ و ¹¹ و التهاب الأمعاء ^14. تؤكد هذه الدراسات على أهمية TH17 التمايز في المناعة الذاتية.

في المختبر TH17 التمايز هو وسيلة ضرورية في أبحاث الخلايا T لأن هناك اثنين على الأقل من الأسئلة المحيرة التي تتطلب مزيدا من التحقيق: 1) كيف بالضبط هل IL-6 تنظيم التوازن بين Treg وTH17 التمايز، و 2) ما هي الآليات الدقيقة وراء IL-17 التي يسببها الاضطرابات الالتهابية؟ لدينا وسيلة توظف خلايا CD4 + CD25-T من الطحال والغدد الليمفاوية من الفأرة C57BL / 6. من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من أنه من الممكن للحث على تمايز TH17 باستخدام النجاسةالسكان، والحصول على ما لا يقل عن 80٪ نقية CD4 + السكان الخلية CD25-T ينفي أي قلق من التلوث ويضمن نتائج TH17 التمايز أكثر نجاحا. من أجل تحقيق التمايز TH17 السليم، يتم تحضين الخلايا CD4 + CD25-T بحضور مكافحة CD3 ومكافحة CD28، والتي توفر إشارات التنشيط، 1 و 2 على التوالي، وIL-6، وTGF-β. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن أن IL-23 وحده يمكن استخدامها لتحقيق TH17 التمايز، وقد تجلى ذلك في وقت لاحق أن IL-23 هو ضروري لاستقرار السكان الخلية TH17، ولكن IL-6 و TGF-β ضرورية لTH17 التمايز ^{3، 18، 19.} وقد أظهرت الدراسات أن الفئران يتم التعبير عن مستقبلات IL-23 على خلايا CD4 + T فقط بعد أن تكون قد حفز مع IL-6 و TGF-β ^{13، 18.} أيضا، سوف الخلايا TH17 تتطور بنجاح في حضور IL-23-منع الأجسام المضادة طالما IL-6 و TGF-β موجودة ^{18، 19.} على هذا النحو، وهذا التمايز TH17 بروتوكول الأقليمايديس الظروف المناسبة للحث على TH17 التمايز بنجاح. تطوير فهم أفضل للآليات الأساسية TH17 التمايز وIL-17 إنتاج تقديم الفرصة لتطوير علاجات أفضل تهدف إلى اضطرابات المناعة الذاتية ^13.

وقد أجريت جميع استخدام الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام.

1. إعداد خلطات وسائل الإعلام

1. العقيمة PBS درجة الحموضة: 7.3 (1 L)
   ز 0.23 ناه ₂ ص ₄
   1.15 ز نا ₂ هبو ₄
   9.0 غرام كلوريد الصوديوم
   يستغرق حجم بالماء DI. تعقيم الأوتوكلاف مع.
2. خلية الإعلام الثقافة (100 مل)
   89 مل RPMI
   10 مل 10٪ FBS
   1 مل مضاد حيوي فطري (ابام) 100 ميكروغرام 50 مم 2 المركابتويثانول (3.5 ميكروغرام الأوراق المالية 2 المركابتويثانول إلى 96.5 ميكروغرام PBS)
3. FACS العازلة (الفرز نيون تفعيل خلية) (لاستخدامها خلال التدفق الخلوي) 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني العقيمة
4. iTh17 ميكس (بناء على عدد من العينات، وتحديد حجم اللازمة لجميع خلطات ووسائل الإعلام)
   1.5 ميكروغرام / مل مكافحة CD28
   20 نانوغرام / مل IL-6
   5 نانوغرام / ملTGF-β

2. وستكون خلايا مطلي في ثلاث نسخ تحت الشروط التالية

1. لوحة ملزمة لمكافحة CD3، ومكافحة CD28 (وهذا هو مزيج السيطرة التنشيط).
2. iTH17: لوحة ملزمة لمكافحة CD3، ومكافحة CD28، IL-6، TGF-β.

3. مكافحة CD3 محدد لوحة (10 ميكروغرام / مل)

فمن المستحسن أن إعداد لوحات مكافحة CD3 محدد لوحة يتم على الأقل 4 ساعة قبل الوقت ستضاف الخلايا إلى لوحات.

