مع وظائف المستجيب متميزة عن غيرها فرعية الخلايا التائية والخلايا TH17 قد تورطت مركزيا في المناعة الذاتية للالتهابات. يوفر هذا البروتوكول في المختبر TH17 التمايز وسيلة لتحديد ما إذا كان من السذاجة اللمفاويات CD4 + T يمكن أن تفرق في خلايا TH17، ومواصلة دراسة دورها في المناعة الذاتية والاستجابة المضيف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا TH17 هي مجموعة فرعية متميزة من الخلايا T التي تم العثور عليها لإنتاج انترلوكين 17 (IL-17)، وتختلف في وظيفة عن غيرها من مجموعات فرعية الخلايا التائية بما في ذلك الاستجابة Th1، الاستجابة Th2، والخلايا التائية التنظيمية. ظهرت الخلايا TH17 باعتباره الجاني المركزية في الاستجابات المناعية الالتهابية المرتبطة مماحكة مع العديد من اضطرابات المناعة الذاتية. في هذه الطريقة نحن تنقية الخلايا اللمفية تي من الطحال والغدد الليمفاوية من C57BL / 6 الفئران، وتحفيز خلايا CD4 + T المنقى تحت السيطرة والبيئات TH17 الذي يحفز. وتشمل البيئة الذي يحفز TH17 التحفيز في وجود مكافحة CD3 ومكافحة CD28 الأجسام المضادة، IL-6، وTGF-β. بعد حضانة لمدة 72 ساعة على الأقل ومدة تصل إلى خمسة أيام عند 37 درجة مئوية، ويتم تحليل الخلايا بعد ذلك لديها القدرة على إنتاج IL-17 من خلال التدفق الخلوي، QPCR، وELISAs. TH17 متباينة CD4 + CD25-T الخلايا يمكن استخدامها لمزيد من إلقاء الضوء على الدور الذي تلعبه الخلايا TH17 في ظهور وتطور المناعة الذاتية والمضيف ديقمم تهدف. علاوة على ذلك، يمكن TH17 التفريق بين CD4 + CD25 الخلايا اللمفية من نماذج متميزة خروج المغلوب / مرض الفئران تسهم في فهمنا للمصير الخلية اللدونة.
المقدمة
CD4 + T الليمفاوية (خلايا تي) تلعب دورا حاسما في الدفاع المناعي بوساطة نظام ضد الكائنات الدقيقة المعدية. على العكس، كما يرتبط ارتباطا وثيقا مع خلايا T ظهور وتطور أمراض المناعة الذاتية مثل مرض السكري من النوع 1، الذئبة الحمامية، والتهاب المفاصل الروماتويدي. CD4 + الخلايا اللمفية تي تصبح تفعيلها من خلال مجموعة من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) التفاعل مع مستضد وما شابه ذلك / مجمع التوافق النسيجي الرئيسي الثاني (MHCII) جزيئات، والتفاعلات مستقبلات CD28 مع B7.1/B7.2 بروابط 15. بالإضافة إلى توفير التحفيز TCR وCD28 شارك في التحفيز، والخلايا العارضة للمستضد أيضا توفير بيئة خلوى، والذي يحدد الدولة تمايز تي اللمفاويات، وبالتال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع استخدام الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام.
1. إعداد خلطات وسائل الإعلام
- العقيمة PBS درجة الحموضة: 7.3 (1 L)
ز 0.23 ناه 2 ص 4
1.15 ز نا 2 هبو 4
9.0 غرام كلوريد الصوديوم
يستغرق حجم بالماء DI. تعقيم الأوتوكلاف مع. - خلية الإعلام الثقافة (100 مل)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول التمايز TH17 يبدأ مع إزالة الطحال والإبطين، العضدية، المساريقي، عنق الرحم، والغدد الليمفاوية الأربية. تمثيل من المواقع من كل يمكن العثور عليها في الشكلين 2 و 3. الأرقام 1 و 5 على حد سواء توفر تمثيل مرئي من الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول.
ويركز هذا البروتوكول TH17 على التمايز من السكان اللمفاويات CD4 + CD25-T. من المهم أن نلاحظ مدى كفاءة autoMA.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا وصفناها بروتوكول لتحقيق التمايز في المختبر TH17. دراسة TH17 التمايز هو المهم، وتمايز الخلايا اللمفية تي في فرعية TH17 أمر بالغ الأهمية من أجل القضاء الفعال لمسببات الأمراض البشرية 13. على العكس، ارتبط إنتاج IL17 مع تطور المرض المناعة الذاتية 13. طريقة TH17 التمايز ينطبق على العديد من إعدادات البحث كما يمكن تطبيقها على العديد من نماذج الفئران متميزة من التنظيم المناعي والمناعة الذاتية. يساعد هذا الأسلوب للرد على أسئلة بشأن قدرة الخلايا اللمفية تي،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا الإفصاحات لتعلن.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة / NCATS جوائز العلوم السريرية وبالحركة لجامعة فلوريدا TL1 TR000066 وUL1 TR000064، ملحق التنوع من الأصل غرانت R01AI056152 من المعهد الوطني للصحة، منحة كاشف العلوم البيولوجية دينار بحريني، وجامعة من ولاية فلوريدا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>كاشف / مادة< قوي> | |||
| معقم بوليسترن بتري طبق | فيشر علمي | 0875713A | 60 مم × 15 مم |
| autoMACS تشغيل العازلة | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| شرائح مجهر متجمد ، فروستيد | فيشر Scientific | 12-544-3 | 3 "× 1" 1 مم |
| 5 مل 21G1 حقنة وإبرة خالية من اللاتكس | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 مل أنابيب الطرد المركزي | سيجما ألدريتش | CLS430791 | |
| نايلون 40 ميكرون | ميامي تربية الأحياء المائية | نايلون 40/26 | |
| لوحة زراعة الأنسجة الدقيقة 96 بئر U القاع | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 ألواح زراعة خلايا البئر | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| أنابيب إيبندورف 1.5 مل | فيشر ساينتفيك | 05-408-129 | |
| منقى NA / LE هامستر مضاد للفأر CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| منقى NA / LE هامستر مضاد للفأر CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| ماوس IL-6 بروتين مؤتلف | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R & D Systems | 240-B-002 | |
| محلول تريبان الأزرق 0.4٪ | سيجما ألدريتش | 66H2364 | |
| باك بلو رات مضاد للفأر CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC الفئران المضادة للفأر CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE المترافق المضاد للفأر CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-Mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| مجموعة بادئ تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا- Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) MACS | |
| CD4 + CD25 + مجموعة عزل الخلايا التائية التنظيمية ، الماوس | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning ، Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt & # 8211 ؛ ثانول | MP 194834 الطبية الحيوية | الخطرة | |
| فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) ملح | |||
| الكالسيوم Ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| Brefeldin A الخطير (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A معيار | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB مجموعة كاشف الركيزة | BD Biosciences | 555214 | |
| <قوي> معدات < / قوي> | |||
| autoMACS Pro فاصل الخلايا | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT + الطرد المركزي | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 حاضنة | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
المراجع
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