1. إضافة 30 ميكرولتر مكافحة CD3 إلى الآبار (غير المخفف مكافحة CD3 في برنامج تلفزيوني العقيمة) من جديد 96 U جيدا أسفل MICROTEST الأنسجة لوحة الثقافة، والاستفادة من الجانبين من لوحة لضمان تغطية موحدة للآبار. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات، ثم بردت حتى حان الوقت لإضافة يمزج والخلايا إلى صفيحة.

4. الماوس تشريح

1. ويستند هذا البروتوكول على استخدام C57BL / 6 هيئة التصنيع العسكريه، 3-8 أشهر من العمر، والتي تم شراؤها من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME).
2. التضحية الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون ₂ الاختناق، وتأكيد وفاة مع خلع عنق الرحم لاحقة.
3. تعقيم أدوات تشريح الفئران ومنطقة شق مع الايثانول 70٪ ويبدأ تشريح.
4. من وجهة النظر بطني، والاستيلاء على الجلد التي هي سابقة لفتح مجرى البول وتبدأ خفض مع مقص يصل خط الوسط بطني حتى وصلت إلى منطقة الذقن. اتخاذ الاحتياطات اللازمة وليس لتمزيق أو قطع في بطانة جدار البريتوني.
5. سحب على الجلد وحصره للسماح بالوصول إلى الغدد الليمفاوية مريحة أثناء الإزالة.
6. سيتم إزالة الغدد الليمفاوية والطحال جمع كل بالملقط، وتوضع في طبق بتري معقمة تحتوي على 5 مل من autoMACS تشغيل شراؤها من مخزن بيوتيك Miltenyi (يرجى الرجوع إلى أرقام 2 و 3 لالعقدة الليمفاوية والطحال إزالة الرسوم البيانية).
   1. إزالة الغدد الليمفاوية الإبطية التي هيوجدت بالقرب من الإبط (تحت الإبط) وراء عضلات الصدر من كل فأر.
   2. إزالة الغدد الليمفاوية العضدية التي تقع في الأنسجة الضامة التي تقع بالقرب من بعضها الإبطين.
   3. إزالة الغدد الليمفاوية العنقية سطحية وجدت في عنق كل فأر.
   4. إزالة الغدد الليمفاوية الأربية التي تقع في منطقة الورك في بالاشتراك في الأوعية الدموية 3.
   5. للوصول إلى الغدد الليمفاوية المساريقي، وقطع من خلال بطانة البريتوني حتى خط الوسط بطني. تم العثور على الغدد الليمفاوية المساريقي في النسيج الضام الذي يحمل الأمعاء معا. وجدوا عموما في سلسلة من 4-8 العقد، ويمكن أن تبدو وكأنها "سلسلة من اللآلئ". تأكد من سحب السلسلة بأكملها.
   6. يقع الطحال في منطقة البطن، خلف المعدة والأمعاء. إزالته عن طريق سحب وفصلها من البنكرياس.
7. طحن الأجهزة تحت غطاء العقيمة باستخدام 2 شرائح المجهر بلوري. وضع الغدد الليمفاوية أو الطحال علىالجانب بلوري واحد شريحة المجهر، وفرك مع الجانب متجمد من الشريحة الثانية حتى تفككت. تكرار حتى يتم وقف جميع الغدد الليمفاوية والطحال.

ملاحظة: من المستحسن أن تبدأ مع الغدد الليمفاوية وتنتهي مع الطحال، والدم سوف تجعل من الصعب أن نرى الغدد الليمفاوية المتبقية في المخزن المؤقت autoMACs.

9. لتصفية أجهزة الأرض في تعليق خلية واحدة، تبدأ من خلال للطي على قطعة من 40 ميكرومتر النايلون المواد عدة مرات، ووضع في أعلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي. يجب أن تكون مادة النايلون تقريبا 3 × 3 بوصة
10. استخدام حقنة 5 مل و 21 إبرة G لنضح 5 مل من autoMACs تشغيل العازلة وأجهزة الأرض. الاستغناء ببطء في مادة النايلون مطوية. الحرص على تجنب ثقب المواد مع الإبرة.

وبمجرد تحقيق تعليق خلية واحدة، يجب أن يظهر الحل كما شاحب، حل يتسق مع عدم وجود visib: ملاحظةلو قطع من الأنسجة الصلبة. إذا بقيت المواد الصلبة، وإعادة نضح والاستغناء من خلال قطعة مطوية جديدة من النايلون وضعت في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة.

11. دائما حفاظ على الخلايا على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.

5. فصل الخلايا

1. لأفضل النتائج، يجب الحصول على الأقل CD4 محض 80٪ + السكان خلايا CD25 من خلال autoMACS برو فاصل خلية باستخدام MACS CD4 + CD25 + T التنظيمية العزلة الخلية عدة، الماوس. يتم الحصول على بروتوكول للاحتفاظ السلبية من السكان خلايا CD4 + CD25 من خلال بيوتيك Miltenyi.

6. TH17 التمايز

1. جمع السكان CD25 خلايا CD4 + بعد الانفصال مع autoMACS برو فاصل الخلية.
2. عد الخلايا المخفف في نسبة 1:1000 مع الأزرق التريبان باستخدام عدادة الكريات.
3. مرة واحدة وقد تم تحديد تركيز من عدد الخلايا، تمييع تعليق خلية إلى 1 × 10 ⁶ خلية / مل في الخلية سائل الإعلام والثقافة.
4. إخراج 96 لوحات جيدة مع لوحة ملزمة لمكافحة CD3 بعد 4 ساعة.
5. غسل الآبار مكافحة CD3 المغلفة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر 2 مرات.
   1. لغسل إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة لمكافحة CD3 الآبار المغلفة وإزالة PBS في حاوية النفايات.
6. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج iTh17 أو السيطرة تفعيل مزيج (انظر النقطة رقم 2) إلى الآبار في ثلاث نسخ.
7. إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر التي تم وضعها إما مزيج TH17 أو مزيج السيطرة التنشيط.
8. احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة على الأقل أو ما يصل إلى 5 أيام (TH17 التمايز يمكن الحصول عليها بعد 72 ساعة أو بعد 5 أيام.)
9. يمكن تقييم TH17 تمايز الخلايا عن طريق تلطيخ وتدفق cytometric التحليل، ELISA، أو QPCR

7. تنشيط الخلية (فقط بين الخلايا اللازمة لتلطيخ)

1. إزالة 96 لوحات جيدة من الحاضنات في نهاية إما 72 ساعة أو 5 أيام
   1. نذكر بأن TH17 التمايزلا يمكن أن يتحقق إما ن بعد 72 ساعة أو 5 أيام.
2. لكل حالة (على سبيل المثال التحكم التنشيط أو iTh17)، ونقل الخلايا التي هي في ثلاث نسخ في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. وقد تم حتى الآن تجميع الخلايا لشرط واحد في بئر واحدة من 24 لوحة الثقافة جيدا، بدلا من كونها في ثلاث نسخ في 96 U جيدا أسفل لوحة الثقافة.
3. الحجم الكلي للكل بئر في 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية هو الآن 600 ميكرولتر. رفع حجم كل بئر إلى 1 مل مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
4. إضافة سلطة النقد الفلسطينية (phorbol ميريستات خلات) (50 نانوغرام / مل)، ionomycin (1 ميكرومتر)، ومنتدى بواو الاسيوى (Brefeldin-A) (10 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر في البئر لوحة 24 خلية ثقافة في تركيزات المدرجة.
5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

8. تلطيخ الخلايا

1. الخلايا وصمة عار مع علامات خارج الخلية وبين الخلايا المطلوب لتحليل تدفق cytometric. للكشف عن وجود سو IL-17، ويتم تلطيخ الخلايا مع أجسام مضادة لمكافحة IL-17A. وتشمل علامات سطح الخلية أوصت CD4، CD8، وCD25.
   1. استخدام داخل الخلايا تلطيخ خلوى كاتب كيت ماوس من العلوم البيولوجية دينار بحريني لIL-17 بين الخلايا تلطيخ.
   2. لكل عينة، وخلايا بيليه، وإزالة طاف، وبيليه الخلية resuspend في 200 ميكرولتر FACS العازلة (2٪ FBS في برنامج تلفزيوني).
   3. نقل خلايا معلق إلى 96 خلية تدفق الخلوي لوحة.
   4. تدور أسفل الخلايا لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة وتجاهل طاف.
   5. إضافة 200 ميكرولتر العازلة PBS نظام مراقبة الأصول الميدانية، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة، وتجاهل طاف.
   6. خلايا resuspend في 100 ميكرولتر من FACS العازلة وتطبيق 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة خارج الخلية (أب) خليط (يتم خارج الخلية أب الخليط في المخزن FACS). احتضان لمدة 15 دقيقة في RT، مع تغطية احباط.
   7. كرر الخطوة 8.1.4.
   8. كرر الخطوة 8.1.5 2X.
   9. الخلايا resuspend في 100 ميكرولتر من BD Cytofix / Cytoperm العازلة. Incubأكل لمدة 20 دقيقة في RT، مع تغطية احباط.
   10. إضافة 100 ميكرولتر من 1X دينار بحريني بيرم / غسل العازلة، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1،200 دورة في الدقيقة، وتجاهل طاف. تكرار.
   11. إضافة 50 ميكرولتر من الخلايا أب الخليط. (يتم بين الخلايا أب الخليط في 1X دينار بحريني بيرم / غسل) احتضان لمدة 15 دقيقة في RT، مع تغطية احباط.
   12. كرر الخطوة 8.1.10.
   13. الخلايا resuspend في 200 ميكرولتر من تلطيخ العازلة دينار بحريني.
   14. وضع الخلايا معلق في التدفق الخلوي أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر تلطيخ العازلة دينار بحريني (الحجم النهائي هو 400 ميكرولتر).
   15. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى العينات جاهزة للقراءة.

9. تحليل تدفق Cytometric

1. بوابة السكان الخلية الحية.
2. من السكان الخلية الحية، البوابة على CD4 + CD8 السكان.
3. من CD4 + CD8 السكان، على بوابة IL-17A + السكان.
   1. استنادا إلى النتائج التجريبية السابقة لدينا، وسوف 100٪ من IL-17A + CD25 + يكون السكان.

* تم الحصول على إجمالي عدد الخلايا المطلقة بعد تجميع عينة يثلث
** تم تحديد العدد المطلق للCD4 + CD25 + IL-17A + الخلايا بضرب العدد الكلي للخلايا عن طريق نسبة بوابة الحي والنسبة المئوية لمجموع الخلايا التي تحمل علامات نسب محددة، CD4، CD25، وIL-17A، و يحددها التدفق الخلوي.

10. QPCR وELISA

1. الخلايا مكان لا تستخدم لتحليل تدفق cytometric في أنبوب 1.5 مل إيبندورف وأجهزة الطرد المركزي في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقيقة. سيتم استخدام الخلايا الموجودة في الخلية بيليه بعد الطرد المركزي لتحليل QPCR. تم إجراء التحليل باستخدام QPCR PTC-200 بلتيير cycler الحرارية (BIORAD).
2. جمع طاف من أنابيب طرد لELISAs. أجريت IL-17A ELISAs باستخدام زوج الأضداد TC11-18H10 (التقاط، وأنواع العدد 555068) وTC11-8H4 البيوتين (الكشف، وأنواع العدد 555067) تم شراؤها من العلوم البيولوجية دينار بحريني. IL-17A ELISA ستاتم الحصول عليها من ndards eBioscience (كتالوج عدد 14-8171-80).
3. بعد إزالة طاف، resuspend الخلايا المتبقية لاستخدامها في QPCR في 175 ميكرولتر العازلة RNA تحلل (استخدامها على الفور لاستخراج الحمض النووي الريبي، والتوليف [كدنا]، وQPCR، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق).
   1. الرجوع إلى الجدول الثاني لتسلسل التمهيدي لIL-17A والأكتين (مسك بيت الجينات)

هذا البروتوكول التمايز TH17 يبدأ مع إزالة الطحال والإبطين، العضدية، المساريقي، عنق الرحم، والغدد الليمفاوية الأربية. تمثيل من المواقع من كل يمكن العثور عليها في الشكلين 2 و 3. الأرقام 1 و 5 على حد سواء توفر تمثيل مرئي من الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول.

ويركز هذا البروتوكول TH17 على التمايز من السكان اللمفاويات CD4 + CD25-T. من المهم أن نلاحظ مدى كفاءة autoMACS برو فصل خلية يثري دينا CD4 + CD25 المطلوب السكان من العقدة الليمفاوية والطحال مجموع المجمعة (الشكل 4). كانت ملطخة، العقدة الليمفاوية وغير المجزأ المجمعة splenocytes، والكسور autoMACS فصل مع antiCD4 وantiCD25 الأجسام المضادة تليها تحليل تدفق cytometric (الشكل 4). ويبين الشكل 4A لمحة ممثل نسبة CD4 + CD25 +وCD4 + CD25 الخلايا اللمفية الموجودة في غير المجزأ، والعقد اللمفاوية والطحال المجمعة من قبل التدفق الخلوي. يوفر الإجراء العزلة أيضا المخصب السكان CD4 + CD25 + Treg من C57BL / 6 الفئران التي يمكن استخدامها في تجارب إضافية (الشكل 4B). ويبين الشكل 4C لدينا تخصيب الخلية المطلوبة التي يبلغ عدد سكانها الذي هو 84٪ CD4 + CD25-T الخلايا، مع أن الغالبية العظمى من CD4 + CD25 + Tregs إزالتها. لدينا باستمرار السكان الخلية غير اللمفاوية الصغيرة التي هي موجودة في CD4 + CD25 المخصب، لكن هل لا تتداخل مع عملية التمايز (الشكل 4C). يساعد دينا المخصب السكان خلايا CD4 + CD25-T لتأمين TH17 التمايز أكثر نجاحا.

ويبين الشكل 5 تخطيطي لدينا TH17 الإجراء التمايز. لدينا المخصب CD4 + CD25 السكان إما حضنت تحت ظروف التفريق TH17 (مكافحة CD3، ومكافحة CD28، IL-6، وTGF-β) أو التحكم (مكافحة CD3، ومكافحة CD28). يمكن أن ينظر إليه في الشكل 6 أنه في حين الحضانة من الخلايا الليمفاوية CD4 + CD25-T مع مكافحة CD3، ومكافحة CD28 لمدة 5 أيام أسفرت عن CD25 + الخلايا اللمفية تي، الحضانة تحت TH17 ظروف حمل أسفرت عن مجموعة فرعية من IL17 إنتاج CD4 + CD25 + الخلايا الليمفاوية. يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على أمثلة من CD4 + CD25 + IL-17A + غلة عدد الخلايا المطلقة بعد 5 أيام الحضانة في ظل ظروف iTh17.

يمكن كذلك أن تقيم TH17 حالة التمايز من خلال PCR الكمي وELISA. الشكل 7 يعرض البيانات من التخصيب الخلايا اللمفية CD4 + CD25-T حضنت تحت السيطرة أو شروط TH17 الذي يحفز. اللمفاويات CD4 + CD25-T المحتضنة في ظل ظروف TH17 يصل تنظيم IL17A، والتي يمكن التحقق منها من خلال QPCR (الشكل 7A) وELISA (الشكل 7B). وupregulated النسخ عامل TH17 محددة RORγT أيضا من قبل خلايا CD4 + CD25-T المحتضنة في ظل ظروف TH17 الذي يحفز، ويمكن التأكد عبتيOUGH QPCR (الشكل 7A).

الشكل 1. TH17 التمايز التخطيطي. 1. الآبار معطف من U-96 لوحة القاع جيدا مع مكافحة CD3 (10 ميكروغرام / مل) المخفف في برنامج تلفزيوني. 2. لوحة في مكان حاضنة لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. بينما لوحة ويحتضنها، تشريح الغدد الليمفاوية (LN) والطحال من الماوس. طحن أجهزة وتصفية للحصول على تعليق خلية واحدة. عزل خلايا CD4 + CD25-T باستخدام CD4 + CD25 + T التنظيمية عزل الخلايا كيت وMiltenyi autoMACS برو فاصل. يجب تخفيفه CD4 + الخلايا CD25 إلى 1 × 10 6 خلية / مل. 3. مرة واحدة 4 ساعة حضانة لوحة جيدا 96 كاملة، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيد) 3X. 4. إضافة 100 ميكرولتر CD4 + خلايا CD25-T لوحة متجهة الى (PB) مكافحة CD3 المغلفة الآبار. 5. إضافة 100 ميكرولتر مكافحة CD28 أو 100 ميكرولتر iTh17 مدونة قواعد السلوك ktail (antiCD28، TGF-β، وIL-6). 6. احتضان لوحة لمدة 3 أو 5 أيام في 37 درجة مئوية. التالية الحضانة تقييم التمايز عن طريق تلطيخ الخلايا، QPCR، و / أو ELISA.

الشكل 2. LN دليل تشريح. أ) العقدة الليمفاوية 1 العضدية يمكن العثور عليها في النسيج الضام تقع بالقرب من بعضها الإبط (تحت الإبط) من الفأرة. B) العقدة الليمفاوية الإبطية 1 يمكن العثور عليها في كل الإبطين، وراء عضلات الصدر. C) تقع الغدد الليمفاوية المساريقي في النسيج الضام للأمعاء. أنها تشبه سلسلة من اللآلئ. D) ​​تم العثور على 4 الغدد الليمفاوية العنقية سطحية في الرقبة من الفأرة. E) 2 الغدد الليمفاوية الأربية (1 على كل جانب) يمكن أن يكون موجودا في منطقة الورك في الموقع حيث يلتقي 3 الأوعية الدموية .

. في صفحة = "دائما">
الرقم 3. الطحال دليل تشريح. تم العثور على الطحال الماوس على الجانب الأيسر من الجسم خلف المعدة والأمعاء. ببساطة عن طريق سحب وإزالة فصل مع ملقط.

الشكل 4. كانت ملطخة الكسور خلية من LN المجمعة وخلايا الطحال قبل وبعد autoMACS برو خلايا الانفصال. A) LN والطحال، فيفو السابقين، لإنشاء خط الأساس السكان الخلية قبل الانفصال. كانت ملطخة بعد الانفصال، CD4 + CD25 + (B) وCD4 + CD25-(C) الكسور لتقييم نقاء CD4 + CD25 + CD25 + CD4 و-T السكان اللمفاويات، على التوالي. كانت ملطخة جميع العينات مع CD4 + CD25 + والأجسام المضادة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي.

الرقم 6. TH17 التمايز المقررة من قبل التدفق الخلوي. وحضنت CD4 + CD25-T الخلايا الليمفاوية في وجود ربط لوحة مكافحة CD3، ومكافحة CD28، IL-6، وTGF-β (iTh17) أو لوحة متجهة الى مكافحة CD3 ومكافحة CD28 وحدها (السيطرة) 5 أيام. ثم تم تنشيط الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد التنشيط، كانت ملطخة الخلايا مع مكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD25، والأجسام المضادة للIL-17A لتحليل تدفق cytometric لتقييم TH17 التمايز. iTh17 = TH17 حمل جonditions.

الرقم 7. تم فرز TH17 التمايز المقررة من قبل QPCR وELISA. الخلايا اللمفاوية من C57BL / 6 الفئران وحضنت الخلايا CD4 + CD25-T بحضور مكافحة CD3 (10 ميكروغرام / مل) ملزمة لوحة، ومكافحة CD28 (1.5 ميكروغرام / مل )، IL-6 (20 نانوغرام / مل)، وTGF-β (5 نانوغرام / مل) أو لوحة متجهة الى مكافحة CD3 ومكافحة CD28 وحدها (التحكم) لمدة 5 أيام. A) خلايا ثم تم حصادها لتقييم RORγT تم حصادها وIL-17A رسالة عبر التعبير QPCR. B) Supernatants لتقييم IL-17A البروتين التعبير عن طريق ELISA.

لا الإفصاحات لتعلن.